蔣希芝，徐 磊，張 蓓，辛向東，Thomas Attaribo，桂仲爭※

（1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，南京 210014；3. 江蘇銀寶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院有限公司，鹽城 224014）

0 引 言

桑椹為多年生木本植物桑樹（Morus albaL.）的成熟果穗，又名桑葚子、桑果、桑棗等。桑椹不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，而且富含多種具有生物活性的化合物，如黃酮、生物堿、多糖等多種生物活性成份[1-2]?；ㄇ嗨厥巧ｉ┲泻控S富的重要活性成分之一，也是天然色素的重要來源之一[3]?；ㄇ嗨厥蔷哂杏H水性和水溶性的多酚類植物色素及其代謝產(chǎn)物，是重要的抗氧化劑之一[4-5]，具有廣泛的藥理特性，如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌和抗癌[6-10]，因此，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[11]。桑椹果實(shí)中花青素主要有4種存在形式，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（P3G）、矢車菊素-3-O-蕓香苷（C3R）和天竺葵素-3-O-蕓香苷（P3R）。C3G和C3R是桑椹花青素中的主要成分[12]。

然而，花青素在加工過程中很不穩(wěn)定，易受多種不同外部條件影響[13-14]。溫度和光照是影響花青素降解穩(wěn)定性的重要因素，顯著降低其穩(wěn)定性和生物活性[15]。Fracassetti等[16]觀察發(fā)現(xiàn)花青素在25和42 ℃下的前14 d降解量緩慢，為3%，而在60和80 ℃下的第3天則降解很快，分別為60%和85%。加熱處理可將花青素或其結(jié)合糖苷分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]。影響花青素穩(wěn)定性的另一個(gè)重要因素是pH值。Rein等[18]證明，花青素水溶液在不同的pH值下存在4種形式的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致不同顏色的存在。特別是在弱酸性到中性范圍內(nèi)，穩(wěn)定性大大降低。此外，金屬離子[19]、糖含量[20]和過氧化氫[21]也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性。因此，花青素相對(duì)較低的穩(wěn)定性是限制其廣泛有效應(yīng)用的關(guān)鍵缺陷和主要障礙[22-24]，盡可能減少花青素的降解，提高其穩(wěn)定性尤為重要。

為了提高花青素的穩(wěn)定性，已報(bào)道的修飾方法有糖基?；痆25]、糖基化[26]、微膠囊化[27]、金屬螯合[28]、脂質(zhì)體[29]和納米粒子載覆[30-31]。從營養(yǎng)學(xué)角度分析，普通的化學(xué)修飾定向性差，而生物酶法反應(yīng)過程不會(huì)對(duì)花青素分子造成破壞，具有更高的安全性，更符合農(nóng)業(yè)食品安全要求，而且生物酶具有高度選擇性和專有性。因此，生物酶法更適合對(duì)花青素分子進(jìn)行酰基化修飾[32]。目前，有關(guān)生物酶法對(duì)桑椹花青素?；揎楑r有報(bào)道。

因此，本研究選取成熟桑椹果實(shí)，提取純化制得桑椹花青素。采用生物酶法，對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?；磻?yīng)，并與非?；幕ㄇ嗨剡M(jìn)行對(duì)比分析，考察脂肪酶、反應(yīng)溶劑、酰基供體對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率的影響，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。此外，進(jìn)一步分別研究溫度、光照、pH值等條件對(duì)?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)和性能的影響，測定?；ㄇ嗨氐目寡趸钚裕ㄇ宄鼶PPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力、總還原能力、Fe2+鰲合能力等，并與合成前花青素進(jìn)行比較，探討?；瘜?duì)花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響，從而為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試桑椹，采自江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國家桑資源圃基地。所摘桑椹為成熟度相近，形狀大小均一，無霉?fàn)€變質(zhì)，無病蟲害的新鮮桑椹。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C21H21ClO11）標(biāo)準(zhǔn)品由上海麥克林生化科技有限公司提供；甲醇、乙腈，均為色譜純，購于德國默克公司；南極假絲酵母脂肪酶、Amano脂肪酶PS購于美國Sigma公司；米曲霉脂肪酶購于美國Aladdin公司；豬胰腺脂肪酶、大孔吸附樹脂（D101）、無水乙醇、吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯、4A分子篩、氯化鉀、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸購于上海中試化工總公司，以上試劑均為分析純；DPPH購于日本TCI公司，三氯乙酸、菲洛嗪購于上海生工，氯化亞鐵購于沃凱，以上試劑均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-3200PC紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo；HPLC 1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent；LC 1260 MS G6420A高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，美國Agilent；QTRAP 6500質(zhì)譜分析儀，美國SCIEX。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物酶催化合成?；ㄇ嗨?/p>

