鐘誠 孫國棟 范全 楊東亮 梁偉喬 賈海升 李宇明

1.暨南大學附屬江門中醫(yī)院骨科,廣東 江門 529000 2.暨南大學附屬第一醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510632 3.中山大學附屬江門醫(yī)院骨科,廣東 江門 529000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)為常見疾病之一，該病以骨量減少、骨組織微結構退化為主要特征，導致骨脆性增加的一種骨骼疾病[1]。近年來的臨床研究已證實，OP需長期服用藥物，單一藥物利用率低。為此，我們將藥物與生物材料復合使用，這些生物材料能穩(wěn)定血藥濃度、減少給藥頻率、提高效率，從而顯著提高療效。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBPs)已證實其具有多種作用并均可防治骨質疏松癥[2-6]。由于海藻酸鈣(calcium alginate，ALG-Ca)微球廉價易得、無毒，具有良好的生物相容性、降解性等優(yōu)勢，在藥物緩釋中受到極大的應用。本研究建立去卵巢小鼠骨質疏松模型，通過ALG-Ca/LBPs凝膠微球干預治療，觀察小鼠骨代謝生化指標、骨微結構的影響，探討其療效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及材料：健康9周齡雌性C57BL/6 J小鼠，體重(18.2±1.2)g(廣東省醫(yī)學實驗動物中心)，于暨南大學醫(yī)學部實驗動物房飼養(yǎng)；ALG-Ca凝膠微球、LBPs/ALG-Ca凝膠微球(暨南大學理工學院)；LBPs(西安開來生物工程有限公司，純度>70 %)。

1.1.2主要實驗設備：顯微手術器械(中國上海手術器械廠)；手術顯微鏡(德國Leica DM651)；全自動生化分析儀(日本 Olympus AU2700)；通風柜(中國科藝普)；冷凍切片機(德國Leica CM1950)；KD-H烘片機(中國 Kedee)；解剖體式顯微鏡(德國Leica S6E)；熒光倒置顯微鏡(德國Leica DM1000)；普通光學顯微鏡(日本Olympus)；Micro-CT儀(比利時Skyscan)；電子稱(美國Denver Instrument)；數碼相機(日本Canon EOS600D)；高壓直流電源(中國東文高壓電源天津有限公司)；掃描電子顯微鏡(日本Mitachi TM3030)。

1.1.3主要實驗試劑：明膠(美國Sigma)；三溴乙醇(中國Sigma)；叔戊醇(德國Sigma)；堿性磷酸酶(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；1型膠原羧基末端肽(ELISA)試劑盒(武漢云克隆科技有限公司)；海藻酸鈉(SODIUM alginate，ALG-Na)(美國Sigma)；氯化鈣(廣州化學試劑廠)；無水乙醇(天津天大化學試劑廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1ALG-Ca凝膠微球、ALG-Ca/LBPs凝膠微球的制備：稱取定量的ALG-Na固體、LBPs攪拌并溶解于離子水中，將混合液10 mL倒入50 mL的注射器中，針頭采用21G平頭針頭。稱取11.10 g的氯化鈣(CaCl2)溶解于1 000 mL去離子水中，制成0.1 mol/mL的CaCl2水溶液。在注射器針頭部位接上負載電壓，針頭為正極，通過微量注射泵以50 μL /min的速度緩慢推出溶液滴入到CaCl2水溶液凝膠化30 min，形成直徑1 mm左右的微球。過濾分離，最后用濾紙吸去微球表面水分，得到ALG-Ca凝膠微球或ALG-Ca/LBPs凝膠微球(LBPs濃度為40 %)，凝膠微球的pH值為7.16。冷凍、干燥后備用。

1.2.2C57BL/6 J小鼠骨質疏松模型的制備：所有SPF級C57BL/6 J雌性小鼠喂養(yǎng)至12周齡，平均體重(20.3±1.9)g。所有手術器械高溫消毒，按三溴乙醇混合物(13 μL /g)將小鼠完全麻醉后，選取背部手術區(qū)域予以備皮、消毒。于肋下1 cm切開皮膚，鈍性分離肌肉及腹膜，明膠海綿止血，在腸系膜脂肪中找到卵巢，完整切除雙側輸卵管及卵巢；假手術組只切除卵巢周圍等同質量的脂肪組織。常規(guī)預防術口感染，放回飼養(yǎng)籠中，注意保暖，所有小鼠均在監(jiān)視下蘇醒。

1.2.3實驗動物分組：將40只雌性C57BL/6 J小鼠隨機數字表法分為5組，每組8只，所有給藥方式均為灌胃(0.005 mL/g)，1次/d，藥物干預時間為12周。假手術組(Sham)，給予雙蒸水灌胃；模型組(OVX+PBS)，給予雙蒸水灌胃；單純ALG-Ca凝膠微球組(OVX+ALG-Ca)，給予濃度為37.5 mg/mL的ALG-Ca凝膠微球水溶液灌胃；單純LBPs組(OVX+LBPs)，給予濃度為25 mg/mL的LBPs水溶液灌胃；ALG-Ca/LBPs凝膠微球組(OVX+ALG-Ca/LBPs)，給予濃度為62.5 mg/mL的ALG-Ca/LBPs凝膠微球水溶液灌。

