程 鶴，祝明珠，徐 君，劉峻麟，2，俞年軍，2，彭代銀，周 安，吳振東，韓榮春

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中藥資源保護與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省青陽縣九華中藥材科技有限公司，安徽 池州 242800)

黃精為2020年版《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥材，其正名始見于《名醫(yī)別錄》，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效。其化學成分主要為多糖、甾體皂苷類，多花黃精多糖由多種單糖包括葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖等構成。黃精多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、調血脂、提高免疫功能和記憶力等作用。

鼠李糖是一種單糖，其在植物體中主要的功能是參與植物多糖合成，也常作為細菌莢膜和細胞壁的組成成分，鼠李糖在植物和細菌界中的應用很廣泛。3,5-異構酶/4-還原酶(3,5-epimerase/4-reductase,UER1)是UDP-葡萄糖向UDP-鼠李糖轉化的關鍵酶之一，這種酶有還原酶和異構酶的酶活結構域。龐朝友在棉花纖維素中發(fā)現(xiàn)該酶的基因，其為核苷糖并主要參與多糖的合成。擬藍芥細胞壁中存在該酶的基因，并參與鼠李糖的合成。UER1參與多糖的合成，并且是多糖合成中必不可少的酶基因。因此，本研究對多花黃精多糖中UER1基因進行克隆，并進行生物信息學分析，為其多糖的生物合成提供理論參考，并為多花黃精中次生代謝產(chǎn)物的研究提供實驗基礎；同時，構建多花黃精PcUER1基因的質粒的體外載體，為后續(xù)的蛋白組學研究提供實驗依據(jù)。

本課題組前期研究顯示，UER1是多花黃精多糖中第6種單糖UDP-鼠李糖的關鍵酶基因，而UDP-鼠李糖是由UDP-葡萄糖脫水酶(RHM)及UER1催化合成。

1 材料

1.1 藥材與試劑 多花黃精植株采自安徽省青陽縣等地，后移植至安徽中醫(yī)藥大學種質資源圃，經(jīng)俞年軍教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精

Polygonatum

cyrtonema

Hua。取多花黃精新鮮植株，分別為根、根莖、莖、葉4個部位，用清水洗凈表面泥土，先用75%乙醇無菌操作，并用無菌水洗凈3次，吸干水分，立即在液氮中研磨，置于-18 ℃冰箱保存，以備提取總RNA。

瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒(DP209-02)、pGM-TFast克隆試劑盒(VT151022)、FastQuant RT試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。菌株與質粒：DH5α。

1.2 儀器 PCR擴增儀、Eppendorf 5810R型高速離心機：德國Eppendorf公司；ScanDrop200型核酸分析儀：德國Jena分析儀器股份有限公司；IMS-100全自動雪花制冰機：江蘇省常熟雪科電器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：英國SYIGLHR/1528。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA的合成 按照Liu等方法和Trizol試劑盒說明書提取RNA，先提取多花黃精4種部位的總RNA，再用ScanDrop檢測RNA的純度與濃度，使OD/OD和OD/OD均達到1.8以上，采用Aglient 2100檢測總RNA的完整性。采用FastQuant RT試劑盒逆轉錄RNA，得到第一鏈cDNA。

2.2 引物設計及PcUER1的序列信息確認 對測序得到的PcUER1酶基因的序列信息進行確認。在NCBI中Blastx進行檢索PcUER1序列，并保存同源物種中序列信息。使用在線程序Primer-BLAST設計多花黃精的特異性引物序列，進行后續(xù)的PCR反應。引物合成由上海生物工程股份有限公司提供。PcUER1基因克隆引物的正鏈為5′-CCGCGCAATTTCATCACCAA-3′，反鏈為5′-CCAGGGTTGGTGAAGTTCCA-3′；管家基因PcTubulin的正鏈為5′-TGGGATACGGCACGAGATTG-3′，反鏈為5′-CCGGAGATCCTTGGACATCG-3′。擴增產(chǎn)物為900 bp的DNA。

得到PcUER1第一鏈的PCR擴增產(chǎn)物后，通過1.0%瓊脂糖凝膠板對其進行電泳檢測，在紫外燈條件下把凝膠板上明亮條帶產(chǎn)物切除，最后使用瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒并按說明書操作方法回收并純化DNA。取純化cDNA，按照pGM-TFast克隆試劑盒操作步驟，讓其和載體pGM-TFast連接，得到連接載體產(chǎn)物，整個過程需在冰上進行。將含有外源基因的質粒通過熱休克轉化入大腸桿菌DH5α后，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。使用Invitrogen質粒提取試劑盒回收質粒后，使用ScanDrop檢測質粒的濃度和純度，符合標準后，再使用T7-F/SP6通用引物PCR后，送至蘇州金唯智生物科技公司進行雙向測序。

