聶 勇，秦合偉，呂 哲，姬令山，李文濤

(1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(athcrosclerosis，AS)是缺血性心腦血管疾病的基本病理基礎，脂質代謝紊亂、血液流變性異常和炎癥反應是促使AS形成的重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在調節(jié)AS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，miRNA-155(miR-155)是非編碼的微小RNA之一，其可表達于活化的免疫細胞，并與免疫功能相關，而單核巨噬細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞也參與了AS形成過程。此外，miR-155調控炎癥反應防治AS與調控細胞因子信號轉導抑制劑1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)/磷酸化轉錄激活子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)炎癥信號通路，進而影響程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)表達，以及影響腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(nterleukin-6，IL-6)、干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)3種炎癥因子水平有關。本實驗通過觀察血管軟化丸對miR-155和SOCS1/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路的調控，以及對TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子的影響，探究其抗AS的作用機制。

1 材料和方法

1.1 體內實驗

1.1.1 實驗動物 ApoE小鼠60只，SPF級，8周齡，體質量(18±2)g，購自南京大學模式動物研究所[動物生產許可證號：SCXK(蘇)2015-0001]。RAW264.7小鼠巨噬細胞株購自ATCC。將所有動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院動物實驗中心，(22±1)℃恒溫，60%～75%恒濕，12 h循環(huán)照明，自由攝食、飲水。本實驗已通過河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查，倫理審查批準文號為20170228。

1.1.2 藥物與試劑 血管軟化丸組方：黃芪30 g，山楂20 g，萊菔子15 g，丹參、三七、陳皮各12 g，清半夏10 g，甘草6 g。所有中藥飲片均來自河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，由醫(yī)院煎藥房按照要求，煎煮和濃縮成3.456、0.864 g/mL的湯劑。熒光定量PCR試劑盒(00382278)：TaKaRa公司；RNA逆轉錄試劑盒(Cat 638313)：Fermentas公司；蛋白提取試劑盒(P0011)：碧云天公司；抗體miR-155(Ab139805)、SOCS1(bs-4615R)、p-STAT3(10931)、PDCD4(F0413)和GAPDH(112438)：Cell Signaling公司；二抗(羊抗小鼠IG-HRP，ab97023)：武漢博士德生物工程有限公司；鼠TNF-α ELISA試劑盒(1403045)、鼠IL-6 ELISA試劑盒(1403079)、鼠IFN-γ ELISA試劑盒(1403026)：武漢博士德生物工程有限公司；Anti-miR-155：由廣州銳博生物科技有限公司設計和合成。

1.1.3 模型復制與動物分組 所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周，各組均予以自由飲水，ApoE小鼠給予全程高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)喂養(yǎng)，高脂飼料飼養(yǎng)8周，以復制AS模型。模型復制成功(小鼠主動脈壁可見明顯的斑塊形成)后將60只ApoE小鼠隨機分為5組，每組12只，均持續(xù)給藥8周。①模型組：ApoE小鼠全程高脂飼養(yǎng)，不進行任何干預。②miR-155抑制劑組：尾靜脈注射miR-155抑制劑，按30 mg/(kg·d)注射，每周1次，連續(xù)注射8周，期間給予高脂飼料。③miR-155模擬物組：尾靜脈注射miR-155模擬物，按30 mg/(kg·d)注射，每周1次，連續(xù)注射8周，期間給予高脂飼料。④血管軟化丸高劑量組：給予相當于70 kg成人12倍劑量[86.4 g/(kg·d)]的血管軟化丸，連續(xù)干預8周，期間給予高脂飼料。⑤血管軟化丸低劑量組：給予血管軟化丸21.6 g/(kg·d)，連續(xù)干預8周，期間給予高脂飼料。

1.1.4 樣品采集和病理形態(tài)學觀察 藥物干預8周后，頸椎脫臼法處死小鼠，沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈，選取近主動脈瓣附近主動脈壁，一部分固定于4%甲醛溶液中，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色；一部分置于-80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學等檢測。

1.1.5 qRT-PCR檢測各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平 將小鼠主動脈組織稱取質量后，加入適量Trizol，按試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行qRT-PCR反應。反應參數(shù)：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)，采用2-ΔΔC法計算目的基因的表達水平。以GAPDH為內參，基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.1.6 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平 采集小鼠血漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作方法檢測血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。

1.2 體外實驗

1.2.1 含藥血清制備和細胞分組 將20只雄性健康SD大鼠[體質量(300±20)g，購自南京大學模式動物研究所]隨機分為中藥組和對照組。中藥組給予高劑量[86.4 g/(kg·d)]血管軟化丸，對照組灌胃給予等量生理鹽水，每日早晚各1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，分離血清，離心，過濾除菌，分裝備用。采用ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞建立模型，以每孔1×10/mL將細胞鋪板于24孔板，分別加入5、10、20 μg/mL ox-LDL處理24 h。模型復制后按照干預方法分為4組。①對照組：對照組大鼠血清(RPMI 1640完全培養(yǎng)基)；②miR-155抑制劑組：模型復制后，參照脂質體2 000說明書將miR-155抑制劑轉染至RAW264.7細胞；③miR-155模擬物組：將miR-155模擬物轉染至RAW264.7細胞；④血管軟化丸含藥血清組：模型復制后采用血管軟化丸含藥血清干預。

