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        基于生物酶法的?;i┗ㄇ嗨氐闹苽渑c特性

        2021-04-15 10:08:28蔣希芝辛向東ThomasAttaribo桂仲爭
        關(guān)鍵詞:桑椹?;?/a>脂肪酶

        蔣希芝,徐 磊,張 蓓,辛向東,Thomas Attaribo,桂仲爭※

        (1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212018;2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所,南京 210014;3. 江蘇銀寶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院有限公司,鹽城 224014)

        0 引 言

        桑椹為多年生木本植物桑樹(Morus albaL.)的成熟果穗,又名桑葚子、桑果、桑棗等。桑椹不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素,而且富含多種具有生物活性的化合物,如黃酮、生物堿、多糖等多種生物活性成份[1-2]?;ㄇ嗨厥巧i┲泻控S富的重要活性成分之一,也是天然色素的重要來源之一[3]?;ㄇ嗨厥蔷哂杏H水性和水溶性的多酚類植物色素及其代謝產(chǎn)物,是重要的抗氧化劑之一[4-5],具有廣泛的藥理特性,如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌和抗癌[6-10],因此,在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[11]。桑椹果實(shí)中花青素主要有4種存在形式,分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(P3G)、矢車菊素-3-O-蕓香苷(C3R)和天竺葵素-3-O-蕓香苷(P3R)。C3G和C3R是桑椹花青素中的主要成分[12]。

        然而,花青素在加工過程中很不穩(wěn)定,易受多種不同外部條件影響[13-14]。溫度和光照是影響花青素降解穩(wěn)定性的重要因素,顯著降低其穩(wěn)定性和生物活性[15]。Fracassetti等[16]觀察發(fā)現(xiàn)花青素在25和42 ℃下的前14 d降解量緩慢,為3%,而在60和80 ℃下的第3天則降解很快,分別為60%和85%。加熱處理可將花青素或其結(jié)合糖苷分解成小分子,如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]。影響花青素穩(wěn)定性的另一個(gè)重要因素是pH值。Rein等[18]證明,花青素水溶液在不同的pH值下存在4種形式的相互轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致不同顏色的存在。特別是在弱酸性到中性范圍內(nèi),穩(wěn)定性大大降低。此外,金屬離子[19]、糖含量[20]和過氧化氫[21]也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性。因此,花青素相對(duì)較低的穩(wěn)定性是限制其廣泛有效應(yīng)用的關(guān)鍵缺陷和主要障礙[22-24],盡可能減少花青素的降解,提高其穩(wěn)定性尤為重要。

        為了提高花青素的穩(wěn)定性,已報(bào)道的修飾方法有糖基?;痆25]、糖基化[26]、微膠囊化[27]、金屬螯合[28]、脂質(zhì)體[29]和納米粒子載覆[30-31]。從營養(yǎng)學(xué)角度分析,普通的化學(xué)修飾定向性差,而生物酶法反應(yīng)過程不會(huì)對(duì)花青素分子造成破壞,具有更高的安全性,更符合農(nóng)業(yè)食品安全要求,而且生物酶具有高度選擇性和專有性。因此,生物酶法更適合對(duì)花青素分子進(jìn)行酰基化修飾[32]。目前,有關(guān)生物酶法對(duì)桑椹花青素?;揎楑r有報(bào)道。

        因此,本研究選取成熟桑椹果實(shí),提取純化制得桑椹花青素。采用生物酶法,對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?;磻?yīng),并與非?;幕ㄇ嗨剡M(jìn)行對(duì)比分析,考察脂肪酶、反應(yīng)溶劑、酰基供體對(duì)花青素?;D(zhuǎn)化率的影響,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。此外,進(jìn)一步分別研究溫度、光照、pH值等條件對(duì)?;ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)和性能的影響,測定?;ㄇ嗨氐目寡趸钚裕ㄇ宄鼶PPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力、總還原能力、Fe2+鰲合能力等,并與合成前花青素進(jìn)行比較,探討?;瘜?duì)花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響,從而為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料與試劑