2.3 生物信息學分析 使用NCBI中BLAST搜索比對PcUER1的同源序列，使用MEGAX軟件構建該基因同源物種序列的系統(tǒng)進化樹，使用軟件ProtParam、在線軟件SWISS-MODEL和在線軟件SOMPA對PcUER1基因編碼的蛋白序列進行理化性質分析、二維結構預測及三維結構的預測分析。

2.4 實時熒光定量PCR檢測多花黃精不同組織的PcUER1表達水平 將保留的合格RNA樣品(OD/OD>1.8,OD/OD>1.8)按照FastQuant試劑盒說明書操作步驟逆轉錄成cDNA第一條模板鏈。使用在線軟件Primer設計實時熒光定量PCR所需的引物(見“2.2”項)，使用穩(wěn)定性較好的微管蛋白基因(PcTubulin)作為內(nèi)參。選擇Fast Start Essential DNA Green Master作熒光染料，使用熒光定量PCR儀(ROCHE Z480型)進行擴增反應，每反應體系為15 μL，各反應均平行3次，以不含引物的反應體系作陰性對照，并以溶解曲線分析以確保擴增產(chǎn)物的特異性。

2.5 葡萄糖標準曲線建立 按照2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，取無水葡萄糖對照品33 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，用蒽酮-硫酸法測定含量，繪制標準曲線。

2.6 多花黃精不同部位多糖含量檢測 分別將3株青陽多花黃精分為3組，每組不同部位干燥粉末取0.25 g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，將殘渣濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱濾過，合并濾液與洗液，放冷，轉移至250 mL量瓶中，定容精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，按照標準曲線的制備項下方法，自“加水至2.0 mL”起，測定吸光度，每組平行3次。

3 結果

3.1 多花黃精多糖PcUER1基因的克隆 基于多花黃精轉錄組學數(shù)據(jù)。使用特異性引物PcUER1，20 μL體系擴增，進行cDNA的合成。電泳結果(見圖1)顯示，該基因在多花黃精莖中存在，并得到900 bp的單一明亮條帶，與預期的條帶大小一致。

注：M. DL2000；1、2均為PcUER1基因圖1 PcUER1基因的克隆

通過BioEdit軟件中GraphicsView功能將PcUER1基因的核酸序列轉譯成氨基酸序列。結果顯示PcUER1基因片段有900 bp，編碼299個氨基酸。PcUER1基因cDNA的核酸序列及推測的氨基酸序列見圖2。多花黃精與百合科虎眼萬年青和禾本科二棱大麥同源性較高，分別達92.03%、89.00%。

3.2 PcUER1蛋白三維結構預測 使用ProtParam軟件對PcUER1蛋白的理化性質進行分析。通過分析蛋白分子式為CHNOS，其原子總數(shù)為4 714。由20種共299個氨基酸組成，分子量為33 510.25 Da，預測等電點值為5.74，預測該蛋白較穩(wěn)定，其不穩(wěn)定系數(shù)為22.12，預估此蛋白在體外哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞中半衰期為30 h，酵母體內(nèi)達20 h以上，大腸桿菌體內(nèi)有10 h以上的半衰期。脂肪族指數(shù)為87.66，親水性總平均數(shù)為-0.257，提示該蛋白為疏水性蛋白。數(shù)據(jù)結果顯示，序列的N-末端是甲硫氨酸(Met)，氨基酸的個數(shù)及組成情況見表1。

注：紅色實心圓和綠色三角形表示輔因子結合基序和催化四分體基序圖2 PcUER1基因cDNA的核酸序列及氨基酸序列

表1 PcUER1氨基酸的組成

使用在線軟件SOMPA對PcUER1蛋白的二級結構進行預測。結果(見圖3)表明，此蛋白具有α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲，分別占41.14%、6.35%、13.38%和39.13%。綜合分析結果顯示,PcUER1蛋白的主要結構是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲，β-轉角結構最少。

以SWISS-MODEL在線軟件為平臺，得到的結果(見圖4)表明，該蛋白序列識別度為86.22%，與BLAST比對的覆蓋度可達95%，該蛋白與模板匹配的結果中有281個氨基酸配對成功，占總數(shù)的93.98%。

