翟夢婷，葛瑞瑞，王 翔，湯同娟，左夢雨，谷金繁，王 靚,2,3，周 鵬,2,3，黃金玲，2，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

隨著人口老齡化進程，中國心血管病患病率逐年升高，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的死亡率呈上升趨勢，AMI成為城鄉(xiāng)居民死亡的主要原因之一。臨床上部分AMI患者會出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，易被誤診為急腹癥。研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者出現(xiàn)胃腸道癥狀與心排出量降低、腸道低灌注的缺血性損傷及腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、腸道血管持續(xù)收縮密切相關(guān)。因此，探尋保護AMI后腸道缺血性損傷、改善腸功能的方法具有重要意義。

苓桂術(shù)甘湯出自漢代張仲景所著的《傷寒雜病論》，由茯苓、桂枝、白術(shù)和甘草4味中藥組成，具有溫陽健脾、利水化飲之功效。本團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯能夠抑制心肌細胞氧化應激損傷及細胞凋亡，抑制AMI后慢性心力衰竭大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子的過度激活，降低血清血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β水平，抑制模型大鼠心室重構(gòu)，改善心功能。但其能否減輕AMI所致腸道缺血性損傷，保護腸功能有待深入探討。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，觀察了AMI模型大鼠腸屏障功能變化及苓桂術(shù)甘湯對AMI大鼠腸黏膜屏障的保護作用。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0003]。大鼠每5只一籠，飼養(yǎng)于安靜且通風的房間，有充足的食物與水補給。本實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物實驗倫理委員會審查、批準。

1.2 藥物及試劑 茯苓(批號 2005181)、桂枝(批號 2005181)、甘草(批號 1911041)、白術(shù)(批號 2002202)：安徽普仁中藥飲片有限公司，參考文獻[6]方法，按原方質(zhì)量比例4∶3∶3∶2，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，制成干浸膏(4.8 g/g)，避光密封保存?zhèn)溆?；D-乳酸(批號 MM-0180R2)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(批號 MM-0647R1)、TNF-α(批號 MM-0180R1)、IL-6(批號 MM-0190R1)和IL-1β(批號 MM-0047R2)ELISA檢測試劑盒：武漢酶免生物科技有限公司；閉合蛋白(Occludin)兔單抗(批號 ab216327)：英國Abcam；帶狀閉合蛋白(zonula occludens-1，ZO-1)兔單抗(批號 AF5145)：中國Affinity；山羊抗兔IgG/HRP標記(批號 A21020)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑(批號 15596026)：美國Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 2690A)：日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒(批號 KM4101)：美國KAPA Biosystems公司。

1.3 主要儀器 ATOM全自動酶聯(lián)免疫工作站：意大利MAROCHE；FA2004B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；ECG-2303B數(shù)字心電圖機：廣州市三銳電子科技有限公司；YD-6L生物組織包埋機、YD-AB攤烤片機：金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；HM325切片機：美國賽默飛世爾科技；FCM凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；熒光定量PCR 儀：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 AMI模型復制 參考文獻[7]，采用冠狀動脈結(jié)扎法，大鼠乙醚麻醉后開胸，選用6-0眼科縫合線結(jié)扎距左冠狀動脈根3 mm處的冠狀動脈左前降支，術(shù)后大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)S-T段抬高伴肢體導聯(lián)R波高尖，視為模型復制成功，假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。

2.2 動物分組、給藥劑量及方法 將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組(生理鹽水)，苓桂術(shù)甘湯低、中、高劑量組(分別相當于臨床成人等效量的0.5、1、2倍)，每組12只，另有12只僅穿線未結(jié)扎大鼠被設(shè)為假手術(shù)組。灌胃給予苓桂術(shù)甘湯(容積為10 mL/kg)，假手術(shù)組與模型組給予等容積生理鹽水溶液。第28天大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后腹主動脈取血，分離血漿，剖取心臟、回腸，備用。

2.3 觀察指標與檢測方法

2.3.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察大鼠心臟及回腸組織病理變化 根據(jù)模型復制后大鼠死亡率和課題組其他實驗安排，隨機取6只大鼠心臟及回腸組織放入4%多聚甲醛，固定后脫水包埋，切片(厚度約4 μm)，進行HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察大鼠腸組織病理變化。

2.3.2 ELISA檢測血漿D-乳酸和LPS，回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量 根據(jù)模型復制后大鼠死亡率和課題組其他實驗安排，隨機取6只大鼠回腸組織，按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心法，在450 nm波長下測定各孔光密度，計算血漿中D-乳酸和LPS，回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量。