        供試桑椹,采自江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國家桑資源圃基地。所摘桑椹為成熟度相近,形狀大小均一,無霉?fàn)€變質(zhì),無病蟲害的新鮮桑椹。

        矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C21H21ClO11)標(biāo)準(zhǔn)品由上海麥克林生化科技有限公司提供;甲醇、乙腈,均為色譜純,購于德國默克公司;南極假絲酵母脂肪酶、Amano脂肪酶PS購于美國Sigma公司;米曲霉脂肪酶購于美國Aladdin公司;豬胰腺脂肪酶、大孔吸附樹脂(D101)、無水乙醇、吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯、4A分子篩、氯化鉀、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,鹽酸購于上海中試化工總公司,以上試劑均為分析純;DPPH購于日本TCI公司,三氯乙酸、菲洛嗪購于上海生工,氯化亞鐵購于沃凱,以上試劑均為生化試劑。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-3200PC紫外可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀,美國Thermo;HPLC 1260Ⅱ高效液相色譜儀,美國Agilent;LC 1260 MS G6420A高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀,美國Agilent;QTRAP 6500質(zhì)譜分析儀,美國SCIEX。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 生物酶催化合成?;ㄇ嗨?/p>

        采用生物酶法對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?;磻?yīng)。

        選取南極假絲酵母脂肪酶(5 000 U/g)、Amano脂肪酶PS(Pseudomonas,30 000 U/g)、米曲霉脂肪酶(300 000 U/g)、豬胰腺脂肪酶(500 U/g)作為輔助花青素?;拇呋?,反應(yīng)體積共10 mL,花青素20 mg、苯甲酸甲酯0.5 mol/L,分別加入酶活力1 000 U的不同的脂肪酶,吡啶2 mol/L,干燥活化4A分子篩1 g,40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

        選取吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮作為酶催化?;磻?yīng)溶劑,反應(yīng)體積共10 mL,花青素20 mg,苯甲酸甲酯0.5 mol/L,酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶,分別加入吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮2 mol/L,干燥活化4A分子篩1 g,40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

        選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為?;w,反應(yīng)體積共10 mL,花青素20 mg,加入苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯各0.5 mol/L,酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶,吡啶2 mol/L,干燥活化4A分子篩1 g,40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

        1.3.2 高效液相色譜分析花青素含量

        樣品在去離子水中稀釋后,進(jìn)入配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測器的高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)。在20 ℃下,使用反相色譜柱(Poroshell 120 EC-C18,4.0μm,4.6 mm×150 mm)測定花青素的含量。設(shè)置流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量2.0μL。流動(dòng)相為1%甲酸水溶液(A)和1%甲酸乙腈溶液(B)。試驗(yàn)在以下條件下進(jìn)行:0~2.50 min,線性梯度從8%到12%B;2.50~5.00 min,線性梯度從12%到18%B;5.00~10.10 min,線性梯度從18%到20%B;10.10~12.00 min,線性梯度從20%到80%B;12.00~14.00 min,80%B;14.00~14.10 min,線性梯度從80%到8%B;14.10~18.00 min,8%B;最后,在下一次注射之前清洗并重新平衡色譜柱。分析期間,所有樣品均保持在4 ℃,于520 nm處檢測花青素。

        1.3.3 花青素轉(zhuǎn)化率和保留率測定

        花青素?;D(zhuǎn)化率:采用高效液相色譜(HPLC)測定花青素?;磻?yīng)后的出峰面積,根據(jù)公式(1)計(jì)算轉(zhuǎn)化率[32]:

        式中C為花青素?;D(zhuǎn)化率;S1為反應(yīng)后液相色譜中C3G的出峰面積;S2為反應(yīng)后新生成的C3G?;a(chǎn)物的出峰面積。

        花青素保留率:采用高效液相色譜(HPLC)分別測定花青素酰基化前后的出峰面積,根據(jù)公式(2)計(jì)算保留率[32]:

        式中P為花青素酰基化保留率;S0為反應(yīng)前液相色譜中C3G的出峰面積。

        1.3.4 ?;ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)分析

        利用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier Transformation Infrared Spectra,F(xiàn)TIR)和紫外-可見光風(fēng)光光度計(jì)進(jìn)行?;Y(jié)構(gòu)的初步分析。在衰減全反射模式(Attenuated Total Reflection mode,ATR)下,用Nicolet-iS50紅外光譜儀對(duì)復(fù)合前后樣品的特征吸收峰進(jìn)行了表征。其中,波數(shù)范圍為525~4 000 cm-1,溫度為25 ℃。

        借助紫外可見分光光度計(jì)(Ultraviolet-Visible Spectrophotometer,UV-Vis)對(duì)花青素溶液進(jìn)行漫反射光譜測定,波長范圍200~600 nm,掃描速度中等,狹縫寬度20 nm,采樣間隔2.0 nm。

        1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        熱穩(wěn)定性:用去離子水將?;臀歹;幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛?,pH值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后,取相同體積溶液避光密封于離心管中,分別在40、50、60 ℃的溫度下,避光水浴熱處理12 h,研究溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。采用紫外-可見光分光光度計(jì),在520 nm處測定花青素含量。根據(jù)公式(3)計(jì)算花青素保留率[33]:

        式中R為花青素保留率;A0為加熱開始時(shí)的吸光度(t=0);At為時(shí)間t時(shí)的吸光度。

        光穩(wěn)定性:用去離子水將?;臀歹;幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛龋琾H值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后,取相同體積溶液置于離心管中,在450 W熒光燈照射箱中光照處理12 d,溫度20 ℃,每2 d取樣測試花青素含量變化,計(jì)算花青素保留率,考察不同光照對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響[33]。

        pH穩(wěn)定性:選取pH值范圍2至9,每100 mL緩沖溶液中溶解15 mg花青素。緩沖劑:0.1 mol/L氯化鉀溶液作為pH值為 2的緩沖液;0.1 mol/L檸檬酸溶液作為pH 值為3和4的緩沖液;0.1 mol/L磷酸鹽溶液作為pH值為 5、6和7的緩沖液;0.1 mol/L磷酸鹽-氫氧化鈉溶液作為pH值為 8和9的緩沖液。計(jì)算花青素含量變化,分析pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。

        1.3.6 抗氧化性試驗(yàn)

        DPPH自由基清除能力:稱取一定量的DPPH,用無水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.2 mL不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)的溶液,加入0.4 mL DPPH溶液,混合均勻,室溫放置30 min后,5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用VC作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率利用公式(4)計(jì)算[34]:

        式中Ad0為0.2 mL無水乙醇+0.4 mLDPPH溶液的吸光值;Ad1為0.2 mL樣品溶液+0.4 mLDPPH溶液的吸光值;Ad2為0.2 mL樣品溶液+0.4 mL無水乙醇的吸光值。

        總還原能力:在離心管中分別加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸緩沖液0.25mL和不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)的溶液0.2 mL,加入0.25 mL 1%鐵氰化鉀,混合均勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后加入0.25 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng),5 000 r/min離心10 min。取上清液加入0.2 mL蒸餾水和0.05 mL 0.1%FeCl3,混勻后靜置10 min,在700 nm處檢測吸光值。VC作為陽性對(duì)照[34]。

        Fe2+鰲合能力:分別取0.4 mL不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)的溶液,加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL,25 ℃水浴10 min,于562 nm處測吸光值,EDTA為陽性對(duì)照。樣品對(duì)Fe2+鰲合率利用公式(5)計(jì)算[34]:

        式中Af0為0.4 mL蒸餾水+0.1 mLFeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值;Af1為0.4 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值;Af2為0.4 mL樣品+0.1 mL蒸餾水+0.2 mL菲洛嗪吸光值。

