李蕊 李琳 田懌淼 朱如愿 陳貝貝 張浩 夏兵可 張東偉* 王麗麗

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

老年性骨質(zhì)疏松 (senile osteoporosis，SOP) 是一種隨著年齡增加誘發(fā)的骨代謝性疾病[1]，其主要病因是骨吸收大于骨形成而誘發(fā)的骨強度下降、骨脆性增加和骨質(zhì)量降低，具有高致殘率和高死亡率的特點。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在2010年至2016年間，中國30個省自治區(qū) SOP患病率已達36 %[2]。據(jù)全國第六次人口普查數(shù)據(jù)顯示，截至2010年，我國高于60周歲的老年人口已達到全國總?cè)丝诘?3.26 %。隨著社會人口老齡化趨勢加劇，SOP的發(fā)病率也逐年增高，已嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。目前臨床上用于治療SOP的藥物主要有雙膦酸鹽、維生素D和補充鈣劑等，然而這些藥物可能會帶來消化道反應(yīng)、血管疾病風(fēng)險增加等不良反應(yīng)。因此，臨床亟需研發(fā)更有效和更安全的抗SOP藥物。近年來，中藥在抗骨質(zhì)疏松方面的顯著療效已逐漸引起研究者的興趣，也被臨床患者認可和接受[3]。

SIRT6是sirtuin (SIRT1-SIRT7) 家族中的一種NAD+依賴性組蛋白去乙?；?，其通過調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性微環(huán)境對SOP患者發(fā)揮骨保護作用[4-5]。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)SIRT6敲除小鼠骨吸收作用增強，骨形成作用下降，其骨量明顯降低。而SIRT6過表達可以降低NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，通過延緩軟骨細胞的衰老，進而抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[7]。此外，隨著年齡增長，體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累可導(dǎo)致SIRT6表達下降[8]，進而激活NF-κB/cathepsin K信號通路，從而誘發(fā)骨質(zhì)量的下降。因此，改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)節(jié)SIRT6的表達，可能是SOP防治的新策略之一。

BZBS是由菟絲子、枸杞子、肉蓯蓉等中藥組成，具有補腎溫陽的功效。中醫(yī)將SOP納入“骨痿”、“骨枯”范疇，其病因為精髓不足，腎虛失養(yǎng)[9]。BZBS中菟絲子、蛇床子等可溫補腎陽，枸杞子、五味子等滋補腎陰，從而達到補腎健骨的目的，這提示該復(fù)方可能具有抗骨質(zhì)疏松的作用。研究[10]表明，BZBS可以上調(diào)去勢大鼠雄激素水平，臨床上也常被用于治療腰膝酸軟等腎陽虛癥狀，但其對SOP的骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)是否具有調(diào)節(jié)作用目前尚無相關(guān)研究。因此，本研究擬D-gal和NaNO2誘導(dǎo)的衰老小鼠為研究對象，觀察BZBS的骨保護作用，以及探討這種作用的潛在機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器：PerkinElmer Quantum GX-micro-CT小動物活體斷層掃描儀(Perkin Elmer公司，美國)；Olympus BX53倒置熒光顯微鏡(Olympus有限公司，日本)；FLUO star Omega多功能酶標儀(BMG Labtech 公司，德國)；Leica EG 1150 H包埋機、EG1150 C冰凍機、RM 2 255輪轉(zhuǎn)式切片機(Leica Biosystem 有限公司，德國)；博勒飛質(zhì)構(gòu)儀CT3(BRROKFIELD公司，美國)；傅里葉紅外光譜儀(Perkin Elmer公司，美國)。

