劉克舜，姜 維，胡 娜，于嬌妍，張 琰，鄭 瑾

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710038；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，西安 710038)

瘡毒即瘡瘍腫毒，中醫(yī)學(xué)理論認為瘡毒-急性皮下炎癥多為風(fēng)濕熱證，其治療宜祛風(fēng)止癢、清熱燥濕。中藥防風(fēng)和白芷是皮膚科治療瘡瘍腫毒的常用配伍藥材，防風(fēng)具有止癢、止痙、勝濕止痛和祛風(fēng)解表的功效[1]；現(xiàn)代藥理研究表明，防風(fēng)有明顯的抗血小板聚集、延長凝血酶原時間、降低血漿黏度和抗炎的作用[2]。白芷祛風(fēng)止癢止痛、燥濕消腫排膿、解表散寒，可用于風(fēng)濕瘙癢和瘡瘍腫毒等癥[3]；白芷香豆素具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗凝血和降血壓等多種藥理活性[4]，其中歐前胡素和異歐前胡素在治療血管疾病中能很好地抑制血管收縮[5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，瘡毒是一類急性皮下炎癥反應(yīng)，病變組織可釋放大量具有強烈舒血管作用的炎性因子，加速周圍組織血流變，同時引起血管滲出，加重組織水腫并延緩病變組織愈合，因此除了常規(guī)抗炎治療外，抑制炎性病變部位的微血管舒張和滲出，也是有效緩解皮下組織水腫的重要手段。本實驗利用經(jīng)典的急性皮下炎癥模型，從干預(yù)血流變及病變組織中相關(guān)炎性因子的變化角度探討白芷防風(fēng)合用對急性皮下炎癥的作用及其機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 RE1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(陜西愛信儀器有限公司)；CPA22型電子天平(德國Sartorius公司)；KP-90N型求積儀(日本小泉公司)；NR0158型游標卡尺(安徽銳能公司)；Infinite M200 Pro型酶標儀(瑞士Tecan公司)；LD12-HIR型激光多普勒成像系統(tǒng)(英國摩爾儀器公司)；Milli-Q AdvantageA10型超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2試藥 防風(fēng)、白芷(康美藥業(yè)公司，批號分別為181203901、181004311)；防風(fēng)、白芷藥材提取物，自制方法：防風(fēng)、白芷各50 g，用體積分數(shù)為75%的乙醇回流提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器55 ℃減壓濃縮至質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，4 ℃冷藏備用。陽性對照藥復(fù)方地塞米松(三九醫(yī)藥股份有限公司，批號1905003J)；角叉菜膠(麥克林生化科技有限公司，批號C10207866)。大鼠白細胞介素-1β(IL-1β，批號1906261)、大鼠白細胞介素-8(IL-8，批號1906283)、大鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2，批號1906262)、大鼠前列腺素E2(PGE2，批號1907602)、大鼠前列腺素I2(PGI2，批號1907153)、大鼠白細胞三烯B4(LTB4，批號1907061)和大鼠白細胞三烯D4酶聯(lián)免疫試劑盒(LTD4，批號1907081)，均購于西唐生物科技有限公司。

1.3動物 清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為(210±20) g，飼養(yǎng)條件：室溫為(25±2) ℃，自由進食飲水。實驗動物購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：醫(yī)動字第 08-005號，動物許可證號：SCXK(軍)2019-007。

2 方法

2.1大鼠急性皮下炎癥模型的建立與分組 將60只SD大鼠隨機均分為正常組、模型組、陽性藥組、白芷組、防風(fēng)組和防風(fēng)白芷合用組，每組10只，正常組于后肢足跖部皮下注射生理鹽水100 μL，其余各組注射10 mg·mL-1的角叉菜膠100 μL，造模成功標準以與正常組腫脹度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義為準，用求積儀測定大鼠雙足跖容積，各給藥組(除正常組與模型組外)均在造模1 h后均勻涂抹相關(guān)藥物，給藥劑量根據(jù)人用劑量和體表面積換算，大鼠陽性藥組為0.3 mg·kg-1,防風(fēng)組、白芷組和防風(fēng)白芷合用組均為10 g·kg-1。

2.2炎性腫脹率和血流的檢測 給藥4 h后測定各組大鼠雙足跖容積，游標卡尺測量足底厚度，求積儀測量足底面積，估算足部近似容積，并依據(jù)公式計算大鼠足腫脹率。

足腫脹率=(致炎后足容積-致炎前足容積)÷致炎前足容積×100%

各組大鼠腹腔注射10 mg·mL-1戊巴比妥鈉麻醉，測量造模前、造模后1 h及給藥后4 h肢足跖血液流動的改變。

2.3急性炎癥組織中細胞因子的測定 各組大鼠麻醉后取后肢足跖部組織約0.1 g，稱定質(zhì)量后加生理鹽水2 mL研磨，在4 ℃條件下以4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)法按照試劑盒說明書，測定組織中IL-1β、IL-8、LTB4、LTD4、COX-2、PGI2和PGE2水平。