        1.3.7 MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)噻唑藍(lán)試驗(yàn)

        中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞CHO-k1活性檢測,培養(yǎng)基:Ham’s F-12K+10%FBS(Fetal Bovine Serum)。1)收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,每孔加100μL(待測細(xì)胞密度8 000個(gè)/孔);2)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底,棄培養(yǎng)基,加入不同濃度梯度的待測樣品(一般下午鋪板,次日上午加藥);樣品用純F-12K培養(yǎng)基(無FBS)進(jìn)行梯度稀釋后,以樣品∶培養(yǎng)基=1∶9的比例加入96孔板(一般先加20μL樣品,再加180μL培養(yǎng)基);以PBS作陰性對(duì)照;3)繼續(xù)培養(yǎng)16~48 h后,加入20μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h(注意避光);4)終止培養(yǎng),棄培養(yǎng)基;注意不要將結(jié)晶物吸出;5)每孔加入150μL DMSO(Dimethyl Sulfoxide),置搖床低速震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,測A490 nm;6)細(xì)胞活性%=樣品吸光值/對(duì)照組吸光值×100,抑制率計(jì)算公式如(6)所示:

        式中N為抑制率;An0為對(duì)照組吸光值;An1為樣品吸光值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 生物酶催化條件對(duì)花青素酰基化的影響

        生物酶催化活性是影響桑椹花青素?;闹匾蛩刂?,本文選取了4種脂肪酶(1-南極假絲酵母脂肪酶、2-Amano脂肪酶PS、3-米曲霉脂肪酶、4-豬胰腺脂肪酶),在相同酶活條件下,對(duì)花青素酰基轉(zhuǎn)化率和保留率進(jìn)行測定分析,如圖1所示,4種脂肪酶的轉(zhuǎn)化率在10%~15%之間,其中,南極假絲酵母脂肪酶催化效果最好,?;D(zhuǎn)化率為13.5%,花青素保留率最高,為38.4%。其余3種脂肪酶的催化效果較為接近。

        酶催化反應(yīng)溶劑對(duì)桑椹花青素?;Ч哂酗@著的影響,本文選取了4種反應(yīng)溶劑(吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮),圖2所示為不同反應(yīng)溶劑對(duì)花青素酰基轉(zhuǎn)化率和保留率的影響。在不同反應(yīng)溶劑作用下,花青素酰基轉(zhuǎn)化率差異明顯。當(dāng)吡啶作為反應(yīng)溶劑時(shí),花青素?;D(zhuǎn)化率最高,為13.5%,而叔丁醇、叔戊醇、丙酮的?;D(zhuǎn)化率均低于4%,但是花青素保留率均較高,保持在50%~65%之間,這是因?yàn)橐允宥〈?、叔戊醇、丙酮作為反?yīng)溶劑時(shí),酰基化效率低,溶液中非?;幕ㄇ嗨剌^多,導(dǎo)致保留率較高。

        不同的?;w對(duì)?;ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)和性能影響較大,本文選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯作為?;w,如圖3所示,研究了不同的?;w對(duì)花青素?;D(zhuǎn)化率和保留率的影響。由圖可得,當(dāng)苯甲酸甲酯作為?;w時(shí),花青素?;D(zhuǎn)化率最高為13.5%,水楊酸甲酯的?;D(zhuǎn)化率最低為8.8%。苯甲酸甲酯的花青素保留率也最高為38.4%,水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒食子酸甲酯的保留率均低于30%。

        花青素的?;磻?yīng)是將其羥基與脂肪酸以及其他物質(zhì)酯化,以增強(qiáng)穩(wěn)定性和親脂性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo),最佳組合為南極假絲酵母脂肪酶、吡啶、苯甲酸甲酯。南極假絲酵母脂肪酶催化花青素-3-O-葡萄糖苷,這種酶促反應(yīng)可以在富含花青素的提取物上進(jìn)行,也可以根據(jù)修飾的物理性質(zhì)進(jìn)行分離,是酰基化試驗(yàn)效果較為理想的催化酶[35]。在酶催化反應(yīng)溶劑體系中,有機(jī)溶劑性質(zhì)會(huì)影響酶的活性、選擇性、穩(wěn)定性以及反應(yīng)效果。由于花青素水溶性較高,親脂性極低,需采用極性較強(qiáng)有機(jī)溶劑使其在反應(yīng)中溶解。然而,有研究表明,溶劑極性過高易降低脂肪酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶催化活性[32]。因此,選用吡啶作為反應(yīng)中使用的極性有機(jī)溶劑,既能較好的溶解桑椹花青素,又能保持酶催化活性。對(duì)復(fù)雜的桑椹提取物進(jìn)行提取和純化,再以提純的桑椹花青素為基體,通過酶法?;赞D(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)時(shí),苯甲酸甲酯對(duì)花青素的酰基化轉(zhuǎn)化效率最高,這可能和花青素的多種結(jié)構(gòu)有關(guān)。

