韓 萌，楊勁峰*，謝 芳，李 娜，戴 健，王 月，魯 豫，韓曉日*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院/土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北玉米營養(yǎng)與科學(xué)觀測實驗站，遼寧沈陽 110866；2 鶴崗市農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，黑龍江鶴崗 154101）

硫是所有植物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素之一，其含量影響著土壤中各種生物化學(xué)反應(yīng)以及植物的正常生長發(fā)育[1]。表層土壤中的硫大部分以有機硫的形態(tài)存在，無機硫占的比例很小，而多數(shù)有機硫必須礦化為SO42–的形態(tài)才能被作物吸收利用[2]。有機硫可以分為碳鍵硫、酯鍵硫以及未知態(tài)硫，碳鍵硫和酯鍵硫?qū)χ参锸怯行У?，且對?dāng)季作物來說，碳鍵硫的有效性低于酯鍵硫，未知態(tài)硫?qū)χ参锏挠行赃€不明確[3-6]。也有研究表明，土壤有機硫含量影響著土壤有效硫的有效性，植物吸收的土壤有機硫占其吸收所有土壤硫的45%[7-8]。因此有機硫是土壤中硫的重要組成部分之一，其有效性評價與土壤微生物活動和生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過程以及土壤硫元素循環(huán)均有密切相關(guān)性[9-10]。

土壤硫的礦化主要取決于土壤的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特性，而物理性質(zhì)對土壤硫的影響很小[11]。有機硫礦化過程會發(fā)生一系列的生物學(xué)以及生物化學(xué)反應(yīng)，受土壤性質(zhì)、微生物活性、微生物及作物根系分泌物質(zhì)等因素的影響[12]。而酶是土壤硫礦化的催化劑，Riffaldi等[13]研究發(fā)現(xiàn)潛性礦化硫與硫酸鹽水解酶、芳基硫酸酯酶、蛋白酶和脫氫酶的活性顯著相關(guān)。國內(nèi)外許多研究結(jié)果均表明，植物有效硫的來源主要是土壤有機硫。有試驗表明作物的生長期越長，有效硫的地位就越重要[14]。Freney等[15]的研究表明，在土壤中施用適量硫肥的處理有機硫的礦化更為劇烈，而有機硫礦化劇烈，礦化形成的無機硫酸鹽含量提高，更有利于植物的吸收。有研究表明種植作物也許會刺激土壤有機硫的礦化，種植作物后比種植作物前土壤有機硫的礦化量提高[16-17]。

長期施肥有機硫轉(zhuǎn)化的研究在紅壤、潮土、黑土、褐土、草甸土等土壤類型的報道較集中[18-22]，而棕壤長期定位施肥有機硫變化研究比較少，并且長期定位施肥有機硫研究方面的種植制度多為短期或連作制度，對于輪作的研究較少，但很多試驗證明土壤有機硫的礦化過程與地上作物的種植有密切關(guān)系。棕壤是我國重要的土壤類型，更是遼寧省主要土壤類型，目前對于長期施肥條件下，采用玉米–玉米–大豆輪作方式棕壤有機硫礦化特征有待深入研究，外界因子如溫度、pH、有機碳、酶活性等是否會對有機硫礦化產(chǎn)生明顯驅(qū)動均不十分清楚。關(guān)于長期定位試驗對土壤硫的影響研究大多是側(cè)重于硫元素的有效性，而對土壤供硫潛力等的研究不多。國內(nèi)外關(guān)于長期定位施肥的土壤研究比短期肥料試驗或盆栽試驗少得多，對于影響有機硫礦化的因素的研究也不夠詳細(xì)[23-26]。故依托沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)于1979年建立的棕壤肥料長期定位試驗，系統(tǒng)地研究長期(36年) 不同處理玉米–大豆輪作體系中土壤有機硫礦化特征及其主要驅(qū)動因子。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)位于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)棕壤肥料長期定位試驗基地，試驗始建于1979年，持續(xù)有36年?；匚挥谒蛇|平原南部的中心地帶，屬于溫帶濕潤–半濕潤季風(fēng)氣候，年平均降雨量為574～684 mm，平均氣溫7.0℃～8.1℃，無霜期為148～180天。試驗從1979年開始，采用有機肥和無機肥不同處理配合及玉米–玉米–大豆輪作種植體系。土壤是發(fā)育在第四紀(jì)黃土性母質(zhì)上的簡育濕潤淋溶土，1979年試驗前土壤的基本化學(xué)性質(zhì)為pH 6.5、有機碳9.18 g/kg、全氮 0.80 g/kg、堿解氮 105.5 mg/kg、全磷 0.38 g/kg、有效磷 6.5 mg/kg、全鉀 21.1 g/kg、速效鉀97.9 mg/kg[27-28]。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用裂區(qū)設(shè)計，分為化肥、低量有機肥和高量有機肥3個區(qū)組，共15個施肥處理，小區(qū)面積為 160 m2。本研究選用其中的 7 個處理：1) 不施肥(CK)；2) 低量化學(xué)氮肥 (N1)；3) 高量化學(xué)氮肥(N2)；4) 低量化學(xué)氮+磷肥 (N1P)；5) 低量化學(xué)氮+磷鉀肥 (N1PK)；6) 低量有機肥 (M1)；7) 低量有機肥+低量化學(xué)氮+磷鉀肥 (M1N1PK)。具體養(yǎng)分投入量見表1。