3 結(jié)果

3.1大鼠足腫脹實驗結(jié)果 與正常組相比，各組足腫脹程度均較明顯，與模型組相比，其余各給藥組足腫脹程度均明顯降低(P<0.05)，與陽性藥組相比，白芷組和防風(fēng)組抗腫脹作用較弱，防風(fēng)白芷合用組在用藥2 h后，抗腫脹效果明顯優(yōu)于陽性藥組，結(jié)果見表1。

表1 急性皮下炎癥模型腫脹度結(jié)果Tab.1 Results of swelling degree in acute subcutaneous inflammation model

3.2激光多普勒測定血流變結(jié)果 見圖1。圖1由藍到紅依次為血流變強度遞增，正常組大鼠足部血流變可檢測度極低，發(fā)生炎癥反應(yīng)后，血管擴張，血流變急劇增加。與正常組相比，模型組炎癥組織血流變量顯著升高，與模型組相比，其余各給藥組足部血流變均明顯降低，防風(fēng)組、白芷組及防風(fēng)白芷合用組影響血流變作用顯著，其中防風(fēng)組較偏重作用于微血管與支桿血管匯集之間區(qū)域的血流變，白芷組有調(diào)節(jié)整體血流變的趨勢，防風(fēng)白芷合用組降低血流量效果更明顯，血流變化與陽性藥組相似。

圖1 急性炎癥模型血流變A.正常組；B.模型組；C.陽性藥組；D.白芷組；E.防風(fēng)組；F.防風(fēng)白芷合用組。Fig.1 The blood flow of acute inflammatory modelA.normal group;B.model group;C.positive group;D.Angelica dahurica group；E.Saposhnikovia divaricate group；F.Saposhnikovia divaricate and Angelica dahurica combination group.

3.3防風(fēng)白芷合用對大鼠急性皮下炎癥組織中COX-2、PGE2和PGI2水平的影響 與正常組比較，模型組致炎大鼠足組織中PGE2、PGI2和COX-2水平均明顯升高；與模型組比較，白芷組、防風(fēng)組、防風(fēng)白芷合用組及陽性藥組均可不同程度降低角叉菜膠致炎大鼠炎性組織中PGE2、PGD2和COX-2水平，見表2。

表2 大鼠足部組織中COX-2、PGE2和PGI2水平Tab.2 Levels of COX-2，PGE2 and PGI2 in rat toe tissues

3.4炎癥組織中LTB4和LTD4水平 與正常組比較，模型組的LTB4和LTD4水平均顯著升高，白芷組的LTB4水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，防風(fēng)組及防風(fēng)白芷合用組與模型組相比LTB4水平顯著降低(P<0.05)；白芷組、防風(fēng)組、防風(fēng)白芷合用組較模型組LTD4水平顯著降低(P<0.05)，且防風(fēng)白芷合用組較防風(fēng)組和白芷組降低更顯著(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 大鼠足部組織LTB4和LTD4水平Tab.3 Levels of LTB4 and LTD4 in rat toe tissues

3.5炎癥組織中IL-1β和IL-8水平 與正常組相比，模型組IL-1β和IL-8水平顯著升高(P<0.05)，白芷組、防風(fēng)組、防風(fēng)白芷合用組較正常組IL-1β和IL-8水平也顯著升高(P<0.05)，但較模型組顯著降低(P<0.05)，白芷組和防風(fēng)白芷合用組較防風(fēng)組IL-1β和IL-8水平降低更顯著(P<0.05)。結(jié)果見表4。