2.3.3 Western blot檢測大鼠回腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達水平 根據(jù)模型復制后大鼠死亡率和課題組其他實驗安排，隨機取6只大鼠回腸組織，加細胞裂解液，提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，80 V電泳30 min，120 V電泳90 min，轉(zhuǎn)膜封閉各2 h，一抗4 ℃孵育至少12 h，二抗孵育2 h，曝光，用Image J蛋白條帶分析軟件進行分析。實驗重復3次，計算大鼠回腸組織Occludin蛋白、ZO-1蛋白的相對表達水平。

2.3.4 實時熒光定量PCR法檢測大鼠腸組織Occludin mRNA、ZO-1 mRNA的表達水平 根據(jù)模型復制后大鼠死亡率和課題組其他實驗安排，隨機取6只大鼠回腸組織，用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增，采用2-ΔΔC法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。各基因引物信息見表1。

表1 Occludin、ZO-1的引物信息

3 結(jié)果

3.1 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠心臟組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列緊密整齊，橫紋、細胞核清晰；模型組大鼠心肌纖維腫脹且排列紊亂，有波浪型改變，炎癥細胞浸潤明顯；與模型組相比，不同濃度的給藥組在心肌細胞腫脹、排列結(jié)構(gòu)情況、炎癥細胞浸潤等方面均有不同程度的改善。其中，以苓桂術(shù)甘湯高劑量組改善最為明顯。結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯對AMI心肌缺血損傷具有明顯保護作用。見圖1。

3.2 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織病理形態(tài)學的影響 假手術(shù)組肉眼下腸道無脹氣，光學顯微鏡下觀察絨毛形態(tài)正常，腸黏膜完整，腺體排列緊密。模型組肉眼下腸道脹氣明顯，腸壁水腫充血，光學顯微鏡下可見腸黏膜脫落，絨毛變短且稀疏，腺體減少且排列疏松，周圍組織有散在紅細胞，大量炎癥細胞浸潤；苓桂術(shù)甘湯低劑量組大鼠腸黏膜脫落，絨毛變細且形態(tài)異常，腺體較模型組多；苓桂術(shù)甘湯中劑量組大鼠腸黏膜略有損傷，腺體排列整齊且緊密，中性粒細胞減少；苓桂術(shù)甘湯高劑量組大鼠腸黏膜完整，腸道形態(tài)接近正常，中性粒細胞明顯減少。見圖1。

注：箭頭所指的是小腸絨毛、小腸黏膜、腺體及中性粒細胞圖1 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠心臟、回腸組織病理形態(tài)的影響(HE染色，10×20倍)

3.3 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠血漿D-乳酸和LPS含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組D-乳酸和LPS含量顯著增加(

P

<0.05)。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低、中、高劑量組D-乳酸和LPS含量顯著減少(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，中劑量組LPS含量減少、高劑量組D-乳酸和LPS含量均減少(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯中劑量組比較，高劑量組D-乳酸和LPS含量均減少(

P

<0.05)。見表2。

表2 苓桂術(shù)甘湯對AMI大鼠血漿D-乳酸和LPS含量的影響

3.4 苓桂術(shù)甘湯對AMI后大鼠回腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Occludin、ZO-1蛋白表達水平均顯著降低(

P

<0.05)。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組Occludin蛋白表達水平升高，中、高劑量組Occludin、ZO-1蛋白表達水平均升高(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，高劑量組Occludin、ZO-1蛋白表達水平均升高(

P

<0.05)。見圖2、表3。3.5 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均顯著降低(

P

<0.05)。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低、中、高劑量組Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均顯著提高(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，中劑量組ZO-1 mRNA表達水平升高，高劑量組Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均升高(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯中劑量組比較，高劑量組Occludin、ZO-1 mRNA表達水平均升高(

P

<0.05)。見表4。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.苓桂術(shù)甘湯低劑量組；D.苓桂術(shù)甘湯中劑量組；E.苓桂術(shù)甘湯高劑量組圖2 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達水平的影響(Western blot法)

表3 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達水平的影響

表4 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織Occludin、ZO-1 mRNA表達水平的影響

3.6 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量均顯著增加(

P

<0.05)。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯低劑量組回腸組織TNF-α和IL-1β含量降低(