表 1 玉米和大豆季有機肥和化肥投入量 (kg/hm2)Table 1 Manure and chemical fertilizer inputs in maize and soybean season

有機肥采用腐熟的豬廄肥 (干重，平均養(yǎng)分含量為有機質(zhì) 119.6 g/kg、N 5.6 g/kg、P2O58.3 g/kg、K2O 10.9 g/kg)，供試氮磷鉀肥為尿素 (N 46%)、過磷酸鈣(P2O512%、S 1.87%) 和硫酸鉀 (K2O 50%、S 8.79%)，所有肥料均作為基肥在播種前一次施入。種植制度為玉米–玉米–大豆輪作，一年一熟。1992年起，種植大豆不再施有機肥。2014年大豆品種為沈農(nóng)16號，密度150000株/hm2；2015年玉米品種為東單6531，密度60000株/hm2。

1.3 試驗樣品采集

定位試驗每年作物收獲后，每個小區(qū)分設(shè)3個次級小區(qū)，每個次級小區(qū)面積30 m2，作為每個處理的重復(fù)。每個次級小區(qū)隨機選取5點，采集不同層次土壤樣本，組成混合樣，風(fēng)干，保存于專用定位樣本室，用于各項指標(biāo)分析。本研究選取2014和2015 年耕層土壤 (0—20 cm) 樣本進(jìn)行各項指標(biāo)分析，土壤常規(guī)化學(xué)指標(biāo)見表2。

表 2 長期施肥條件下大豆季和玉米季土壤化學(xué)指標(biāo)Table 2 Soil chemical properties in soybean and maize seasons under long-term fertilization

1.4 測定項目

1.4.1 土壤基本理化指標(biāo)的測定 pH采用水土比2.5∶1浸提，pH計 (PHS-3C型，上海雷磁) 測定；有機碳、全氮采用元素分析儀 (Vario EL III，Germany) 測定。

1.4.2 有機硫礦化試驗 礦化培養(yǎng)試驗參照Pirela等[29]方法進(jìn)行。稱取風(fēng)干土樣30 g，石英砂30 g，將兩者充分混合后置于淋濾管內(nèi)，盡量保證淋濾管內(nèi)的土樣與石英砂均勻且松緊度一致。同一土樣分別設(shè)置3次重復(fù)。為去除土壤之前礦化的硫酸鹽，我們采用0.01 mol/L的CaCl2溶液浸潤土壤平衡12 h后，再用0.01 mol/L的CaCl2溶液徹底的淋洗試驗土壤，直至土壤再無SO42–被淋洗出來即可開始淋濾試驗。為防止在添加溶液時會使淋濾管內(nèi)土壤濺起，在傾倒溶液時在土壤表面覆蓋一層濾紙，并且為淋濾管配置蓋子以防止其中水分蒸發(fā)。將準(zhǔn)備好的淋濾管分別放入20℃和30℃培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)第 2、4、6、8、10、12、14 周后，采用 75 mL CaCl2溶液淋洗，淋洗出的液體定容至100 mL容量瓶中后過濾，利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀 (ICP-AES) 測定其中硫酸鹽的含量。