        2.2 酰基化花青素結(jié)構(gòu)分析

        采用傅里葉紅外光譜儀在525至4 000 cm-1的吸收光譜范圍內(nèi)對(duì)非?;ㄇ嗨睾王;ㄇ嗨剡M(jìn)行基團(tuán)分析,如圖4a所示,非酰基化花青素在3 262~3 325 cm-1處為酚羥基上-OH寬而強(qiáng)的伸縮吸收峰,2 981 cm-1處為糖環(huán)亞甲基上C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,1 638 cm-1為苯環(huán)的特征吸收峰,1 043 cm-1為C-O伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)。與非?;ㄇ嗨叵啾容^,酰基化花青素在3 262~3 325 cm-1處-OH吸收峰減弱,2 974 cm-1處的C-H峰增強(qiáng),1 650~1 870 cm-1處為C=O吸收峰,1 000~1 300 cm-1處為酚類分子的-OH彎曲振動(dòng)吸收與C-O-C伸縮振動(dòng)吸收等多種成分組成,并且兼具有苯環(huán)(1 420~1 600 cm-1)的骨架振動(dòng)峰,峰明顯增強(qiáng)趨于穩(wěn)定。

        采用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)200~600 nm范圍內(nèi)的非?;ㄇ嗨睾王;ㄇ嗨剡M(jìn)行了掃描。圖4b所示為?;瘜?duì)花青素吸光度的影響。對(duì)花青素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,非酰基化花青素樣品在280 nm處有明顯的吸收,且在該波長處的吸收最為穩(wěn)定,說明含有苯環(huán),并且苯環(huán)上帶有酚羥基。361 nm處有吸收峰,300~400 nm處,主要是由B環(huán)上的?;鶊F(tuán)引發(fā)的。?;ㄇ嗨氐奈辗逵?80 nm前移到271 nm,說明花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。240~280 nm(271 nm)主要是由A環(huán)上的苯甲?;鶊F(tuán)引發(fā)的,227 nm的吸收峰主要是B環(huán)的六元不飽和環(huán)酮引起的,此時(shí)B環(huán)上不存在?;?。

        2.3 ?;瘜?duì)花青素穩(wěn)定性影響

        圖5a所示為非?;ㄇ嗨睾王;ㄇ嗨卦诓煌瑴囟认卤芄馑?2 h后的熱穩(wěn)定性。40、50和60 ℃下,酰基化花青素的保留率分別為89.1%、87.4%和84.2%,非?;ㄇ嗨氐谋A袈史謩e為84.5%、82.3%和79.0%,相同溫度下,?;ㄇ嗨氐谋A袈时确酋;ㄇ嗨氐谋A袈示呒s5.0%。這表明,在一定溫度作用下,酰基化花青素比非?;ㄇ嗨叵鄬?duì)穩(wěn)定,桑椹花青素經(jīng)?;幚砗?,可以在這些溫度下可以很好地保存。在一定溫度作用下,花青素及其糖苷被分解成小分子,如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17],且隨著溫度的增加,降解越顯著,但?;ㄇ嗨氐臒岱€(wěn)定性優(yōu)于非?;ㄇ嗨?。