1.3 評價指標及方法

1.3.1骨組織HE染色檢測：小鼠處死后取左側完整股骨，置于4 %的多聚甲醛中固定。對股骨脫鈣及脫水處理，完成后將標本組織塊置于溶化的石蠟中充分包埋并凝固成塊，切片機切片，厚度約6 μm。用二甲苯脫蠟、水化，染色，封片，顯微鏡下觀察骨組織結構變化。

1.3.2骨代謝相關血清生化指標測定：給藥結束后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置，3 500 r/min離心5 min分離血清。按試劑盒說明書對小鼠血清骨鈣素(BGP)、血清堿性磷酸酶(BALP)和1型膠原羧基末端肽(CTX-1)進行檢測。

1.3.3骨形態(tài)計量學靜態(tài)指標測定：取小鼠右側股骨，去除周圍肌肉等軟組織，冷凍保存。Micro-CT儀掃描股骨遠端，檢測參數包括：骨體積分數(percent bone volume，BV/TV，%)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N，n/mm)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp，mm)和骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th，mm)。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數據結果采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理，均行正態(tài)性、方差齊性檢驗，運用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物數量分析

納入雌性C57BL/6 J小鼠40只，B組因麻醉意外死亡1只，用備用小鼠補充。進入結果分析小鼠共40只。

2.2 ALG-Ca/LBPs凝膠微球形態(tài)觀察

在掃描電鏡下觀察ALG-Ca/LBPs凝膠微球顯示，LBPs滯留在ALG-Ca凝膠微球，微球外觀球形度好，顆粒均勻，圓整度較高，見圖1。

圖1 海藻酸鈣結構圖Fig.1 The structure of calcium alginate

2.3 骨組織HE染色

光鏡下觀察發(fā)現，Sham組小鼠股骨干可見網狀樣骨小梁，排列規(guī)則有序、緊密，骨微結構完整。OVX+PBS、OVX+ALG-Ca組小鼠骨小梁變細、斷裂嚴重、結構稀疏。OVX+LBPs組小鼠可見骨小梁著色淡、部分斷裂、結構紊亂。OVX+ALG-Ca/LBPs組可見小鼠骨小梁增粗，排列基本呈現網狀，部分區(qū)域間隙增大，骨微結構形態(tài)較OVX+PBS、OVX+ALG-Ca組明顯改善，但與Sham組比較，骨微結構仍未恢復到正常，見圖2。

圖2 股骨病理形態(tài)學變化(HE，100*)Fig.2 Pathological changes of the femur (HE,100*)

2.4 骨代謝相關血清生化指標測定結果

OVX+PBS組血清BGP、BALP、CTX-1水平較其他組顯著升高，證明骨質疏松模型制備成功。OVX+ALG-Ca與OVX+PBS組比較，BGP、BALP、CTX-1水平升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與OVX+PBS組相比，OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs組血清BGP、ALP、CTX-I水平均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但以OVX+ALG-Ca/LBPs組更為顯著(P<0.01)，見圖3。

2.5 骨形態(tài)計量學靜態(tài)指標

小鼠右股骨Micro-CT三維重建圖可見，與Sham組相比，去勢后OVX+PBS組小鼠骨微結構明顯退化，骨小梁稀疏、變細，數量減少，骨小梁間距增大，骨密度明顯下降；與OVX+PBS組相比，OVX+LBPs組小鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th參數均升高，Tb.Sp降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與OVX+PBS組相比，OVX+ALG-Ca/LBPs組BV/TV、Tb.N、Tb.Th參數均升高，Tb.Sp降低，差異具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4、5。

注：OVX+PBS與Sham組比較，#P<0.05；除Sham外，所有組與OVX+PBS比較,*P<0.05、**P<0.01。圖3 骨代謝相關血清生化指標Fig.3 Serum biochemical indicators related to bone metabolism

注：OVX+PBS與Sham組比較，#P<0.05；除Sham組外，所有組與OVX+PBS比較，*P<0.05、**P<0.01。圖4 小鼠骨Micro-CT三維重建圖Fig.4 The three-dimensional reconstruction of mouse bone with micro-CT

3 討論

LBPs為枸杞的主要成分之一，多項研究表明LBPs含有抗骨質疏松、調節(jié)免疫力、延緩衰老等藥理作用[8-11]。如今，骨質疏松癥是威脅老年健康的常見疾病，臨床上久服抗骨質疏松藥物的不良反應不容忽視，比如胃腸道刺激問題和誘發(fā)潛在性惡性腫瘤等[12-13]。枸杞為上等的中藥材，取之方便，毒副作用小，其獨特藥理作用在抗骨質疏松研究中的作用明確。研究表明，LBPs對成年去勢雌性大鼠骨質疏松有明顯的改善作用，其機制可能與提高成年去勢雌性大鼠血清中的一氧化氮水平有關[2-3]。馬進峰等[4]研究顯示，LBPs可以有效降低骨質疏松大鼠骨膠原的代謝水平，抑制其骨代謝的高轉換狀態(tài)，從而對骨質疏松有一定調節(jié)作用。王小敏等[5]研究證明LBPs可以提高骨質疏松大鼠的骨密度及堿性磷酸酶活性，提升血鈣水平，表示LBPs能夠改善大鼠骨質疏松狀態(tài)。也有研究顯示服用枸杞葉及LBPs可以延緩去卵巢后的骨質丟失[6]。從文獻中看出，LBPs防治骨質疏松有明確的效果，但研究都不是很深入，這正是需要我們進一步挖掘。