1.4.3 芳基硫酸酯酶 (S-ASF) 與中性蛋白酶 (S-NPT)的測定 土壤芳基硫酸酯酶和中性蛋白酶分別采用S-ASF和S-NPT活性檢測試劑盒，處理風(fēng)干土壤樣本，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)說明進(jìn)行各項操作，最后采用酶標(biāo)儀 (Epoch，Bio Tek，USA)分別在 410和680 nm處比色測定。

1.4.4 土壤有機硫礦化動力學(xué)模型及其參數(shù)計算根據(jù)礦化淋濾試驗所得數(shù)據(jù)，通過一級動力學(xué)方程計算得出有機硫的礦化潛力、礦化速率常數(shù)以及礦化半衰期。一級動力學(xué)方程為：

St=S0[1?exp(?kt)]

式中，S0為潛在礦化勢；St為一定時間土壤硫累積礦化量；k為一級動力學(xué)常數(shù)；t為培養(yǎng)時間 (周)；t0.5為常數(shù)，代表礦化半衰期，潛在礦化勢S0被礦化50%所需的時間 (周)。參數(shù)S0和k用下述方法求得。先將上式轉(zhuǎn)化為：

S0?St=S0exp(?kt)

等式兩端同時取對數(shù)，得：

ln(S0?St)=lnS0?kt

變形后的公式雖然是一直線型公式，但由于等式兩端均含有欲求參數(shù)S0，所以需要先估算—S0代入公式左端后，以最小二乘法計算出公式右端的兩參數(shù)S0和k；然后再將這一剛剛求出的S0代回等式左端進(jìn)行第二次計算，以最小二乘法求得新的等式右端的S0和k，如此反復(fù)迭代計算，直至前后兩次求出的S0相對誤差小于0.0001，此時求得S0和k即為一級動力學(xué)方程式中的兩參數(shù)。根據(jù)S0和k即可計算出t0.5(t0.5=0.693/k)[30]。

1.4.5 芳基硫酸酯酶及中性蛋白酶活力計算 1) 芳基硫酸酯酶：

每天每克土樣中產(chǎn)生1 μmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

式中：T—反應(yīng)時間，1 h=1/24 天；V反總—反應(yīng)體系總體積，2.625×10–4L；W—樣本質(zhì)量，0.05 g。

2) 中性蛋白酶：每天每g土樣中產(chǎn)生1 mg酪氨酸為一個S-NPT活力單位。

式中：C標(biāo)準(zhǔn)管—標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.05 mg/mL；V反總—反應(yīng)體系總體積，0.2 mL；T—反應(yīng)時間，30 min 為 1/48 天；W—樣本質(zhì)量，0.01 g。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016作圖和SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和鄧肯法進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和作物對土壤有機硫礦化量的影響