        與溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響相比,光照顯著影響花青素的穩(wěn)定性。圖5b所示,在20 ℃下暴露于450 W光照2、4、6、8、10和12 d后,非?;ㄇ嗨乇A袈试?0 d內(nèi)線性急劇下降到77.3%,第12天保留率為68.0%。然而,?;ㄇ嗨乇A袈适冀K高于非酰基化花青素,前6 d內(nèi),保留率下降緩慢,第6天保留率仍高達(dá)96.1%;后6 d保留率下降稍有增加,第12天保留率為74.3%。有研究表明?;蚧ㄇ嗨靥峁╇娮拥臐撛谀芰36],在增強(qiáng)了?;ㄇ嗨氐墓庹辗€(wěn)定性。

        pH值對(duì)?;ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響如圖5c所示。由圖可得,花青素對(duì)pH值敏感,花青素濃度隨pH值變化顯著。在低pH值酸性條件下,pH值為2時(shí),非酰基化花青濃度變化幅度最大,接近?;ㄇ嗨氐?倍;pH值為3時(shí),酰基化花青素的濃度幾乎不發(fā)生變化,而非酰基化花青濃度增加80%。在pH值為4~6時(shí),?;ㄇ嗨嘏c非酰基化花青素的濃度基本無變化。在堿性pH值為7~9時(shí),?;ㄇ嗨嘏c非?;ㄇ嗨氐臐舛染l(fā)生變化,pH值為8時(shí),非?;ㄇ酀舛仍黾蛹s80%,為?;ㄇ嗨氐?倍。通過以上分析可得,酰基化花青素在不同pH值下更加穩(wěn)定,尤其是在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性大大提高?;ㄇ嗨氐男阅芤资苋芤簆H值變化影響,這與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在低pH值區(qū)(pH值<3),花青素以高度穩(wěn)定的黃色離子存在,呈鮮紅色。隨著pH值的升高,水解產(chǎn)物變成無色的甲醇假堿,經(jīng)開環(huán)形成黃色的查爾酮,而?;ㄇ嗨馗€(wěn)定。多?;ㄇ嗨氐母叻€(wěn)定性是由于其與芳香羧酸之間的疏水作用形成的三明治狀分子內(nèi)堆積,阻止了糖苷的水合作用和顏色的降解[25]。

        2.4 酰基化對(duì)花青素抗氧化性影響

        ?;瘜?duì)花青素DPPH自由基清除能力的影響如圖6a所示,以VC作為陽性對(duì)照。研究發(fā)現(xiàn),兩組DPPH自由基清除活性表現(xiàn)顯著差異,?;ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力始終高于非酰基化花青素。隨著濃度的增加,非?;ㄇ嗨谼PPH自由基清除率線性增加,非酰基化花青素DPPH自由基清除50%時(shí)的濃度IC50值為0.5 mg/mL,當(dāng)花青素濃度為0.8 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率為71%。而?;ㄇ嗨卦跐舛?.2~0.8 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率范圍為88%~96%,始終穩(wěn)定保持在較高水平。對(duì)?;ㄇ嗨谼PPH自由基清除率進(jìn)行非線性擬合,?;ㄇ嗨豂C50值為0.01 mg/mL。IC50值越大,則DPPH自由基清除50%時(shí),所需花青素的濃度越大,樣品的抗氧化活性越低。?;ㄇ嗨豂C50值顯著小于非?;ㄇ嗨兀虼薉PPH自由基清除能力越強(qiáng),表明?;岣吡嘶ㄇ嗨氐目寡趸阅?。

        花青素生物抗氧化性與其還原能力密切相關(guān),在700 nm處吸光度值的大小表示花青素給電子的能力。?;瘜?duì)花青素總還原能力的影響如圖6b所示,以VC作為陽性對(duì)照。由圖可得,隨著濃度的增加,非酰基化花青素和?;ㄇ嗨氐目傔€原能力均增強(qiáng),酰基化花青素的總還原能力較非?;幕ㄇ嗨赜兴嵘.?dāng)質(zhì)量濃度為0.1~0.4 mg/mL時(shí),非?;ㄇ嗨氐奈舛戎翟黾用黠@,由0.45增大到了0.73,增加62%;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4~0.8 mg/mL時(shí),非?;ㄇ嗨氐奈舛戎祷颈3旨s0.75,表明花青素的總還原能力趨于穩(wěn)定。而?;ㄇ嗨氐奈舛戎党示€性增加,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí),?;ㄇ嗨氐奈舛戎禐?.99,這表明其總還原能力比非酰基化花青素提高30%。