注：紫色示無規(guī)則卷曲，藍色示α-螺旋，綠色示β-轉角，紅色示延伸鏈；橫坐標為堿基數(shù)圖3 PcUER1蛋白二維結構預測

圖4 PcUER1蛋白的三維結構預測

由圖4得出，與該蛋白二級結構預測結果相一致的是，PcUER1編碼的蛋白預測的三級結構中有大量的無規(guī)則卷曲和α-螺旋，只有少量β-轉角，因此，可認為該預測結果可信度高。

3.3 PcUER1系統(tǒng)發(fā)生樹構建 將PcUER1基因序列的同源氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，結果表明，多花黃精多糖中UER1酶基因同源序列眾多，比對結果中同源性相似度最高的為百合科虎眼萬年青(ANK57461.1)，在比對結果中未發(fā)現(xiàn)百合科的其他種屬。以包含PcUER1編碼蛋白在內(nèi)的19種不同植物UER1氨基酸序列為模板，采用MEGAX軟件創(chuàng)建UER1系統(tǒng)進化樹(見圖5)，以鄰位相連為統(tǒng)計方法，輔以配對刪除法對缺失數(shù)據(jù)進行處理。其中，多花黃精與百合科虎眼萬年青[

Albuca

bracteata

(

Thunb

.) J. C. Manning & Goldblatt]同源性最高，達到92.03%，由于虎眼萬年青和多花黃精同屬于百合科植物，故其同源性最高。由進化樹結果可知，多花黃精與傘形科黃胡蘿卜、旋花科三裂葉薯等親緣關系均較遠。

圖5 PcUER1的系統(tǒng)進化樹

表2 多花黃精不同組織黃精多糖含量檢測結果

4 討論

黃精多糖是多花黃精的主要有效成分，已有研究表明，黃精多糖是由多種單糖構成，包括鼠李糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等，這些單糖在后續(xù)糖基轉移酶的作用下，形成其特征性多糖。在黃精多糖的合成途徑中需要UDP-鼠李糖，UDP-鼠李糖是組成多花黃精多糖的重要成分。UDP-葡萄糖轉換成中間產(chǎn)物UDP-6-去氧-4-酮葡萄糖后，PcUER1在含有NADPH的環(huán)境下催化合成UDP-鼠李糖，且PcUER1參與纖維細胞次生壁的合成。PcUER1基因可能通過誘導某些特殊細胞壁多糖的合成和參與UDP-鼠李糖的合成，對黃精多糖的合成起到一定的作用。

UER1是多花黃精多糖中UDP-鼠李糖合成的關鍵酶基因，本研究以前期實驗室測序獲得的轉錄組數(shù)據(jù)為基礎，設計引物對PcUER1進行克隆。經(jīng)凝膠回收、載體連接與轉化，在質粒提取后進行測序，確定了PcUER1序列，該基因序列長度為900 bp，編碼299個氨基酸，進一步對PcUER1翻譯的蛋白質進行測算，主要結構是α-螺旋，其次是無規(guī)則卷曲，由20種共299個氨基酸組成，分子量為33 510.25 Da，預測該蛋白較穩(wěn)定，其理化性質較為穩(wěn)定，在酵母等模式工程菌體內(nèi)可存在較長時間，適合進行原核或真核異源表達。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索PcUER1的同源基因，發(fā)現(xiàn)其與百合科虎眼萬年青的UER1相似性較高。通過對PcUER1基因及其蛋白的結構與序列進行分析，并檢索相關文獻，發(fā)現(xiàn)PcUER1基因的活性位點有輔因子結合基序和催化四分體基序。采用實時熒光定量PCR對PcUER1基因的表達信息進行分析，結果在本次試驗中實測情況與生物信息學數(shù)據(jù)吻合度較高，根莖中黃精多糖含量最高。Yin等研究表明，虎眼萬年青的多糖中鼠李糖的合成是由RHS1與UER1協(xié)同作用，實時熒光定量PCR檢測結果與黃精多糖含量檢測結果有細微差異的原因可能是RHS1與UER1或UER1與其他基因的協(xié)同作用。

本研究為PcUER1多糖合成途徑關鍵酶基因的克隆及其結構和功能的進一步研究提供了依據(jù)，也為將來多糖類生物合成途徑的解析及調控機制的研究奠定了基礎。