表4 大鼠足部組織IL-1β和IL-8水平Tab.4 Levels of IL-1β and IL-8 in rat toe tissues

4 討論

《中醫(yī)外科學(xué)》指出瘡毒是外科疾病中最常見的一大類病證，是各類致病因素侵襲機體后所引起的一切體表化膿性感染疾病的總稱[6]，發(fā)病期多表現(xiàn)為皮膚瘙癢、紅腫疼痛、易潰破、易化膿。《素問病機氣宜保命集》瘡瘍論——第二十六[7]：“論曰，瘡瘍者，火之屬，須分表里，以治其本。內(nèi)經(jīng)曰，膏粱之變，足生大丁，其原在里，發(fā)于表也，受持如虛。言內(nèi)結(jié)而發(fā)諸外，未知從何道而出，皆是從虛而出也?！悲彾?急性皮下炎癥多為風(fēng)濕熱毒聚集而成，即臟腑郁熱，風(fēng)濕所侵，肺氣虧虛，結(jié)聚腠理，以致血行不暢，經(jīng)脈不舒，皮膚瘙癢，日久化膿。因此選用具有祛風(fēng)止癢、燥濕透疹功效的藥物進行對癥治療，防風(fēng)能止癢、勝濕止痛、祛風(fēng)解表、止痙?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)含有色原酮、香豆素[8]、多糖類、甾醇類、聚炔類、揮發(fā)油和有機酸等多種有效成分。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)可能通過抑制肥大細胞蛋白酶激活受體2 (PAR-2)的表達，繼而阻斷肥大細胞脫顆粒，并且選擇性減少相關(guān)細胞因子分泌，從而抑制肥大細胞“瀑布效應(yīng)”達到抗過敏作用[9]，其抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌等作用也得到了進一步研究[10-11]；白芷祛風(fēng)解表散寒、止癢、止痛、燥濕、消腫、排膿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷含有揮發(fā)油類、香豆素類、多糖類、甾醇類、木脂素和生物堿等化學(xué)成分，具有解熱鎮(zhèn)痛[12]、抗氧化、美白[13]、擴張血管、抑菌、抗炎和降血糖[14]等藥理作用，兩藥配伍，相得益彰，更好地發(fā)揮了其祛風(fēng)止癢、解熱鎮(zhèn)痛和抗炎的效果。

臨床上防風(fēng)和白芷主要用于外感風(fēng)寒、頭痛身痛、風(fēng)濕痹痛、癰疽瘡瘍、風(fēng)疹瘙癢和骨節(jié)酸痛等?，F(xiàn)代藥理研究表明，防風(fēng)和白芷有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、抑菌、抗腫瘤、抗病毒和影響免疫功能的作用[15-17]，很大程度上豐富了臨床用藥范圍，但其在抗血管通透性增加、抗組織水腫和調(diào)節(jié)微循環(huán)血流變的作用機制尚不明確。因此本實驗以防風(fēng)白芷提取物為研究對象，建立角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾急性皮下炎癥模型，利用激光多普勒原理，測量模型大鼠足部血流量變化，結(jié)果顯示，防風(fēng)組、白芷組和防風(fēng)白芷合用組的大鼠炎癥腳趾血流變均得到不同程度的抑制，抑制其毛細血管擴張，促進其恢復(fù)正常，其中防風(fēng)較偏重作用于微血管與支桿血管匯集之間區(qū)域的血流變，對足趾枝干血流變影響明顯，白芷次之，有調(diào)節(jié)整體血流變的趨勢，防風(fēng)白芷合用后效果最明顯，提示防風(fēng)白芷合用對炎癥組織血管擴張和滲出具有抑制效果，具有深入研究的價值。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，瘡毒的基本病理特征為急性皮下炎癥反應(yīng)，即皮下組織的急性化膿性感染，當炎癥反應(yīng)發(fā)生時皮損組織釋放出大量的炎癥因子，包括白細胞介素類、白細胞三烯類和前列腺素類等，這些炎性因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著加劇炎癥反應(yīng)的重要作用[18-19]。各種理化因素、生物因素通過對表皮的刺激，能夠?qū)е陆琴|(zhì)形成細胞活化，促進其分泌IL-1β等炎癥因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，使循環(huán)中的炎癥細胞透過血管壁，在趨化因子的作用下浸潤于局部組織，釋放其他炎癥因子如IL-8，促使局部皮膚炎癥的形成與發(fā)展[20]。白細胞三烯LTB4、LTD4在免疫調(diào)節(jié)及炎癥發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要作用，LTB4是強效的炎癥介質(zhì)，能吸引中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞在炎癥區(qū)聚集，有利于及時清除有害物質(zhì)，但同時也產(chǎn)生更多的LTB4，繼而導(dǎo)致炎癥的加劇[21]；LTD4水平升高也能導(dǎo)致黏膜增厚、血管擴張、腫脹、充血，使炎癥進展[22]。COX-2具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，能進一步產(chǎn)生PGI2、PGE2等細胞因子，具有增加血管通透性、維持血管張力及免疫調(diào)節(jié)等功能[23]。

通過檢測炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-8、LTB4、LTD4、COX-2、PGI2和PGE2的水平變化來考察防風(fēng)和白芷的抗炎、調(diào)節(jié)血流變的作用。本實驗結(jié)果表明，模型大鼠的相關(guān)炎性因子IL-1β、IL-8、LTB4、LTD4、COX-2、PGI2和PGE2水平均顯著升高。與模型組比較，各給藥組中前列腺素類指標PGI2、PGE2和COX-2水平均下降，作用重點不突出。防風(fēng)組與白芷組相比，防風(fēng)對LTB4和LTD4的作用更顯著，白芷對IL-1β和IL-8的作用較明顯，防風(fēng)白芷合用組的效果優(yōu)于防風(fēng)和白芷單用組，結(jié)果提示，防風(fēng)白芷合用對皮下急性炎癥的作用機制有差別，在抑制白細胞三烯類和白介素類炎癥介質(zhì)過程中有協(xié)同配伍效果，作用機制尚需深入研究。