李 哲，呂 劍，張宇軒，武 君，于曉斌，崔德杰

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264003；3. 魯東大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，山東 煙臺 264025)

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，未被利用的殘餌以及水生動物產(chǎn)生的糞便直接排入水體，使養(yǎng)殖水體中氮素含量和有機(jī)物含量較高，造成水體富營養(yǎng)化。水質(zhì)惡化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮等會毒害水生生物，使病害頻發(fā)，增加養(yǎng)殖成本[1]。因此，降低養(yǎng)殖水體中的氮濃度是目前養(yǎng)殖廢水處理的研究熱點(diǎn)[2]。生物脫氮被認(rèn)為是去除養(yǎng)殖廢水中氮元素最經(jīng)濟(jì)有效的方式，且無二次污染[3-5]。生物絮團(tuán)是由細(xì)菌、原生動物、微藻、有機(jī)碎屑等形成的絮狀物質(zhì)[6]，能夠通過細(xì)菌的氨化、硝化、反硝化及同化作用等將水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為自身的營養(yǎng)物質(zhì)[7]，降低有害氮素對水體的污染，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖水的循環(huán)利用，因此利用生物絮團(tuán)調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖污水得到了普遍關(guān)注。

在傳統(tǒng)的污水處理過程中，利用微生物脫氮時，硝化過程和反硝化過程必須分開進(jìn)行且必須保證嚴(yán)格的好氧和厭氧環(huán)境[8-9]。近年來，研究人員已發(fā)現(xiàn)并分離出一些同步進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的細(xì)菌[10]，突破了對傳統(tǒng)脫氮理論的認(rèn)識。在同一反應(yīng)容器中，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在硝化作用中將氨氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮甚至直接轉(zhuǎn)化成氮?dú)馊コ齕11]，在反硝化過程中，可以將硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮最后變成氣態(tài)氮脫除[12]。由于不涉及厭氧條件，減少了生物處理系統(tǒng)體積并且降低運(yùn)行所需能量，從而降低了運(yùn)行的成本，所以異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在生物脫氮方面具有巨大的優(yōu)勢[13]。生物絮團(tuán)是微生物的集合體，異養(yǎng)菌在生物絮團(tuán)的脫氮功能中起著重要作用，其中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌能同步進(jìn)行硝化和反硝化作用，因此，生物絮團(tuán)中的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌有待進(jìn)一步研究。

本文試驗(yàn)從水產(chǎn)養(yǎng)殖生物絮團(tuán)分離出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，并研究溫度、pH等因素對其生長狀況的影響以及菌株的脫氮性能，以期增加對生物絮團(tuán)中的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌種類和性能的認(rèn)識，為其在將來的應(yīng)用提供理論支持。

1 試 驗(yàn) 方 法

1.1 培養(yǎng)基

0.5 g硫酸銨、2.17 g琥珀酸鈉和50 mL維氏鹽溶液溶解后定容至1 L，配成富集培養(yǎng)基；6.5 gK2HPO4·3H2O、2.5 gMgSO4·7H2O、2.5 gNaCl、0.05 gFeSO4·7H2O和0.04 gMnSO4·H2O溶解后定容至1 L，配成維氏鹽溶液[14]。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基、好氧反硝化培養(yǎng)基、異養(yǎng)硝化好氧反硝化培養(yǎng)基均含有3.38 g琥珀酸鈉、50 mL維氏鹽溶液、950 mL H2O，溶液pH為7.0。此外，異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基含有0.5 g (NH4)2SO4，好氧反硝化培養(yǎng)基(亞硝酸鹽培養(yǎng)基)含有0.49 g NaNO2，好氧反硝化培養(yǎng)基(硝酸鹽培養(yǎng)基)含有0.61 g NaNO3，異養(yǎng)硝化好氧反硝化培養(yǎng)基(氨氮亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基)含有0.25 g (NH4)2SO4、0.25 g NaNO2，異養(yǎng)硝化好氧反硝化培養(yǎng)基(氨氮硝態(tài)氮培養(yǎng)基)含有0.25 g (NH4)2SO4、0.31 g NaNO3，以上培養(yǎng)基均置于高壓滅菌鍋中滅菌[15]。

1.2 分析方法

1.3 菌株的分離鑒定

取羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生物絮團(tuán)至富集培養(yǎng)基，在搖床中以溫度28℃，轉(zhuǎn)速170 r/min培養(yǎng)72 h，然后從中吸取10%至新的培養(yǎng)基，重復(fù)3次。取1 mL溶液，以10倍濃度梯度將溶液分別稀釋至10-8、10-9、10-10，從中各取0.1 mL涂布于固體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基，選出優(yōu)勢菌落搖床培養(yǎng)48 h，然后用接種環(huán)劃線分離接種到異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上，連續(xù)純化3次得到單菌。將分離得到的單菌接種到異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基，若氨氮濃度降低則菌株有異養(yǎng)硝化功能，后將菌株分別接種到亞硝酸鹽反硝化培養(yǎng)基和硝酸鹽反硝化培養(yǎng)基中，若亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的濃度降低則菌株具有好氧反硝化功能，從而篩選出脫氮效果良好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌。