1.1.2藥物與試劑：BZBS由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，批號：130201。D-gal(G0750)和NaNO2(31443)購自美國Sigma-Aldrich公司；骨組織抗原修復(fù)液(SBT10013)購自上海舜百生物科技有限公司；總抗氧化能力 (T-AOC)、超氧化物歧化酶 (SOD)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽 (GSH) 和還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 測定檢測試劑盒均購自江蘇南京建成生物工程研究所；Sirt6(ab62739)、NF-κB Lys310(ab16502)和cathepsin K(ab19027)抗體購自美國Abcam公司；兔二步法試劑盒和DAB顯色液購自中杉金橋生物科技有限公司；蘇木精和伊紅染液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3實驗動物：SPF級ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(20 ± 2)g，購于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2017-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心清潔級動物實驗室，合格證號：SYXK(京)2017-0038，室溫恒溫(22 ± 1)℃，相對濕度(50 ± 5) %，光暗循環(huán)周期12 h/12 h。實驗期間，各組動物自由飲水和攝食，并定期更換墊料和籠具。動物實驗方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1動物分組及藥物處理：ICR雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、維生素E(VE)組和BZBS組，每組10只。根據(jù)參考文獻[11]的方法：模型組、VE組和BZBS組小鼠腹腔注射D-gal[120 mg/(kg·d)]和NaNO2[90 mg/(kg·d)]，連續(xù)注射3個月，以造成衰老模型。正常組腹腔注射等體積的生理鹽水。并于造模第25天起，VE組和BZBS組小鼠分別給予VE [100 mg/(kg·d)]和BZBS溶液 [1.4 g/(kg·d)]，對照組和模型組小鼠灌胃給予等體積的0.1 % Tween 80，連續(xù)干預(yù)65 d。

1.2.2Micro-CT掃描：于給藥后第65天，取各組小鼠右側(cè)股骨，剔除附著的肌肉組織，根據(jù)文獻[12]提供的方法，使用PerkinElmer Quantum GX-micro-CT小動物活體斷層掃描儀分析掃描骨骺端上方0.5 cm處，并計算骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(TB.SP)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨表面積組織體積比(BS/TV)以及骨總表面積(Tt.Ar)結(jié)構(gòu)指數(shù)。

1.2.3骨生物力學(xué)和骨材料檢測：參照王麗麗等[13]提供的方法，利用質(zhì)構(gòu)儀對右側(cè)股骨進行三點彎曲實驗，以測定骨生物力學(xué)性能，分析計算出彈性模量、極限載荷以及最大應(yīng)力等骨生物力學(xué)參數(shù)。

參照Liu等[14]的方法，利用傅里葉紅外光譜分析儀分析上述實驗后小鼠的右側(cè)股骨的骨材料特性，并計算各組股骨的膠原成熟度、結(jié)晶度、酸性磷酸鹽取代和礦物質(zhì)含量。

1.2.4氧化應(yīng)激指標測定：腹主動脈取血，靜置30 min，3 500 r/min離心 15 min，吸取上層血清，然后按照試劑盒相應(yīng)的說明書測定T-AOC、SOD、MDA GSH和GSH/GSSG的水平。

1.2.5免疫組織化學(xué)(IHC)染色：將股骨石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，依次用骨組織抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，用3 %的過氧化物酶阻斷劑室溫孵育30 min，然后用10 %的山羊血清封閉30 min，分別滴加SIRT6 (1∶200)、NF-κB (Lys310) (1∶100) 以及cathepsin K (1∶100)，4 ℃孵育過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，DAB避光顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于顯微鏡下觀察、拍照。每組選取股骨切片中7 個互不重疊的視野，采用Image Pro Plus6.0軟件進行分析統(tǒng)計，測定陽性細胞的累計吸光值，即為蛋白陽性表達的強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BZBS能抑制衰老小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的破壞

Micro-CT結(jié)果顯示(圖1)，與正常組相比，模型組小鼠股骨的Tb.N、Tb.Th、BV/TV、BS/TV、Tt.Ar明顯降低(P<0.05)，TB.SP明顯升高(P<0.05)，說明D-gal和NaNO2誘導(dǎo)的衰老小鼠骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞；與模型組相比，VE組和BZBS組的小鼠，其Tb.N、Tb.Th、BV/TV、BS/TV、Tt.Ar顯著升高(P<0.05)，TB.SP顯著下降(P<0.05)。這說明BZBS能改善D-gal和NaNO2誘導(dǎo)的衰老小鼠的骨微結(jié)構(gòu)，從而提高其骨質(zhì)量。

