高 旭，呂金朋，張 輝*，李晶峰*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，長(zhǎng)春 130117）

中醫(yī)學(xué)將糖尿病稱為消渴，臨床主要表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、形體消瘦或尿有甜味。人參黃連有效組分速崩片由黃連總堿、人參總皂苷配伍，主要針對(duì)早期糖尿病腎病患者，其配伍充分顯示了中醫(yī)辨證施治與整體觀念的思想[1]。為了更好地控制該藥品的質(zhì)量，本研究參照藥典和相關(guān)文獻(xiàn)資料，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)人參黃連有效組分進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。

1 材料與儀器

1.1 試藥

人參黃連有效組分速崩片（批號(hào)：ZT191201、ZT191202、ZT191203）， 黃 連 總 堿（20181101、20181104、20181107），人參總皂苷（20181102、20181108、20181115）， 人 參 皂 苷Rg1（110703-201733）、Re（110703-201728）、Rb1（110704-201726）、Rd（111818-201603）、S-Rg3（18101302）、 鹽 酸小檗堿（110713-201712，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度＞98%）、鹽酸藥根堿（110733-201609，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度＞98%），甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀；SPECORD 200 plus 紫外檢測(cè)器，德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司；PT104-55SY 十萬分之一天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；BSA124S-CW 萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；液晶超聲波清洗器，昆山潔力美超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參黃連有效組分速崩片人參皂苷的含量測(cè)定研究

2.1.1 測(cè)定依據(jù) 參照《中國(guó)藥典》（2015 版）[2]人參含量測(cè)定項(xiàng)下選用的檢測(cè)波長(zhǎng)，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號(hào)：Agilent Eclipse Plus-C18，4.6 mm×250 mm）；柱溫：30 ℃；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表1中洗脫表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，流速為1.0 mL·mL-1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 按表2 所示分別精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量甲醇配成下表所示濃度的人參總皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 供試品溶液的備 取人參黃連有效組分速崩片10 片，研磨，精密稱取1 g，加甲醇30 mL 超聲30 min，過濾，取續(xù)濾液，水浴蒸干，加30 mL 水使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3 次，每次30 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL 使溶解，大孔吸附樹脂上樣，待樣品液面與大孔樹脂相水平后，加入70%乙醇100 mL洗脫，續(xù)濾液蒸干，30 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。

表1 流動(dòng)相洗脫表

表2 人參皂苷混合標(biāo)品統(tǒng)計(jì)表

2.1.4 方法學(xué)考察2.1.4.1 線性關(guān)系考察 分別以進(jìn)樣量為2、4、6、8、10、12 μL 的混合對(duì)照品溶液注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各對(duì)照品的回歸方程及線性范圍為：Rg1：Y = 203.09X + 13.234（1.08 ～6.48 μg）；Re：Y = 135.76X+62.095（1.09 ～6.54 μg）；Rb1：Y = 72.308X + 5.6685（1.14 ～6.84 μg）；Rd：Y =162.28X + 10.071（1.28 ～7.68 μg）；S-Rg3：Y =197.36X + 19.989（1.06 ～6.36 μg）[3]，見表3。

表3 線性考察數(shù)據(jù)（峰面積）

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的混標(biāo)對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，依2.1.1 方法測(cè)定，記錄峰面積積分值，計(jì)算，考察精密度，見表4。

精密度考察結(jié)果顯示：對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的混標(biāo)對(duì)照品的峰面積結(jié)果的RSD 均＜2%，表明儀器、方法的精密度良好[4]。

表4 精密度試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一人參總皂苷供試品溶液5 μL，按0 h、4 h、8 h、16 h、18、24 h分別注入液相色譜儀，依2.1.1 方法測(cè)定。以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的峰面積測(cè)定結(jié)果為指標(biāo)，測(cè)定其在24 h 內(nèi)檢測(cè)的穩(wěn)定性，見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示：在24 h 內(nèi)測(cè)定供試品溶液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積的RSD 均＜2%，表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 5個(gè)基準(zhǔn)物24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果可靠，穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密量取同一人參總皂苷供試品共5 份，按供試品溶液項(xiàng)下制備方法制備，精密吸取5 μL，依2.1.1 方法測(cè)定，計(jì)算樣品含量，以考察本法的重現(xiàn)性[5]，見表6。

表6 重現(xiàn)性試驗(yàn)（峰面積）

以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 為含量測(cè)定指標(biāo)，考察本法的重現(xiàn)性，結(jié)果RSD 均＜2%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取3 批次已知含量的人參黃連有效組分速崩片10 片，研磨后精密稱定0.5 g，準(zhǔn)確加人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和S-Rg3適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1.3 方法制備樣品溶液，每批樣品均平行進(jìn)樣3 次，分別按這5 種人參皂苷的含量分別為80%、100%、120%的比例分別加入一定量的各人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依2.1.1 方法測(cè)定，測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD 值[6]。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的加樣回收率分別為 101.5%、100.03%、99.02%、101.5%、100.02%，RSD 值分別為1.2%、1.02%、1.30%、0.86%、1.20%表明該方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果可信。

