阮仁余，鄧祥敏，王 朝，朱星宇，陳廣云

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，淮安 223003；2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，淮安 223005；3.淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，淮安 223300)

蒲地藍(lán)消炎口服液由蒲公英、苦地丁、板藍(lán)根和黃芩4種中藥制成，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，主治癤腫、腮腺炎、咽炎和扁桃體等疾病[1-2]，在兒科臨床應(yīng)用廣泛，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-5]，方中蒲公英味苦、甘，性寒，清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋；苦地丁味苦，性寒，清熱解毒，散結(jié)消腫；板藍(lán)根味苦，性寒，清熱解毒，涼血利咽；黃芩味苦，性寒，清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎[1]。4藥均苦寒，共奏清熱解毒之效，對(duì)熱毒引起的咽喉腫痛、瘡癰腫痛具有顯著療效。

《中國(guó)藥典》2015年版一部在蒲地藍(lán)消炎口服液含量測(cè)定項(xiàng)下收載了黃芩苷和菊苣糖的含量測(cè)定，并未對(duì)苦地丁及板藍(lán)根所含成分進(jìn)行含量測(cè)定，記載的方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，因此有必要探索更加快捷、高效的多指標(biāo)含量測(cè)定方法[1]。由于蒲地藍(lán)消炎口服液臨床應(yīng)用極為廣泛且療效確切，近年來越來越多的學(xué)者關(guān)注到其多指標(biāo)質(zhì)量控制的重要性。董自波等[6]建立了能同時(shí)測(cè)定蒲地藍(lán)消炎口服液中黃芩苷、漢黃芩素、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、紫堇靈和腺苷含量的HPLC法，為其多指標(biāo)含量測(cè)定提供了參考，但該方法存在耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。吳婷等[7]利用UPLC-MS-MS法測(cè)定了蒲地藍(lán)消炎口服液中菊苣酸、黃芩苷、綠原酸、漢黃芩素、黃芩素和咖啡酸的含量，該方法具有快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。高文雅等[8]利用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蒲地藍(lán)消炎口服液中12種成分含量的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核苷類、黃酮類和有機(jī)酸類成分的同時(shí)測(cè)定，具有靈敏度高、分離度好、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，為其質(zhì)量控制的提升提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但液質(zhì)聯(lián)用法存在儀器成本高、不易推廣的缺點(diǎn)。UPLC法可用于中藥復(fù)方復(fù)雜體系的含量測(cè)定，可以對(duì)多成分、多指標(biāo)進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，符合中藥復(fù)方整體質(zhì)量控制的特點(diǎn)，且具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)[9-12]。

本文在文獻(xiàn)已有方法的基礎(chǔ)上，建立了能同時(shí)測(cè)定蒲地藍(lán)消炎口服液中9種成分含量的UPLC法，該方法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可為蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)，包括二元高壓梯度泵、真空在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和Empower 3色譜工作站；超聲波清洗器(天津市泰斯特儀器有限公司)；BT25S型十萬分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；明澈TM-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)(濟(jì)南博美歐科技有限公司)，包括Progard預(yù)處理柱和Q-Gard超純水柱。

1.2試藥 對(duì)照品：綠原酸(批號(hào)110753-201715)、咖啡酸(批號(hào)110885-201702)、菊苣酸(批號(hào)111752-201601)、紫堇靈(批號(hào)111734-201802)、黃芩苷(批號(hào)110715-201718)、木犀草素(批號(hào)111520-201504)、漢黃芩苷(批號(hào)111728-201607)、黃芩素(批號(hào)111728-201607)和漢黃芩素(批號(hào)111514-201706)，均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蒲地藍(lán)消炎口服液(批號(hào)分別為1808121、1808124、1808127)，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司；三氟乙酸(色譜純)，其余試劑均為分析純，均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司;水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(30 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：1 mL·L-1三氟乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0～1 min，95%A～85%A；1～2 min，85%A～81%A；2～6 min，81%A～78%A；6～9 min，78%A～65%A；9～12 min，65%A～52%A；12～14 min，52%A～48%A；14～18 min，48%A～5%A。流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm[13-20]。色譜圖見圖1。

2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取9種成分對(duì)照品適量，加甲醇配制成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取上述單一對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到9種成分質(zhì)量濃度分別為0.342、0.164、0.691、0.250、4.424、0.572、1.114、0.120、0.323 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備 精密吸取蒲地藍(lán)消炎口服液1 mL，置于量瓶中，加入甲醇1 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備 根據(jù)蒲地藍(lán)消炎口服液的處方，分別制備缺蒲公英、苦地丁和黃芩的陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.5線性關(guān)系考察 將2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液分別稀釋0、2、4、8、16倍，將稀釋液注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 9種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Calibration curves of the 9 components

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得9種成分峰面積的RSD值均小于1.46%，表明該儀器精密度良好。見表2。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 精密吸取10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算9種成分峰面積的RSD值均小于1.90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表2。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下方法重復(fù)制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定9種成分的含量，計(jì)算得RSD值均小于2.59%，表明該方法重復(fù)性良好。見表2。

表2 9種成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD值Tab.2 RSD values of precision，stability and reproducibility tests of the 9 compounds

2.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量的蒲地藍(lán)消炎口服液(批號(hào)1808121)，每份0.5 mL，共6份。分別精密加入2.2項(xiàng)下制備的綠原酸、咖啡酸、紫堇靈、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素單一對(duì)照品儲(chǔ)備液各25 μL及菊苣酸單一對(duì)照品儲(chǔ)備液50 μL、黃芩苷單一對(duì)照品儲(chǔ)備液70 μL。按照2.3項(xiàng)下方法制備溶液，補(bǔ)充甲醇使總體積為2 mL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算9種成分的平均回收率。結(jié)果見表3。

表3 9種成分的回收率 (n=6)Tab.3 Recovery rates of the 9 compounds (n=6)

2.10樣品的含量測(cè)定 取蒲地藍(lán)消炎口服液適量，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定9種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of sample content determination

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液在280 nm波長(zhǎng)處各成分峰形良好，且分離度較高。此外，實(shí)驗(yàn)初期對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察，分別考察了水-甲醇、水-乙腈、甲酸-乙腈、磷酸-乙腈、三氟乙酸-甲醇和三氟乙酸-乙腈系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品在1 mL·L-1三氟乙酸-甲醇系統(tǒng)下，響應(yīng)最好，峰形最佳，最終通過多個(gè)洗脫梯度的考察，優(yōu)選了本文的洗脫條件，可以達(dá)到峰形好、分離度高的效果。

《中國(guó)藥典》2015年版中對(duì)蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量控制含量測(cè)定指標(biāo)為菊苣酸和黃芩苷，其所用方法為HPLC法，存在耗時(shí)長(zhǎng)、不能同時(shí)測(cè)定的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用UPLC法，在含量測(cè)定的基礎(chǔ)上增加了綠原酸、咖啡酸、紫堇靈、木犀草素、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素7種成分的含量測(cè)定，具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)勢(shì)，能夠更加全面地評(píng)價(jià)蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量，符合中藥制劑整體評(píng)價(jià)的要求。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法在17 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定了蒲地藍(lán)消炎口服液中9種成分的含量，該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高、可操作性強(qiáng)，為蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了參考。