采用生物酶法對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?；磻?yīng)。

選取南極假絲酵母脂肪酶（5 000 U/g）、Amano脂肪酶PS（Pseudomonas，30 000 U/g）、米曲霉脂肪酶（300 000 U/g）、豬胰腺脂肪酶（500 U/g）作為輔助花青素?；拇呋?，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg、苯甲酸甲酯0.5 mol/L，分別加入酶活力1 000 U的不同的脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

選取吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮作為酶催化?；磻?yīng)溶劑，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg，苯甲酸甲酯0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，分別加入吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為?；w，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg，加入苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯各0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

1.3.2 高效液相色譜分析花青素含量

樣品在去離子水中稀釋后，進(jìn)入配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測器的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。在20 ℃下，使用反相色譜柱（Poroshell 120 EC-C18，4.0μm，4.6 mm×150 mm）測定花青素的含量。設(shè)置流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量2.0μL。流動(dòng)相為1%甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈溶液（B）。試驗(yàn)在以下條件下進(jìn)行：0～2.50 min，線性梯度從8%到12%B；2.50～5.00 min，線性梯度從12%到18%B；5.00～10.10 min，線性梯度從18%到20%B；10.10～12.00 min，線性梯度從20%到80%B；12.00～14.00 min，80%B；14.00～14.10 min，線性梯度從80%到8%B；14.10～18.00 min，8%B；最后，在下一次注射之前清洗并重新平衡色譜柱。分析期間，所有樣品均保持在4 ℃，于520 nm處檢測花青素。

1.3.3 花青素轉(zhuǎn)化率和保留率測定

花青素?；D(zhuǎn)化率：采用高效液相色譜（HPLC）測定花青素?；磻?yīng)后的出峰面積，根據(jù)公式（1）計(jì)算轉(zhuǎn)化率[32]：

式中C為花青素?；D(zhuǎn)化率；S1為反應(yīng)后液相色譜中C3G的出峰面積；S2為反應(yīng)后新生成的C3G?；a(chǎn)物的出峰面積。

花青素保留率：采用高效液相色譜（HPLC）分別測定花青素酰基化前后的出峰面積，根據(jù)公式（2）計(jì)算保留率[32]：

式中P為花青素酰基化保留率；S0為反應(yīng)前液相色譜中C3G的出峰面積。

1.3.4 ?；ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)分析

利用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transformation Infrared Spectra，F(xiàn)TIR）和紫外-可見光風(fēng)光光度計(jì)進(jìn)行?；Y(jié)構(gòu)的初步分析。在衰減全反射模式（Attenuated Total Reflection mode，ATR）下，用Nicolet-iS50紅外光譜儀對(duì)復(fù)合前后樣品的特征吸收峰進(jìn)行了表征。其中，波數(shù)范圍為525～4 000 cm-1，溫度為25 ℃。

借助紫外可見分光光度計(jì)（Ultraviolet-Visible Spectrophotometer，UV-Vis）對(duì)花青素溶液進(jìn)行漫反射光譜測定，波長范圍200～600 nm，掃描速度中等，狹縫寬度20 nm，采樣間隔2.0 nm。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

熱穩(wěn)定性：用去離子水將?；臀歹；幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛?，pH值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液避光密封于離心管中，分別在40、50、60 ℃的溫度下，避光水浴熱處理12 h，研究溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。采用紫外-可見光分光光度計(jì)，在520 nm處測定花青素含量。根據(jù)公式（3）計(jì)算花青素保留率[33]：

式中R為花青素保留率；A0為加熱開始時(shí)的吸光度（t=0）；At為時(shí)間t時(shí)的吸光度。

光穩(wěn)定性：用去離子水將?；臀歹；幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛龋琾H值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液置于離心管中，在450 W熒光燈照射箱中光照處理12 d，溫度20 ℃，每2 d取樣測試花青素含量變化，計(jì)算花青素保留率，考察不同光照對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響[33]。

pH穩(wěn)定性：選取pH值范圍2至9，每100 mL緩沖溶液中溶解15 mg花青素。緩沖劑：0.1 mol/L氯化鉀溶液作為pH值為 2的緩沖液；0.1 mol/L檸檬酸溶液作為pH 值為3和4的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽溶液作為pH值為 5、6和7的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽-氫氧化鈉溶液作為pH值為 8和9的緩沖液。計(jì)算花青素含量變化，分析pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 抗氧化性試驗(yàn)