由圖1可以看出，20℃條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，有機硫礦化量逐漸增加；前4周礦化速率較快，土壤中有機硫大量進(jìn)行礦化分解，分解量占總分解量的37.26%～56.01%，此后礦化量增幅變緩。不同施肥處理對有機硫礦化量的影響各不相同，7 個處理的總體變化趨勢為 M1N1PK > M1>N1PK、N1、N2> N1P > CK。與 CK 相比，施用氮肥后，有機硫礦化量明顯增加，但隨著化學(xué)氮肥施用量的增加，有機硫礦化量沒有明顯變化。在只施用化肥的處理中，N1、N2和N1PK有機硫礦化量沒有明顯差別，但N1P處理的土壤有機硫礦化量卻比其它處理降低了11.27%～12.70%。M1處理有機硫礦化量明顯增加，較CK處理增加了47.92%，較單施化肥處理增加了3.78%～18.87%。M1N1PK處理有機硫礦化量在所有處理中最高，比CK處理提高了57.30%，比其它處理提高了6.34%～26.41%。30℃條件下，有機硫礦化總體趨勢與20℃條件下相同，但有機硫礦化量整體都高于20℃條件下，平均增加幅度在6.20%～9.62%，溫度升高有利于有機硫的礦化。玉米季有機硫礦化量總體趨勢與大豆季相同，但有機硫礦化量總體比大豆年份高出6.17%～9.61%，玉米種植季有機硫礦化量高于大豆種植季。

圖 1 礦化培養(yǎng)試驗不同溫度和作物下各處理土壤有機硫礦化量的變化Fig.1 Mineralization amount of soil organic sulfur in each treatment under different temperatures and crops in the laboratory culture test

2.2 有機硫礦化的動力學(xué)特征

一般土壤有機硫的累計礦化量與礦化時間之間符合一級動力學(xué)模型[30-31]，用一級動力學(xué)方程對土壤有機硫累計礦化量和培養(yǎng)時間進(jìn)行擬合，得到土壤有機硫潛在的礦化量，即土壤有機硫礦化勢 (S0) 和礦化常數(shù) (k)[17]。

由表3可以看出，不同處理有機硫礦化采用一級動力學(xué)方程擬合效果比較好 (r> 0.938)[17]。在20℃的條件下，施肥處理的土壤有機硫礦化勢均高于CK。隨著化學(xué)氮肥施用量的增加，有機硫礦化勢有所提高，但僅提高了0.03%。采用氮磷配合施用時，土壤礦化勢有所降低，與單施氮肥相比降低了1.71%～2.01%；采用氮磷鉀配合施用時，土壤有機硫礦化勢與單施氮肥或氮磷配施相比均有所提高。M1處理的土壤有機硫礦化勢明顯高于其它所有施肥處理，提高了13.55%～45.27%。M1N1PK處理的有機硫礦化勢低于單施有機肥的處理，但高于單施化肥的處理，盡管有機肥配施氮磷鉀處理土壤礦化量最高(圖1)，但其礦化勢卻低于單施有機肥處理，有可能是添加了氮磷鉀化肥后，作物根系生長旺盛，促進(jìn)了根系分泌物增多，提高了土壤中微生物活性，從而提高了其礦化量。在30℃的條件下，土壤有機硫礦化勢總體變化規(guī)律與20℃條件下相同，但30℃下的土壤有機硫礦化勢整體高出1.29%～6.61%?？梢钥闯?，溫度的升高有利于土壤中有機硫的礦化。

表 3 大豆年份不同溫度下有機硫礦化動力學(xué)方程參數(shù)Table 3 Kinetic equation parameters of organic sulfur mineralization under different temperatures in soybean season

由表4可以看出，玉米年份土壤礦化勢在不同培養(yǎng)溫度與處理之間的規(guī)律與大豆年份基本相同。對比表3、表4，土壤的有機硫礦化勢呈增長趨勢，20℃條件下，種植玉米的年份有機硫礦化勢比種植大豆的年份提高了3.27%～6.19%，30℃條件下提高了0.23%～8.01%。

表 4 玉米年份不同溫度下有機硫礦化動力學(xué)方程參數(shù)Table 4 Kinetic equation parameters of organic sulfur mineralization under different temperatures in maize season

2.3 有機硫礦化關(guān)鍵酶活性變化

由圖2可知，在種植大豆的年份，與CK相比，除M1處理外，其余各施肥處理均顯著提高了土壤中性蛋白酶的活性。單施化肥各處理 (N1、N2、N1P) 之間差異不顯著，但N1PK處理的土壤中性蛋白酶活性顯著高于其它單施化肥處理。M1N1PK處理的土壤中性蛋白酶活性顯著高于單施化肥處理96%～220%；但單施有機肥處理中性蛋白酶活性卻顯著低于其它施肥處理34.78%～79.59%。在玉米種植季，中性蛋白酶活性大體趨勢與種植大豆的年份相似，但單施化肥的各個處理 (N1、N2、N1P、N1PK) 之間差異不顯著，且中性蛋白酶活性整體高于種植大豆的年份2.16%～60.69%。