圖1 八子補腎膠囊對衰老小鼠的骨微結(jié)構(gòu)指標的影響Fig.1 Effect of Bazi Bushen capsules on bone microstructure in aged mice

2.2 BZBS能提高衰老小鼠骨強度和改善骨材料構(gòu)成

骨生物力學(xué)參數(shù)檢測結(jié)果顯示(圖2)，與正常組相比，模型組小鼠的彈性模量、極限載荷、最大應(yīng)力明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，VE組和BZBS組的小鼠，其骨生物力學(xué)相關(guān)指標顯著升高(P<0.05)。這說明BZBS能抑制D-gal和NaNO2誘導(dǎo)的衰老小鼠骨強度下降。

圖2 八子補腎膠囊對衰老小鼠的骨強度影響Fig.2 Effect of Bazi Bushen capsules on bone strength in aged mice

各組小鼠的股骨材料成分變化分析結(jié)果顯示(表1)，與正常組相比，模型組小鼠的膠原成熟度和結(jié)晶度明顯升高(P<0.05)，礦物質(zhì)含量和酸性磷酸鹽取代明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，VE組和BZBS組小鼠的膠原成熟度和結(jié)晶度降低(P<0.05)，礦物質(zhì)含量和酸性磷酸鹽取代顯著升高。這說明BZBS能夠通過調(diào)節(jié)骨材料成分的構(gòu)成而改善衰老小鼠的骨質(zhì)量。

表1 八子補腎膠囊對衰老小鼠的骨材料特性的影響Table 1 Effect of Bazi Bushen capsules on the bone material properties in aged mice

2.3 BZBS能改善衰老小鼠股骨的病理微結(jié)構(gòu)

股骨組織HE染色顯示(圖3)，正常組小鼠骨組織的骨顯微結(jié)構(gòu)完整，網(wǎng)狀排列整齊。與正常組相比，模型組小鼠骨小梁變細、斷裂，結(jié)構(gòu)稍紊亂；與模型組小鼠相比，VE組和BZBS組小鼠的骨組織結(jié)構(gòu)有明顯改善，骨小梁增粗，排列相對整齊，但尚未恢復(fù)至對照組骨微結(jié)構(gòu)的形態(tài)。這說明BZBS能明顯改善D-gal和NaNO2誘發(fā)的衰老小鼠骨顯微結(jié)構(gòu)。

圖3 八子補腎膠囊對衰老小鼠的骨組織病理微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of Bazi Bushen capsules on the microarchitecture of bone tissue in aged mice

2.4 BZBS能促進衰老小鼠體內(nèi)氧化還原的平衡

各組小鼠血清中氧化應(yīng)激指標檢測結(jié)果顯示(表2)，與正常組相比，模型組小鼠的MDA水平明顯升高(P<0.05)，T-AOC、SOD、GSH和GSH/GSSG明顯低于正常組(P<0.05)；與模型組相比，VE和BZBS組小鼠，其體內(nèi)的MDA水平明顯下降(P<0.05)，T-AOC、SOD、GSH和GSH/GSSG 水平明顯升高(P<0.05)。這說明BZBS能調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原平衡，改善衰老小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

表2 八子補腎膠囊對衰老小鼠血清中氧化應(yīng)激水平的影響Table 2 Effect of Bazi Bushen capsules on serum oxidative stress level in aged mice

2.5 BZBS對衰老小鼠骨組織的影響

BZBS能提高衰老小鼠骨組織中SIRT6表達，抑制NF-κB(Lys310)和cathepsin K的表達。

免疫組化結(jié)果顯示(圖4)，與正常組相比，衰老模型小鼠骨組織中SIRT6的表達明顯降低，NF-κB的乙?；胶蚦athepsin K水平明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，BZBS組小鼠骨組織中SIRT6顯著升高(P<0.05)，而乙?；腘F-κB和cathepsin K的表達明顯下降(P<0.05)。這說明BZBS可能通過上調(diào)SIRT6，抑制NF-κB和cathepsin K蛋白的表達，進而抑制骨吸收作用，從而提高衰老小鼠的骨質(zhì)量。