DPPH自由基清除能力：稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.2 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入0.4 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用VC作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率利用公式（4）計(jì)算[34]：

式中Ad0為0.2 mL無水乙醇+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad1為0.2 mL樣品溶液+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad2為0.2 mL樣品溶液+0.4 mL無水乙醇的吸光值。

總還原能力：在離心管中分別加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸緩沖液0.25mL和不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液0.2 mL，加入0.25 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后加入0.25 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min。取上清液加入0.2 mL蒸餾水和0.05 mL 0.1%FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光值。VC作為陽性對(duì)照[34]。

Fe2+鰲合能力：分別取0.4 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL，25 ℃水浴10 min，于562 nm處測吸光值，EDTA為陽性對(duì)照。樣品對(duì)Fe2+鰲合率利用公式（5）計(jì)算[34]：

式中Af0為0.4 mL蒸餾水+0.1 mLFeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af1為0.4 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af2為0.4 mL樣品+0.1 mL蒸餾水+0.2 mL菲洛嗪吸光值。

1.3.7 MTT（Thiazolyl blue tetrazolium bromide）噻唑藍(lán)試驗(yàn)

中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞CHO-k1活性檢測，培養(yǎng)基：Ham’s F-12K+10%FBS（Fetal Bovine Serum）。1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加100μL（待測細(xì)胞密度8 000個(gè)/孔）；2）5%CO2、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底，棄培養(yǎng)基，加入不同濃度梯度的待測樣品（一般下午鋪板，次日上午加藥）；樣品用純F-12K培養(yǎng)基（無FBS）進(jìn)行梯度稀釋后，以樣品∶培養(yǎng)基=1∶9的比例加入96孔板（一般先加20μL樣品，再加180μL培養(yǎng)基）；以PBS作陰性對(duì)照；3）繼續(xù)培養(yǎng)16～48 h后，加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h（注意避光）；4）終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基；注意不要將結(jié)晶物吸出；5）每孔加入150μL DMSO（Dimethyl Sulfoxide），置搖床低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，測A490 nm；6）細(xì)胞活性%=樣品吸光值/對(duì)照組吸光值×100，抑制率計(jì)算公式如（6）所示：

式中N為抑制率；An0為對(duì)照組吸光值；An1為樣品吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物酶催化條件對(duì)花青素酰基化的影響

生物酶催化活性是影響桑椹花青素?；闹匾蛩刂?，本文選取了4種脂肪酶（1-南極假絲酵母脂肪酶、2-Amano脂肪酶PS、3-米曲霉脂肪酶、4-豬胰腺脂肪酶），在相同酶活條件下，對(duì)花青素酰基轉(zhuǎn)化率和保留率進(jìn)行測定分析，如圖1所示，4種脂肪酶的轉(zhuǎn)化率在10%～15%之間，其中，南極假絲酵母脂肪酶催化效果最好，?；D(zhuǎn)化率為13.5%，花青素保留率最高，為38.4%。其余3種脂肪酶的催化效果較為接近。

酶催化反應(yīng)溶劑對(duì)桑椹花青素?；Ч哂酗@著的影響，本文選取了4種反應(yīng)溶劑（吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮），圖2所示為不同反應(yīng)溶劑對(duì)花青素酰基轉(zhuǎn)化率和保留率的影響。在不同反應(yīng)溶劑作用下，花青素酰基轉(zhuǎn)化率差異明顯。當(dāng)吡啶作為反應(yīng)溶劑時(shí)，花青素?；D(zhuǎn)化率最高，為13.5%，而叔丁醇、叔戊醇、丙酮的?；D(zhuǎn)化率均低于4%，但是花青素保留率均較高，保持在50%～65%之間，這是因?yàn)橐允宥〈?、叔戊醇、丙酮作為反?yīng)溶劑時(shí)，酰基化效率低，溶液中非?；幕ㄇ嗨剌^多，導(dǎo)致保留率較高。