        花青素具有一定的金屬離子螯合能力,圖6c所示為?;瘜?duì)花青素Fe2+鰲合能力的影響。研究發(fā)現(xiàn),隨著濃度的增加,非?;ㄇ嗨睾王;ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力均呈線性增強(qiáng)趨勢(shì),酰基化花青素的Fe2+鰲合能力顯著高于非?;ㄇ嗨?。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),?;ㄇ嗨氐慕饘匐x子螯合能力已達(dá)到70%。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí),?;ㄇ嗨氐慕饘匐x子螯合能力高達(dá)到90%,而非酰化花青素僅為68%。結(jié)果表明,?;ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力大大提高。

        本試驗(yàn)研究采用MTT法測定非?;ㄇ嗨睾王;ㄇ嗨貙?duì)倉鼠卵巢上皮細(xì)胞活性的影響,如圖7所示。結(jié)果表明,非?;王;ㄇ嗨貙?duì)腫瘤細(xì)胞活性均有抑制作用,且隨著花青素濃度逐漸增加,增殖抑制率增大。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍6~46μg/mL時(shí),非酰基化花青素的細(xì)胞活性抑制率顯著高于?;ㄇ嗨?。而當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍96~750μg/mL時(shí),酰基化花青素的細(xì)胞活性抑制率逐漸超過非?;ㄇ嗨兀译S著濃度的繼續(xù)增大,?;ㄇ嗨貙?duì)細(xì)胞增殖抑制作用越來越顯著,質(zhì)量濃度為750μg/mL時(shí),?;ㄇ嗨啬[瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%,而非?;ㄇ嗨丶s為50%。

        研究表明,生物酶?;ㄇ嗨乜梢栽诓挥绊懮锘钚院蜕忍匦缘那疤嵯绿岣咂浞€(wěn)定性[35]。?;念愋?、位置和數(shù)量是影響穩(wěn)定性的主要因素,通過增加花青素的極性、分子大小以及改變空間結(jié)構(gòu)來影響花青素的反應(yīng)性。?;档土嘶ㄇ嗨氐臉O性,并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng),降低花青素對(duì)親核攻擊的敏感性。由酰基引起的分子間輔色作用對(duì)花青素C2、C4位置的OH親核攻擊產(chǎn)生有效的物理阻礙[25]。此外,生物酶?;磻?yīng)具有更強(qiáng)的化學(xué)選擇性和區(qū)域選擇性,不僅能提高黃酮類化合物在各種非水介質(zhì)中的溶解度,而且還能增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗氧化活性[37]。更親脂的衍生物有利于提高花青素的抗氧化能力,可以更有效地保護(hù)親脂底物免受氧化。

        3 結(jié) 論

        天然花青素可以作為一種優(yōu)良的抗氧化劑,但是在其加工貯藏應(yīng)用過程中存在著穩(wěn)定性差,脂溶性低的問題,本文利用生物酶法?;揎椛i┗ㄇ嗨?,顯著改善其穩(wěn)定性和抗氧化性,得到以下結(jié)論:

        1)由單因素試驗(yàn)可得,以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo),確定反應(yīng)優(yōu)化條件為南極假絲酵母脂肪酶作為催化酶,吡啶作為反應(yīng)溶劑,苯甲酸甲酯作為酰基供體,桑椹花青素酰基轉(zhuǎn)化率最高為13.5%,保留率最高為38.4%。經(jīng)HPLC-MS正離子模式鑒定分析,花青素?;a(chǎn)物可能是單?;ㄇ嗨匾部赡苁嵌圊;ㄇ嗨?。

        2)酰基化修飾可以大大提高花青素的熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。在40、50和60 ℃下可以更好地保存,光照6 d后,酰基化花青素的保留率仍高達(dá)96.1%,pH值分別為2、3、8環(huán)境中,?;ㄇ嗨胤€(wěn)定性顯著提高。

        3)?;梢燥@著增加花青素體外抗氧化性,?;ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力較強(qiáng),總還原能力比非?;ㄇ嗨靥岣?0%,金屬離子螯合能力高達(dá)到90%,腫瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%,有效抑制細(xì)胞增殖。

        綜上,該研究為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的穩(wěn)定應(yīng)用及性能改善提供參考的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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