圖 2 棕壤有機硫礦化關(guān)鍵酶活性變化Fig.2 Changes of key enzyme activities of organic S mineralization in brown soil

在種植大豆的年份，除N2處理外，其它施肥處理均顯著提高了土壤芳基硫酸酯酶活性。隨著化學(xué)氮肥施用量的增加，土壤芳基硫酸酯酶活性沒有顯著變化。在單施化肥的處理中，N1和N2之間差異不顯著，N1P和N1PK處理的土壤芳基硫酸酯酶活性顯著高于N1和N2兩個處理，其中N1PK處理的土壤芳基硫酸酯酶活性最高。M1處理土壤芳基硫酸酯酶活性顯著高于除N1PK處理外單施化肥的各個處理，M1N1PK處理的土壤芳基硫酸酯酶活性最高，遠(yuǎn)高于其它任何一個處理，提高了264%～986%。在種植玉米的年份，與CK相比，各施肥處理均顯著提高了土壤芳基硫酸酯酶活性；其變化趨勢與種植大豆的年份相同。

2.4 有機硫累積礦化總量與土壤性質(zhì)的關(guān)系

由表5可以看出，種植大豆的年份有機硫累積礦化總量盡管受溫度影響較大，隨著溫度增高有機硫礦化量增加，但與土壤pH、有機碳以及全氮含量相關(guān)性均不顯著。種植玉米的年份有機硫累積總礦化量與土壤有機碳含量和全氮含量呈顯著正相關(guān)，其礦化總量受土壤有機碳和全氮含量影響較大；與土壤pH沒有顯著相關(guān)性。利用7個處理不同年份的作物籽粒產(chǎn)量與不同溫度下有機硫礦化總量進(jìn)行線性擬合發(fā)現(xiàn)，r值在0.39～0.70，盡管隨著有機硫礦化總量的增加，作物產(chǎn)量有增加趨勢，但均未達(dá)到顯著差異水平。

表 5 大豆和玉米季土壤pH、有機碳、全氮含量與有機硫累積礦化總量的關(guān)系Table 5 Relationship between soil pH, organic carbon, total nitrogen and cumulative total mineralization of organic sulfur in soybean and maize seasons

3 討論

土壤有機硫礦化是土壤有效硫的重要來源，在土壤中有機硫的礦化與有效硫的固定是同時進(jìn)行的兩個過程。在這個動態(tài)平衡中土壤微生物發(fā)揮著重要作用，影響微生物活性的因素，如溫度、水分、可利用碳源等都影響著平衡點的變化[32]。本研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，有機硫累積礦化量與時間呈直線關(guān)系，溫度升高使有機硫累積礦化量增加，這與Pirela等[29]的研究結(jié)果基本一致。不同的是本研究中的土壤有機硫礦化較快，在第4周時就達(dá)到了礦化總量的50%左右，而Pirela等[29]的研究中，20℃和30℃下14周的礦化量分別占有機硫總量的1.2%～9.8%和2.4%～17.5%，這可能由于土壤類型、作物種類、試驗?zāi)晗薏煌瑢?dǎo)致的。Pirela等[29]培養(yǎng)研究表明，20℃和30℃下開放培養(yǎng)土壤有機硫累積礦化量與時間也呈直線關(guān)系。一般認(rèn)為溫度在10℃時，礦化作用明顯受阻礙，在20℃～40℃，礦化量隨溫度升高而增加，40℃以上又降低。本研究中未設(shè)定10℃和40℃，因為根據(jù)當(dāng)?shù)刈魑锷L氣候條件，一般5月初種植，9月末收獲，溫度一般極少會出現(xiàn)低于10℃或高于40℃。