不同的?；w對(duì)?；ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)和性能影響較大，本文選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為?；w，如圖3所示，研究了不同的?；w對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率和保留率的影響。由圖可得，當(dāng)苯甲酸甲酯作為?；w時(shí)，花青素?；D(zhuǎn)化率最高為13.5%，水楊酸甲酯的?；D(zhuǎn)化率最低為8.8%。苯甲酸甲酯的花青素保留率也最高為38.4%，水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯的保留率均低于30%。

花青素的?；磻?yīng)是將其羥基與脂肪酸以及其他物質(zhì)酯化，以增強(qiáng)穩(wěn)定性和親脂性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，最佳組合為南極假絲酵母脂肪酶、吡啶、苯甲酸甲酯。南極假絲酵母脂肪酶催化花青素-3-O-葡萄糖苷，這種酶促反應(yīng)可以在富含花青素的提取物上進(jìn)行，也可以根據(jù)修飾的物理性質(zhì)進(jìn)行分離，是酰基化試驗(yàn)效果較為理想的催化酶[35]。在酶催化反應(yīng)溶劑體系中，有機(jī)溶劑性質(zhì)會(huì)影響酶的活性、選擇性、穩(wěn)定性以及反應(yīng)效果。由于花青素水溶性較高，親脂性極低，需采用極性較強(qiáng)有機(jī)溶劑使其在反應(yīng)中溶解。然而，有研究表明，溶劑極性過高易降低脂肪酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶催化活性[32]。因此，選用吡啶作為反應(yīng)中使用的極性有機(jī)溶劑，既能較好的溶解桑椹花青素，又能保持酶催化活性。對(duì)復(fù)雜的桑椹提取物進(jìn)行提取和純化，再以提純的桑椹花青素為基體，通過酶法?；赞D(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)時(shí)，苯甲酸甲酯對(duì)花青素的酰基化轉(zhuǎn)化效率最高，這可能和花青素的多種結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2 酰基化花青素結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉紅外光譜儀在525至4 000 cm-1的吸收光譜范圍內(nèi)對(duì)非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨剡M(jìn)行基團(tuán)分析，如圖4a所示，非酰基化花青素在3 262～3 325 cm-1處為酚羥基上-OH寬而強(qiáng)的伸縮吸收峰，2 981 cm-1處為糖環(huán)亞甲基上C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 638 cm-1為苯環(huán)的特征吸收峰，1 043 cm-1為C-O伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)。與非?；ㄇ嗨叵啾容^，酰基化花青素在3 262～3 325 cm-1處-OH吸收峰減弱，2 974 cm-1處的C-H峰增強(qiáng)，1 650～1 870 cm-1處為C=O吸收峰，1 000～1 300 cm-1處為酚類分子的-OH彎曲振動(dòng)吸收與C-O-C伸縮振動(dòng)吸收等多種成分組成，并且兼具有苯環(huán)（1 420～1 600 cm-1）的骨架振動(dòng)峰，峰明顯增強(qiáng)趨于穩(wěn)定。

采用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)200～600 nm范圍內(nèi)的非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨剡M(jìn)行了掃描。圖4b所示為?；瘜?duì)花青素吸光度的影響。對(duì)花青素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，非酰基化花青素樣品在280 nm處有明顯的吸收，且在該波長處的吸收最為穩(wěn)定，說明含有苯環(huán)，并且苯環(huán)上帶有酚羥基。361 nm處有吸收峰，300～400 nm處，主要是由B環(huán)上的?；鶊F(tuán)引發(fā)的。?；ㄇ嗨氐奈辗逵?80 nm前移到271 nm，說明花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。240～280 nm（271 nm）主要是由A環(huán)上的苯甲?；鶊F(tuán)引發(fā)的，227 nm的吸收峰主要是B環(huán)的六元不飽和環(huán)酮引起的，此時(shí)B環(huán)上不存在?；?。

2.3 ?；瘜?duì)花青素穩(wěn)定性影響

圖5a所示為非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨卦诓煌瑴囟认卤芄馑?2 h后的熱穩(wěn)定性。40、50和60 ℃下，酰基化花青素的保留率分別為89.1%、87.4%和84.2%，非?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈史謩e為84.5%、82.3%和79.0%，相同溫度下，?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈时确酋；ㄇ嗨氐谋Ａ袈示呒s5.0%。這表明，在一定溫度作用下，酰基化花青素比非?；ㄇ嗨叵鄬?duì)穩(wěn)定，桑椹花青素經(jīng)?；幚砗?，可以在這些溫度下可以很好地保存。在一定溫度作用下，花青素及其糖苷被分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]，且隨著溫度的增加，降解越顯著，但?；ㄇ嗨氐臒岱€(wěn)定性優(yōu)于非?；ㄇ嗨?。

與溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響相比，光照顯著影響花青素的穩(wěn)定性。圖5b所示，在20 ℃下暴露于450 W光照2、4、6、8、10和12 d后，非?；ㄇ嗨乇Ａ袈试?0 d內(nèi)線性急劇下降到77.3%，第12天保留率為68.0%。然而，?；ㄇ嗨乇Ａ袈适冀K高于非酰基化花青素，前6 d內(nèi)，保留率下降緩慢，第6天保留率仍高達(dá)96.1%；后6 d保留率下降稍有增加，第12天保留率為74.3%。有研究表明?；蚧ㄇ嗨靥峁╇娮拥臐撛谀芰36]，在增強(qiáng)了?；ㄇ嗨氐墓庹辗€(wěn)定性。

pH值對(duì)?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響如圖5c所示。由圖可得，花青素對(duì)pH值敏感，花青素濃度隨pH值變化顯著。在低pH值酸性條件下，pH值為2時(shí)，非酰基化花青濃度變化幅度最大，接近?；ㄇ嗨氐?倍；pH值為3時(shí)，酰基化花青素的濃度幾乎不發(fā)生變化，而非酰基化花青濃度增加80%。在pH值為4～6時(shí)，?；ㄇ嗨嘏c非酰基化花青素的濃度基本無變化。在堿性pH值為7～9時(shí)，?；ㄇ嗨嘏c非?；ㄇ嗨氐臐舛染l(fā)生變化，pH值為8時(shí)，非?；ㄇ酀舛仍黾蛹s80%，為?；ㄇ嗨氐?倍。通過以上分析可得，酰基化花青素在不同pH值下更加穩(wěn)定，尤其是在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性大大提高?；ㄇ嗨氐男阅芤资苋芤簆H值變化影響，這與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在低pH值區(qū)（pH值＜3），花青素以高度穩(wěn)定的黃色離子存在，呈鮮紅色。隨著pH值的升高，水解產(chǎn)物變成無色的甲醇假堿，經(jīng)開環(huán)形成黃色的查爾酮，而?；ㄇ嗨馗€(wěn)定。多?；ㄇ嗨氐母叻€(wěn)定性是由于其與芳香羧酸之間的疏水作用形成的三明治狀分子內(nèi)堆積，阻止了糖苷的水合作用和顏色的降解[25]。

2.4 酰基化對(duì)花青素抗氧化性影響

?；瘜?duì)花青素DPPH自由基清除能力的影響如圖6a所示，以VC作為陽性對(duì)照。研究發(fā)現(xiàn)，兩組DPPH自由基清除活性表現(xiàn)顯著差異，?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力始終高于非酰基化花青素。隨著濃度的增加，非?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除率線性增加，非酰基化花青素DPPH自由基清除50%時(shí)的濃度IC50值為0.5 mg/mL，當(dāng)花青素濃度為0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為71%。而?；ㄇ嗨卦跐舛?.2～0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率范圍為88%～96%，始終穩(wěn)定保持在較高水平。對(duì)?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除率進(jìn)行非線性擬合，?；ㄇ嗨豂C50值為0.01 mg/mL。IC50值越大，則DPPH自由基清除50%時(shí)，所需花青素的濃度越大，樣品的抗氧化活性越低。?；ㄇ嗨豂C50值顯著小于非?；ㄇ嗨兀虼薉PPH自由基清除能力越強(qiáng)，表明?；岣吡嘶ㄇ嗨氐目寡趸阅?。

花青素生物抗氧化性與其還原能力密切相關(guān)，在700 nm處吸光度值的大小表示花青素給電子的能力。?；瘜?duì)花青素總還原能力的影響如圖6b所示，以VC作為陽性對(duì)照。由圖可得，隨著濃度的增加，非酰基化花青素和?；ㄇ嗨氐目傔€原能力均增強(qiáng)，酰基化花青素的總還原能力較非?；幕ㄇ嗨赜兴嵘．?dāng)質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時(shí)，非?；ㄇ嗨氐奈舛戎翟黾用黠@，由0.45增大到了0.73，增加62%；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4～0.8 mg/mL時(shí)，非?；ㄇ嗨氐奈舛戎祷颈３旨s0.75，表明花青素的總還原能力趨于穩(wěn)定。而?；ㄇ嗨氐奈舛戎党示€性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，?；ㄇ嗨氐奈舛戎禐?.99，這表明其總還原能力比非酰基化花青素提高30%。