將目的菌株活化后稀釋涂布至反硝化培養(yǎng)基, 觀察菌落形態(tài)特征。使用TIANGEN基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進(jìn)行，將獲得的PCR產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測序，得到測序結(jié)果后在NCBI中進(jìn)行Blast分析，通過MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 菌株的異養(yǎng)硝化影響因素研究

研究菌株不同的異養(yǎng)硝化影響因素時，均將1 mL菌株接種到100 mL配置的培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)72 h，每6 h取一次樣測OD600，另外取2 mL樣進(jìn)行離心，檢測上清液中的氨氮含量，其余各項(xiàng)試驗(yàn)條件如下(每個條件下設(shè)置3組平行試驗(yàn))。

pH：配置pH分別為5、6、7、8、9的液體培養(yǎng)基，丁二酸鈉為碳源，硫酸銨為氮源，C/N=10(質(zhì)量比)。設(shè)置搖床為溫度28℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。

溫度：設(shè)置搖床溫度分別為15℃、25℃、35℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。配置pH=7.0，丁二酸鈉為碳源，硫酸銨為氮源，C/N=10的培養(yǎng)基。

碳源：配置碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、淀粉、碳酸氫鈉，硫酸銨為氮源，C/N=10，pH=7.0的培養(yǎng)基。設(shè)置搖床為溫度28℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。

C/N：配置碳氮比分別是0、5、10、15、20、25、30，pH=7.0，丁二酸鈉為碳源，硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基。設(shè)置搖床為溫度28℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。

氨氮濃度：配置氨氮質(zhì)量濃度分別是50 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L，pH=7.0，丁二酸鈉為碳源，硫酸銨為氮源，C/N=10的培養(yǎng)基。設(shè)置搖床為溫度28℃，轉(zhuǎn)速為170 r/min。

1.5 菌株在異養(yǎng)硝化-好氧反硝化培養(yǎng)基中的脫氮特性研究

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

菌株L3在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形、乳白色，且表面光滑。對菌株L3的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1401 bp的序列。將菌株L3的16S rRNA基因序列經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株L3與假單胞菌同源性最高。利用MEGA X軟件對菌株L3構(gòu)筑系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。菌株L3與假單胞菌在同一發(fā)育地位，確定菌株L3為假單胞菌。

圖1 基于16S rRNA基因同源性構(gòu)建菌株L3與相關(guān)好氧反硝化菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of strain L3 based on partial 16S rRNA gene sequences with neighbor-joining analysis

2.2 pH對菌株生長和硝化性能的影響

pH影響細(xì)菌的生物活性，適宜的pH是細(xì)菌具有良好硝化特性的重要條件之一。由圖2可知，菌株L3在pH為5～9這一范圍內(nèi)均能生長。當(dāng)菌株培養(yǎng)30 h，相比于其他幾種條件，pH=5時菌株的生長速度緩慢，菌株到達(dá)生長峰值所需時間更長，且氨氮的去除速率最慢，推測知酸性條件不利于該菌株的生長及氨氮的去除。pH為6～9時，氨氮的最大去除率達(dá)到88.5%～94.2%，但當(dāng)菌株培養(yǎng)24 h，pH=9條件下氨氮的去除速率明顯低于其他3種pH條件下的氨氮去除速率。所以，保證菌株L3生長以及良好硝化作用的最適pH為6～8，與方海洋等[18]研究中菌株Alcaligenes faecalis No.4所得結(jié)果相同。

圖2 pH對菌株L3生長和硝化性能的影響Fig.2 Effect of pH on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.3 溫度對菌株生長和硝化性能的影響

溫度的改變可以通過影響蛋白質(zhì)的合成、微生物的代謝以及基因調(diào)控等過程對微生物造成廣泛的影響[19]。由圖3可知，在菌株L3培養(yǎng)30 h時，15℃條件下菌株生長緩慢，方開始進(jìn)入指數(shù)增長期，而25℃條件下菌株即將達(dá)到生長峰值，35℃條件下菌株已經(jīng)達(dá)到生長峰值。此外，15℃條件下氨氮的最大去除率為72.0%，同樣低于25℃時的97.1%和35℃時的97.7%，溫度為15℃時不利于菌株L3生長及對氨氮的去除。因此，適合菌株L3生長的最適溫度是25～35℃，與姜磊等[20]研究中YX-6菌所得適宜溫度范圍一致。

圖3 溫度對菌株L3生長和硝化性能的影響Fig.3 Effect of temperature on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.4 碳源對菌株生長和硝化性能的影響

碳源是菌株硝化過程中的電子供體，同時為菌株生命活動提供所需能量[21]。由圖4可知，菌株L3在以葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉為唯一碳源時均能生長，其中丁二酸鈉作碳源時菌株L3的OD600最高，檸檬酸鈉次之，但兩者數(shù)值相近，以蔗糖、淀粉為唯一碳源時，OD600很小，推測是由于不同碳源有不同的分子結(jié)構(gòu)，有機(jī)酸相較于糖類更易于被菌株利用[22]。以碳酸氫鈉為唯一碳源時，菌株不生長。以丁二酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉為唯一碳源時，氨氮的去除率較高，最高去除率分別為96.1%、87.5%和74.7%。以葡萄糖、蔗糖、淀粉、碳酸氫鈉為唯一碳源時，氨氮的去除率小于27.5%。由此推知，適宜菌株L3生長的最佳碳源是丁二酸鈉，與王田野等[23]研究菌株SQ2得到的結(jié)果一致。