1.2.2 血清干預和細胞轉染實驗

(1)含藥血清作用于RAW264.7細胞 將第3～5代RAW264.7細胞棄去培養(yǎng)基，用PBS溫和洗3遍，在37 ℃、5% CO孵箱中培養(yǎng)16 h，待鋪板率達50%，棄去培養(yǎng)基，分別加入血管軟化丸不同濃度(6.25、12.5、25 μg/mL)含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，最終選取血管軟化丸25 μg/mL含藥血清培養(yǎng)基干預，對照組給予空白血清完全培養(yǎng)基干預，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。

(2)細胞轉染實驗 按照文獻[4]方法轉染細胞。在無菌條件下，用含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基DMEM，將RAW264.7細胞(1×10/mL)接種于6孔板，于37 ℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱中孵育，備用。取miR-155抑制劑或miR-155模擬物(20 μmol/L) 6 μL和HiPerFect轉染試劑12 μL，滴入300 μL細胞培養(yǎng)基DMEM，使其終濃度為5 nmol/L。室溫下，放置5～10 min，形成轉染復合物。將轉染復合物分別均勻滴入上述接種細胞培養(yǎng)基中，待融合度約達到80%時，終止培養(yǎng)，刮取細胞，提取細胞RNA。

1.2.3 RT-PCR檢測RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平 收集RAW264.7細胞，分離提取總RNA，逆轉錄成cDNA，采用SYBR Green進行RT-PCR反應。反應參數(shù)：95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔC法計算樣本中目的基因表達水平。

2 結果

2.1 一般情況 飼養(yǎng)和給藥過程中，各組小鼠因撕咬致死1只，因灌胃致死1只，剔除離群值3只，最后進入統(tǒng)計的各組小鼠數(shù)量各為11只。

2.2 各組小鼠主動脈的組織形態(tài)學變化 模型組小鼠主動脈管徑厚薄不均勻，內膜不光滑，管壁細胞分布不整齊，有較小的AS斑塊。miR-155抑制劑組小鼠血管管徑厚薄不均勻，斑塊形成明顯，內皮下大量泡沫細胞形成，可見膽固醇結晶；AS斑塊可見染色較淺的無定形物、鈣化顆粒物，AS斑塊截面積顯著大于其他各組。miR-155模擬物組和血管軟化丸含藥血清組小鼠主動脈各層結構清晰，血管細胞排列較整齊，病變程度明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈的組織形態(tài)學變化(HE染色，10×20倍)

2.3 各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平比較 與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠主動脈miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組主動脈miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)。與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠主動脈p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)。血管軟化丸高、低劑量組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠主動脈miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA相對表達水平比較

2.4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較 與模型組比較，miR-155抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯升高(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸高、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯降低(

P

<0.05)；血管軟化丸高、低劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表3。2.5 血管軟化丸含藥血清對RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平的影響 與對照組比較，miR-155抑制劑組RAW264.7細胞中miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)，p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)，miR-155模擬物組和血管軟化丸含藥血清組RAW264.7細胞中miR-155和SOCS1 mRNA表達水平明顯升高(

P

<0.05)，p-STAT3和PDCD4 mRNA表達水平明顯降低(

P

<0.05)。見表4。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較

表4 含藥血清對RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可表達于活化的免疫細胞，通過增加黏附因子和趨化因子表達促進炎癥反應，并參與AS的發(fā)生發(fā)展過程。實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-155表達缺乏能夠降低巨噬細胞炎癥浸潤程度和抑制AS形成，而過表達miR-155則促進泡沫細胞的形成，促進炎癥反應，加速AS形成。PDCD4是一種腫瘤抑制因子，PDCD4能夠激活NF-κB，抑制IL-10表達，促進炎癥反應，誘導內皮細胞增殖和凋亡。SOCS1是一種炎癥負向調控因子之一，能夠負向調控各種炎癥反應，抑制TNF-α、IL-6、INF-γ等炎癥因子的產生，而miR-155能夠直接結合SOCS1，逆向調控巨噬細胞炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155通過調控SOCS1/p-STAT3炎癥信號通路調控PDCD4，影響TNF-α、IL-6、INF-γ的生成和AS發(fā)生。

高脂血癥可歸屬于中醫(yī)學“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀、毒等病理產物產生，壅塞脈道，沉積管壁，形成AS。本課題組結合中醫(yī)基礎理論及前期大量的臨床試驗，認為痰瘀證候是AS的主要證型，本研究所用血管軟化丸由保和丸化裁而成。方中山楂消食導滯，為君藥；黃芪補氣健脾，半夏健脾燥濕化痰，三七和丹參活血化瘀，共為臣藥；萊菔子下氣消食除脹，陳皮理氣和中，共為佐藥；甘草健脾和中，調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸可通過調控miR-467b靶向LPL調控巨噬細胞，減少炎癥因子分泌和巨噬細胞脂質蓄積，抑制AS發(fā)生發(fā)展。

本研究通過觀察血管軟化丸對miR-155和SOCS1/STAT3/PDCD4信號通路的調控，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達，從細胞、分子、組織水平多層次揭示血管軟化丸防治AS的作用靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，血管軟化丸能夠提高主動脈miR-155、SOCS1 mRNA表達水平，降低p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平，降低血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，本實驗結果與血管軟化丸通過抑制炎癥反應影響炎癥因子水平的既往結果一致。組織形態(tài)學觀察顯示，血管軟化丸組小鼠AS病變程度明顯輕于模型組，同時體外實驗也驗證了血管軟化丸含藥血清能夠提高ox-LDL損傷模型RAW264.7細胞中miR-155、SOCS1 mRNA表達水平，降低p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平。

本研究提示：miR-155能夠調控SOCS1-STAT3-PDCD4生物軸，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ 3種炎癥因子表達；血管軟化丸抗AS的分子機制可能與調控miR-155和SOCS1/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子水平有關。