P

<0.05)，中、高劑量組回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量均顯著降低(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯低劑量組比較，中劑量組心臟組織TNF-α和回腸組織IL-6、IL-1β含量降低，高劑量組回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量降低(

P

<0.05)。與苓桂術(shù)甘湯中劑量組比較，高劑量組回腸組織TNF-α、IL-1β，心臟組織TNF-α含量均顯著降低(

P

<0.05)。見表5。

表5 苓桂術(shù)甘湯對AMI模型大鼠回腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β，心臟組織TNF-α含量的影響

4 討論

AMI是引起心力衰竭和心源性死亡的重要原因之一，近年來心臟與腸道之間關(guān)系的研究受到廣泛關(guān)注。AMI發(fā)病后，心肌缺血低氧而壞死，為清除壞死細胞碎片，炎癥細胞向梗死區(qū)域募集，心肌組織中TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子釋放增加。過度激活的炎癥細胞因子，加重心肌損傷、心室重構(gòu)，導致心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和泵血功能異常，進而發(fā)展為心力衰竭。同時，由于心輸出量減少，腸道血流量降低，腸黏膜缺血低氧而發(fā)生缺血性損傷，進而引發(fā)腸屏障功能受損。

腸黏膜屏障由機械、免疫、化學和生物4個結(jié)構(gòu)與功能各異的屏障組成，將腸腔內(nèi)容物與宿主有選擇性地分離，阻止腸道內(nèi)細菌、毒素入侵血液，維持機體穩(wěn)態(tài)。D-乳酸是由腸道乳酸桿菌、擬桿菌屬等多種腸道細菌發(fā)酵形成的代謝產(chǎn)物，在腸道黏膜屏障完整時，血液中D乳酸含量極低，當腸黏膜屏障功能受損時，大量D-乳酸透過腸黏膜屏障移行入血，血中D-乳酸水平可反映腸黏膜損害程度和通透性變化。革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜的重要組成部分LPS在腸道通透性增加時，移位進入體循環(huán)，導致體內(nèi)多種炎癥遞質(zhì)如TNF-α、IL-6和IL-1β過度分泌、釋放。腸黏膜屏障中機械屏障由腸上皮細胞及其細胞間連接構(gòu)成，其中緊密連接是最重要的細胞間連接，屬于不通透連接。緊密連接蛋白是緊密連接的主要組分，由Claudin蛋白、Occludin蛋白、連接黏附分子與ZO-1及細胞骨架等組成，能有效維持腸屏障功能及調(diào)節(jié)腸黏膜通透性。AMI時腸道缺血低氧，細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，細胞間隙增大，導致腸黏膜屏障功能障礙。

AMI屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”等范疇，系本虛標實之證。心者，君主之官，主血脈，賴陽氣以推動血液在脈道中運行。心陽氣虛、陰寒凝結(jié)是本病重要的病理機制，血瘀、飲停為標是其主要的病理環(huán)節(jié)。心與小腸相表里，二者經(jīng)脈相連、氣血相通、功能相互協(xié)調(diào)。心陽氣虛、行血無力，則臟腑失其濡養(yǎng)，而致小腸功能失調(diào)。苓桂術(shù)甘湯內(nèi)寓桂枝甘草湯，乃張仲景用以溫心陽者，柯琴《傷寒附翼》視之為“補心陽之竣劑”；桂枝、茯苓相輔，則溫陽化氣，消飲寧心，王子接《絳雪園古方選注》所謂“通陽滲泄，保心氣以御水凌”者也；白術(shù)協(xié)茯苓，培土以制水。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯既能減少AMI 4周后模型大鼠心肌組織炎癥細胞浸潤，減輕心肌纖維腫脹及排列紊亂，抑制心肌組織細胞因子TNF-α過表達，同時又能降低血漿中D-乳酸和LPS的水平，降低回腸TNF-α、IL-6、IL-1β含量，上調(diào)回腸Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA表達水平。苓桂術(shù)甘湯的效應呈劑量依賴性，以高劑量的效應最優(yōu)。結(jié)果表明苓桂術(shù)甘湯可通過促進腸道緊密連接蛋白及基因表達，保護大鼠腸黏膜屏障功能完整，降低腸道通透性，減少內(nèi)毒素移位入血，抑制炎癥細胞因子過度釋放，減輕AMI后腸黏膜屏障損傷，保護腸道功能。本研究為苓桂術(shù)甘湯治療AMI提供了實驗依據(jù)，AMI后腸功能的動態(tài)變化及苓桂術(shù)甘湯的干預作用正在研究中。