不同施肥措施對棕壤有機硫的礦化特征有明顯的影響。對照處理由于長期 (36年) 不施肥，作物吸收的硫主要是土壤中原有的硫素，使土壤硫的儲量下降，土壤有機硫礦化能力下降。單獨施加有機肥和有機肥配施氮磷鉀肥的處理土壤有機硫礦化量高于其它處理，主要原因是有機肥本身攜帶一部分有機硫，致使土壤有機硫庫增大；其次有機肥在礦化分解和腐殖化過程中均需要微生物的參與，土壤微生物活力增高，有機硫礦化加快[30]。本研究中，有機硫礦化勢最高的是單獨施加有機肥的M1處理，其次才是M1N1PK處理，這與遲鳳琴等[30]研究結(jié)果一致，黑土的有機硫礦化勢在20℃和30℃時以施用有機肥的M處理為最大，其次為MNPK處理，再次為NPK處理，而以未施肥處理CK為最小?？梢?，棕壤有機硫礦化規(guī)律與黑土較為類似，施用有機肥使土壤中有機硫含量增高，其礦化勢也會變大，即供硫潛力越大。

蛋白酶是影響土壤中氮元素的主要酶之一，其生物活性會影響土壤中氮的轉(zhuǎn)化過程，而土壤中的碳、氮含量對土壤硫均有很大的影響，并且蛋白酶的活性與其它硫轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的活性之間存在一定程度的相互關(guān)系，也會對有機硫的礦化過程產(chǎn)生影響[33]。在本試驗條件下，兩種酶的變化規(guī)律各有不同，從整體來看，長期施肥處理均可提高中性蛋白酶和芳基硫酸酯酶的活性，說明施肥對提高兩種酶的活性有促進(jìn)作用，效果最好的為有機肥配合化肥處理。

大部分研究表明，土壤硫的礦化與土壤pH相關(guān)性不顯著[10, 13, 29, 34]，也有研究發(fā)現(xiàn)不同土壤硫礦化與pH既呈正相關(guān)，也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[35]。Ghani等[31]發(fā)現(xiàn)在10周的培養(yǎng)期間14%～54%的新形成的有機硫被礦化。有機物質(zhì)的C/S值也會影響硫的釋放或固定，C/S值為200時礦質(zhì)化占優(yōu)勢，土壤凈獲得SO42–；C/S值大于400時，以固定作用為主，發(fā)生SO42–的凈丟失；C/S 值在 200～400，SO42–既不丟失也不獲得。所以土壤有機碳可通過影響土壤中的C/S值來促進(jìn)土壤有機硫的礦化。有機碳可以促進(jìn)土壤團聚體的形成[36-39]。有研究發(fā)現(xiàn)，全氮對土壤團聚體的形成有很大影響[40]，并且土壤中95%的全氮以有機態(tài)存在，這有利于有機–無機膠結(jié)作用，土壤團聚體有利于養(yǎng)分的保存，可以改善土壤不良物理性狀。因此有利于土壤微生物的活動，提高土壤微生物的活性，使有機硫礦化加快。本研究結(jié)果表明，在30℃時長期施肥棕壤有機硫礦化量主要受土壤有機碳含量和土壤全氮含量影響，而與土壤pH無關(guān)。這也有可能是受土壤C/S值或土壤全氮含量影響團聚體而導(dǎo)致的直接或間接效果。通過了解長期施肥土壤有機硫礦化的主要驅(qū)動力，提高硫素生物效應(yīng)，發(fā)揮C、N、S協(xié)同效應(yīng)，有效提高棕壤土壤肥力，保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

土壤中有機碳和全氮是棕壤有機硫礦化的主要驅(qū)動力。只施用無機肥對土壤有機硫的礦化沒有明顯影響，而有機無機肥配合施用可顯著提高土壤芳基硫酸酯酶、中性蛋白酶活性，進(jìn)而提高有機硫礦化勢和礦化量。玉米因其較高的生物量也成為有機硫礦化的主要驅(qū)動力。