圖4 碳源對菌株L3生長和硝化性能的影響Fig.4 Effect of carbon source on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.5 C/N對菌株生長和硝化性能的影響

由圖5可知，C/N=0時，菌株L3不生長，C/N=5時，菌株L3生長量較低，且氨氮去除量較低，由于沒有足夠的能量供菌株生長，影響了菌株的異養(yǎng)硝化特性[24]。C/N為10～30時，氨氮的最大去除率達(dá)到88.8%～96.8%。培養(yǎng)72 h時，盡管C/N=30時菌株OD600最高，但是碳氮比過高時會造成資源浪費(fèi)，當(dāng)菌株培養(yǎng)6～18 h，C/N為10和15條件下，氨氮的去除速率明顯高于其他碳氮比條件下的去除速率。綜合考慮，菌株L3生長的適宜C/N為10～15。

圖5 C/N對菌株L3生長和硝化性能的影響Fig.5 Effect of C/N on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.6 氨氮負(fù)荷對菌株生長和硝化性能的影響

相比自養(yǎng)菌，異養(yǎng)菌通?？梢赃m應(yīng)高濃度氨氮廢水[25]。如圖6所示，氨氮初始質(zhì)量濃度為50 mg/L時，菌株OD600最低為1.1，在高氨氮濃度下，菌株L3均生長良好，說明菌株耐受氨氮負(fù)荷范圍廣泛。試驗(yàn)中因異養(yǎng)菌利用外部碳源，TOC濃度較初始濃度大幅降低。亞硝態(tài)氮幾乎無積累，硝態(tài)氮與羥胺有少量積累。在50 mg/L、200 mg/L氨氮負(fù)荷下，氨氮最大去除率分別高達(dá)98.5%和93.9%，在500 mg/L、1 000 mg/L氨氮負(fù)荷下，氨氮去除率分別為51.9%和39.8%。盡管隨著氨氮初始濃度的增高，氨氮去除率有所降低，但菌株L3生長并未受到影響，且高于顏薇芝等[22]研究中的菌株YN3的氨氮耐受范圍，所以菌株L3有潛在的實(shí)際應(yīng)用價值。

圖6 氨氮負(fù)荷對菌株L3生長和硝化性能的影響Fig.6 Effect of ammonia nitrogen loading on growth and nitrifying capacity of strain L3

2.7 菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性研究

為研究菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性，將菌株分別接種到含有硫酸銨亞硝酸鈉以及含有硫酸銨硝酸鈉的培養(yǎng)基中，結(jié)果見圖7。在含有硫酸銨和亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中，0～30 h內(nèi)，菌株一直處在迅速生長狀態(tài)，OD600最大值為1.5，此時總氮、氨氮和亞硝態(tài)氮均處于迅速去除階段，這3種物質(zhì)最大去除率分別為88.3%、95.8%和95.4%。0～6 h，亞硝態(tài)氮含量不斷增加，推測原因?yàn)榫陜?yōu)先利用氨氮。在含有硫酸銨和硝酸鈉的培養(yǎng)基中，OD600最大值為1.5，亞硝態(tài)氮有少量積累。硝態(tài)氮的去除速率在0～12 h較低，而后升高，推測是由于菌株優(yōu)先進(jìn)行硝化作用。總氮、氨氮和硝態(tài)氮的最大去除率分別是90.6%、93.9%、97.7%。由此推知，菌株L3在2種培養(yǎng)基中均能優(yōu)先利用氨氮進(jìn)行異養(yǎng)硝化作用，且都有良好的脫氮效果。

圖7 菌株L3在同步硝化反硝化過程中的物質(zhì)變化曲線Fig.7 Changing curves of substances during the process of bacterial simultaneous nitrification and denitrification

3 結(jié) 語

筆者從水產(chǎn)養(yǎng)殖生物絮團(tuán)中分離出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌L3，通過對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA基因序列分析，確定此菌株為假單胞菌。通過對不同影響因素下菌株的異養(yǎng)硝化能力進(jìn)行研究，得到適宜菌株生長的最佳pH為6～8，最適宜溫度是25～35℃，最佳碳源是丁二酸鈉，最佳碳氮比為10～15，菌株能耐受高濃度氨氮負(fù)荷。對菌株脫氮性能的研究表明，在異養(yǎng)硝化-好氧反硝化培養(yǎng)基中，菌株優(yōu)先利用氨氮進(jìn)行異養(yǎng)硝化反應(yīng)且有良好的脫氮效果。因此，從水產(chǎn)養(yǎng)殖生物絮團(tuán)中分離得到的具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能的菌株L3有運(yùn)用到未來實(shí)際生產(chǎn)工作的巨大潛力。