花青素具有一定的金屬離子螯合能力，圖6c所示為?；瘜?duì)花青素Fe2+鰲合能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力均呈線性增強(qiáng)趨勢(shì)，酰基化花青素的Fe2+鰲合能力顯著高于非?；ㄇ嗨?。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，?；ㄇ嗨氐慕饘匐x子螯合能力已達(dá)到70%。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，?；ㄇ嗨氐慕饘匐x子螯合能力高達(dá)到90%，而非酰化花青素僅為68%。結(jié)果表明，?；ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力大大提高。

本試驗(yàn)研究采用MTT法測定非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨貙?duì)倉鼠卵巢上皮細(xì)胞活性的影響，如圖7所示。結(jié)果表明，非?；王；ㄇ嗨貙?duì)腫瘤細(xì)胞活性均有抑制作用，且隨著花青素濃度逐漸增加，增殖抑制率增大。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍6～46μg/mL時(shí)，非酰基化花青素的細(xì)胞活性抑制率顯著高于?；ㄇ嗨?。而當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍96～750μg/mL時(shí)，酰基化花青素的細(xì)胞活性抑制率逐漸超過非?；ㄇ嗨兀译S著濃度的繼續(xù)增大，?；ㄇ嗨貙?duì)細(xì)胞增殖抑制作用越來越顯著，質(zhì)量濃度為750μg/mL時(shí)，?；ㄇ嗨啬[瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%，而非?；ㄇ嗨丶s為50%。

研究表明，生物酶?；ㄇ嗨乜梢栽诓挥绊懮锘钚院蜕忍匦缘那疤嵯绿岣咂浞€(wěn)定性[35]。?；念愋?、位置和數(shù)量是影響穩(wěn)定性的主要因素，通過增加花青素的極性、分子大小以及改變空間結(jié)構(gòu)來影響花青素的反應(yīng)性。?；档土嘶ㄇ嗨氐臉O性，并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，降低花青素對(duì)親核攻擊的敏感性。由酰基引起的分子間輔色作用對(duì)花青素C2、C4位置的OH親核攻擊產(chǎn)生有效的物理阻礙[25]。此外，生物酶?；磻?yīng)具有更強(qiáng)的化學(xué)選擇性和區(qū)域選擇性，不僅能提高黃酮類化合物在各種非水介質(zhì)中的溶解度，而且還能增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗氧化活性[37]。更親脂的衍生物有利于提高花青素的抗氧化能力，可以更有效地保護(hù)親脂底物免受氧化。

3 結(jié) 論

天然花青素可以作為一種優(yōu)良的抗氧化劑，但是在其加工貯藏應(yīng)用過程中存在著穩(wěn)定性差，脂溶性低的問題，本文利用生物酶法?；揎椛ｉ┗ㄇ嗨?，顯著改善其穩(wěn)定性和抗氧化性，得到以下結(jié)論：

1）由單因素試驗(yàn)可得，以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，確定反應(yīng)優(yōu)化條件為南極假絲酵母脂肪酶作為催化酶，吡啶作為反應(yīng)溶劑，苯甲酸甲酯作為酰基供體，桑椹花青素酰基轉(zhuǎn)化率最高為13.5%，保留率最高為38.4%。經(jīng)HPLC-MS正離子模式鑒定分析，花青素?；a(chǎn)物可能是單?；ㄇ嗨匾部赡苁嵌圊；ㄇ嗨?。

2）酰基化修飾可以大大提高花青素的熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。在40、50和60 ℃下可以更好地保存，光照6 d后，酰基化花青素的保留率仍高達(dá)96.1%，pH值分別為2、3、8環(huán)境中，?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性顯著提高。

3）?；梢燥@著增加花青素體外抗氧化性，?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力較強(qiáng)，總還原能力比非?；ㄇ嗨靥岣?0%，金屬離子螯合能力高達(dá)到90%，腫瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%，有效抑制細(xì)胞增殖。

綜上，該研究為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的穩(wěn)定應(yīng)用及性能改善提供參考的理論依據(jù)和技術(shù)支持。