LBPs直接口服具有吸收快、利用率低等缺點。我們將LBPs與生物載體材料復合使用，不僅可以保護LBPs，而且可以延長LBPs在胃腸道吸收時間，提高LBPs吸收率。ALG-Na來源廣泛，在藥物的控緩釋中已經有了廣泛的應用，ALG-Na結構中的古羅糖醛酸(G單元)能與Mg、Al等多種二、三價金屬離子形成螯合結構。本研究采用靜電懸滴法，以LBPs為藥物模型，將ALG-Na溶液通過微量注射泵滴加到鈣離子溶液的凝固浴中，形成直徑1 mm左右，具有良好的球形度和單分散性的ALG-Ca/LBPs凝膠微球。ALG-Ca凝膠微球具有生物相容性、可降解性等優(yōu)點，而且還有抑制炎癥、調節(jié)免疫力等功能[14-15]，在生物醫(yī)藥科研中顯得尤為突出，ALG-Ca凝膠微球對LBPs充分包埋，延長胃腸道吸收藥物的時間，穩(wěn)定血藥濃度，提高藥物利用率。

摘除卵巢后的小鼠隨著雌激素減少出現骨的形成與吸收失衡，骨微結構發(fā)生改變，從而造成骨質疏松。本實驗采用檢測骨代謝指標及骨微結構來推測ALG-Ca/LBPs對小鼠骨質疏松的療效。骨的病理形態(tài)學和骨形態(tài)計量學靜態(tài)是檢測骨微結構的兩個重要評價，是客觀直接反映骨質疏松組織形態(tài)狀況的指標。在骨組織HE染色中，OVX+PBS組小鼠摘除卵巢后，小鼠骨質丟失嚴重，骨微結構明顯改變，從而表現出骨小梁變薄，連續(xù)性中斷、間隙變大，出現骨質疏松狀態(tài)，證明小鼠骨質疏松模型制備成功，而OVX+ALG-Ca/LBPs組與OVX+PBS比較，骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，這點在Micro-CT結果中也得到證實。小鼠股骨Micro-CT結果顯示，OVX+PBS小鼠去勢后骨微結構破壞，骨密度下降，骨小梁稀疏，數量減少，小梁骨間距增大，與OVX組相比，骨質疏松嚴重。OVX+LBPs組與OVX+PBS組小鼠比較，BV/TV、Tb.N、Tb.Th參數均升高，Tb.Sp降低，差異具有統(tǒng)計學意義，表明骨質疏松狀態(tài)得到改善，其中OVX+ALG-Ca/LBPs組改善明顯，說明ALG-Ca/LBPs凝膠微球提高LBPs生物利用率，從而改善骨組織的形態(tài)結構來防治骨質疏松。當發(fā)生骨質疏松時破骨細胞活性增強，成骨細胞活性減弱，造成骨代謝出現負平衡。BGP是一種可以直接可以反映骨形成與重建的一種蛋白，BALP是顯示破骨細胞活性的良好指標，故骨質疏松下BGP及BALP的含量會顯著升高。實驗中OVX+PBS組的BGP及BALP均明顯升高，反映小鼠處于骨代謝負平衡狀態(tài)。與OVX+PBS組對比，OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs組BGP、BALP均有不同程度降低，提示LBPs可以抑制破骨細胞的活性，降低骨轉化率，使骨形成、重建加強。CTX-1是成熟型膠原降解時產生的一部分產物，也是骨中唯一的膠原成分，常用來診斷代謝骨病及評價抗骨病藥物的療效。實驗結果顯示OVX+LBPs、OVX+ALG-Ca/LBPs均能降低小鼠的血清CTX-1水平，以OVX+ALG-Ca/LBPs組降低明顯，說明ALG-Ca/LBPs凝膠微球能產生抑制骨吸收的效果，從而改善骨質疏松狀態(tài)。其中ALG-Ca凝膠微球起到良好的藥物載體作用，延緩藥物在胃腸道的時間，穩(wěn)定血藥濃度，進而提高藥效。

本研究發(fā)現，ALG-Ca/LBPs可以降低骨吸收指標，改善骨的微觀結構、從而對去勢小鼠骨質疏松起到防治作用?？上嶒炛蠥LG-Ca/LBPs凝膠微球對于改善小鼠骨質疏松的具體機制尚不能完全明確，可能與LBPs抗氧化、免疫調節(jié)等有關，這也有待我們以后研究中進一步發(fā)現，但是ALG-Ca/LBPs凝膠微球在防治骨質疏松中或許是一個新突破點。