圖4 八子補腎膠囊對衰老小鼠骨組織中SIRT6、NF-κB 和cathepsin K蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Bazi Bushen capsules on the expression of SIRT6,NF-κB,and cathepsin K protein in bone tissue of aged

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，BZBS能明顯抑制衰老小鼠骨微結(jié)構(gòu)的破壞和骨強度的下降，改善骨材料構(gòu)成，提高血清中的T-AOC、SOD和GSH水平，降低MDA水平，進而恢復(fù)氧化還原平衡狀態(tài)，升高SIRT6表達水平，抑制NF-κB/cathepsin K的蛋白表達，從而改善衰老小鼠的骨質(zhì)量。

BZBS 由菟絲子、枸杞子、五味子、蛇床子、金櫻子、覆盆子、韭菜子、川楝子、淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉、地黃、川牛膝、人參、鹿茸、海馬等組成。本研究通過micro-CT、HE染色、FTIR和三點彎曲實驗檢測，發(fā)現(xiàn)BZBS對骨量、骨微結(jié)構(gòu)、骨材料特性和骨強度有明顯的改善作用。其他團隊研究也表明，菟絲子[16]能提高去卵巢大鼠的骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀；枸杞子[17]有改善骨微結(jié)構(gòu)的作用；蛇床子[18]能夠調(diào)節(jié)去卵巢大鼠雌激素分泌從而有一定的防治骨質(zhì)疏松作用，淫羊藿、巴戟天和地黃均有相關(guān)實驗證明對骨質(zhì)疏松模型大鼠有改善骨質(zhì)量的作用[19-21]。這提示，這些藥物可能是BZBS發(fā)揮骨保護作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

ROS的積累是衰老相關(guān)組織退化的一種潛在機制，年齡相關(guān)或者卵巢切除的骨量丟失小鼠體內(nèi)常表現(xiàn)升高的氧化應(yīng)激水平[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，BZBS能明顯降低MDA水平，升高T-AOC、SOD、GSH/GSSG水平，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，提示BZBS具有抗氧化作用。吳石磊[24]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿對NOX4介導(dǎo)的ROS有明顯的抑制作用，對成骨細胞的增殖活力有明顯的保護作用；張秀麗[25]也發(fā)現(xiàn)地黃的主要成分梓醇可以提高內(nèi)源性抗氧化酶活力，降低MDA含量，從而對D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠有保護作用。以上研究結(jié)果提示，BZBS對衰老小鼠有骨保護作用，可能與改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

衰老小鼠體內(nèi)的ROS的積累導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而激活NF-κB的核轉(zhuǎn)移和乙?；约癱athepsin K高表達[26]，導(dǎo)致SOP的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，衰老小鼠骨組織中的SIRT6表達水平下降，NF-κB乙?；蚦athepsin K的表達水平較正常組均明顯升高，這說明D-gal和NaNO2誘導(dǎo)的衰老小鼠的骨吸收作用增強。BZBS干預(yù)衰老小鼠65 d后，其能明顯提高骨組織中SIRT6的水平，抑制NF-κB乙酰化和cathepsin K的表達，從而抑制骨量丟失。陳洋等[27]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷通過上調(diào)SIRT6酶抑制NF-κB蛋白表達而延緩衰老相關(guān)病變；王凱[28]研究發(fā)現(xiàn)與BZBS組成相似的益腎膠囊可以通過SIRT6抑制NF-κB水平。以上研究結(jié)果表明，BZBS可能是通過上調(diào)SIRT6，抑制NF-κB/cathepsin K信號通路從而降低骨吸收作用有關(guān)。

綜上所述，本研究表明BZBS能夠明顯改善衰老小鼠的骨強度和骨微結(jié)構(gòu)，其發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用機制之一可能是通過恢復(fù)體內(nèi)氧化還原平衡，進而上調(diào)SIRT6，降低NF-κB乙?；剑档蚦athepsin K的表達，從而改善骨質(zhì)量。本研究為BZBS抗骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)，也為防治SOP提供了新思路。