2.1.5 3 批樣品含量 根據(jù)外標(biāo)公式計(jì)人參總皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、S-Rg3 的含量。樣品含量由樣品峰面積（A 樣）、對(duì)照品濃度（C 標(biāo)）、對(duì)照品進(jìn)樣量（Ⅴ標(biāo)）三者的乘積比對(duì)照品峰面積（A 標(biāo)）、樣品濃度（C 樣）、樣品進(jìn)樣量（Ⅴ樣）三者的乘積求得。取不同3 批次人參黃連有效組分速崩片，每批次中均平行檢測(cè)3 個(gè)樣品，色譜圖見圖1、圖2。取平均值后，暫定人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和S-Rg3 含量每片分別為2.92 mg、7.69 mg 、1.06 mg、4.42 mg 和0.56 mg。

圖1 人參皂苷混合對(duì)照品色譜圖

圖2 人參總皂苷色譜圖

2.2 人參黃連有效組分速崩片人參皂苷的含量測(cè)定研究

2.2.1 測(cè)定依據(jù) 參照《中國(guó)藥典》（2015 版）[2]黃連含量測(cè)定項(xiàng)下選用的檢測(cè)波長(zhǎng)，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號(hào)：Xcharge- C18，5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：30 ℃以乙腈為流動(dòng)相A，萬分之一三氟乙酸水為流動(dòng)相B，按照表7 進(jìn)行等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm。流速為0.6 mL·min-1。

表7 流動(dòng)相洗脫表

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 稱取鹽酸小檗堿1.88 mg、鹽酸藥根堿1.18 mg 溶于適量的甲醇中，混勻，分別得到濃度為0.47 mg·mL-1和0.295 mg·mL-1的鹽酸小檗堿及鹽酸藥根堿混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.3 黃連供試品溶液制備 取10 片人參黃連有效組分速崩片，研磨，精確稱定1 g，加入25 mL 甲醇并超聲波30 min，過0.45 μm 濾膜，備用。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)確定 稱取適量的鹽酸小檗堿對(duì)照品，其相應(yīng)的試劑作為空白，用紫外分光光度計(jì)（200 ～500 nm）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，在345 nm 處有最大吸收峰，因此將345 nm 確定為檢測(cè)波長(zhǎng)[7]。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 制備濃度分別為0.47、0.295 mg·mL-1鹽酸小檗堿及藥根堿的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。進(jìn)樣量分別為1、3、5、7、9、12 μL，注入液相色譜儀。進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，分別繪制鹽酸小檗堿和藥根堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表8。

表8 鹽酸小檗堿及藥根堿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)（峰面積）

2.2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取3 μL 鹽酸小檗堿和藥根堿的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將其注入液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6 次，依2.2.1 中方法測(cè)定，記錄峰面積積分值，考察精密度[8]，見表9。精密度考察結(jié)果顯示：對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定鹽酸小檗堿和藥根堿的混標(biāo)對(duì)照品的峰面積結(jié)果的RSD 均＜2%，表明該方法精密度良好。

表9 精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（峰面積）

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取10 μL 同一黃連總生物堿樣品溶液，按一定時(shí)間分別注入液相色譜儀。依2.2.1 方法測(cè)定，以鹽酸小檗堿及藥根堿的混標(biāo)對(duì)照品各成分的峰面積測(cè)定結(jié)果為指標(biāo)，測(cè)定其在24 h 內(nèi)檢測(cè)的穩(wěn)定性[9]，見表10。

表10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.2.4.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱定5 份同一黃連總生物堿樣品，按供試品溶液項(xiàng)下制備方法制備樣品，精密吸取10 μL，按照方法2.2.1 進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算樣品的含量，以研究該方法的重現(xiàn)性。見表11。

表11 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（峰面積）

2.2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含量的3批黃連總生物堿各2 mg，每批樣品平行進(jìn)樣3 次，分別精密加入鹽酸小檗堿和藥根堿混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，每組分別按照鹽酸小檗堿和藥根堿總含量比例的80%，100%和120%，加入一定量的鹽酸小檗堿和藥根堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依2.2.1 方法測(cè)定，測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD 值?；厥章视杉尤雽?duì)照品后測(cè)得的含有該成分的量與加入對(duì)照品前測(cè)得的含有該成分的量的差值比加入對(duì)照品的量求得。

鹽酸小檗堿和藥根堿的加樣回收率分別為102.6%、99.6%和101.6%。RSD 值分別為101.3%，100.5%和99.6%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，結(jié)果可信。2.2.5 樣品測(cè)定 取3批人參黃連有效組分速崩片，每批檢測(cè)3 個(gè)平行樣品，色譜圖見圖3、圖4。取其平均值后，鹽酸麻風(fēng)次堿和小堿的含量每片分別為2.644 mg 和39.02 mg。

圖3 混合對(duì)照品色譜圖

圖4 黃連總生物堿色譜圖

3 小結(jié)

人參在降糖方面有較好的活性，能夠加速糖尿病性大鼠血糖和血脂代謝，并促進(jìn)胰島素分泌[10-11]，黃連可降低患者血糖、血脂[12-13]，人參黃連配伍后能夠改善糖代謝，并能維持胰島細(xì)胞身份[14]，且經(jīng)課題組前期研究結(jié)果表明人參黃連配伍后表現(xiàn)的降糖活性優(yōu)于單味藥。人參黃連有效組分速崩片具有使用劑量低、釋放速度快、作用靶點(diǎn)多等創(chuàng)新性，對(duì)糖尿病腎病的治療有重大意義[15]。本實(shí)驗(yàn)通過高效液相色譜法檢測(cè)各成分的含量，操作簡(jiǎn)單可靠，靈敏度高，初步建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)試驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。