萬陽浴,劉銀坤,許小紅△

1.四川科倫藥業(yè)股份有限公司(成都 610071)；2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610500)

丙戊酸鈉是一種不含氮的廣譜抗癲癇藥，對(duì)多種原因引起的驚厥有不同程度的對(duì)抗作用，對(duì)各型癲癇如各型小發(fā)作、肌陣攣性癲癇、局限性發(fā)作、大發(fā)作和混合型癲癇均有效，臨床上多與其他產(chǎn)品聯(lián)合治療癲癇類疾病[1]?？诜湛於耆饕植荚诩?xì)胞外液，在血中大部分與血漿蛋白結(jié)合。根據(jù)廠家的合成工藝路線得知，該產(chǎn)品在合成工藝中所用的醋酸可能殘留到產(chǎn)品中，而醋酸對(duì)人體皮膚、黏膜等具有一定的刺激性，現(xiàn)有的藥典中未涉及到丙戊酸鈉中殘留醋酸含量測(cè)定；為保證丙戊酸鈉原料藥的質(zhì)量，同時(shí)確保其注射液、片劑等制劑產(chǎn)品的用藥安全，因此有必要對(duì)其殘留含量進(jìn)行研究，控制其殘留量在中華人民共和國藥典二部2015版[2]規(guī)定的0.5%限度范圍內(nèi)。

查閱相關(guān)研究[3]發(fā)現(xiàn)，醋酸的含量測(cè)定方法主要有酸堿滴定法、酶法、氣相色譜法和液相色譜法。有實(shí)驗(yàn)[4-8]使用氣相色譜法測(cè)定自制生長(zhǎng)抑素中醋酸含量，利用氣相色譜儀測(cè)定氫化可的松中殘留的醋酸，發(fā)現(xiàn)氣相色譜法的重現(xiàn)性較差，而酶法和酸堿滴定法的干擾較大，且一般用于常量分析。中華人民共和國藥典二部2015版[2]所收載的醋酸測(cè)定方法和文獻(xiàn)報(bào)道的方法多以液相色譜法為主，近年來有大量關(guān)于使用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定醋酸含量的研究[9-11]報(bào)道，結(jié)果均表明此方法良好。目前尚無關(guān)于丙戊酸鈉中醋酸含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙⑹褂肏PLC測(cè)定丙戊酸鈉中醋酸含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津LC-2030C Plus高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器(日本島津公司)；CPA225D電子天平(德國賽多利斯公司)；pH計(jì)(德國賽多利斯公司)。丙戊酸鈉(批號(hào)：1808P109、1909P105、1910P029，由臺(tái)灣旭富制藥有限公司提供)；醋酸對(duì)照品(批號(hào)：2017032001，純度：以100.0%計(jì)算，由成都科隆化學(xué)品有限公司提供)；甲醇為色譜純(成都科隆化學(xué)品有限公司)，磷酸為分析純，水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱為Nano ChromCore C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以磷酸水溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3)為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積10 μL(表1)。

表1 HPLC洗脫程序

1.3 溶液制備

1.3.1 空白溶液(稀釋劑) 量取超純水950 mL，用磷酸調(diào)pH至2.3，加入甲醇，混勻，即得。

1.3.2 對(duì)照品溶液 取醋酸對(duì)照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含10 μg的溶液，即得。

1.3.3 供試品溶液 取丙戊酸鈉適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋劑制成每1 mL中約含丙戊酸鈉2 mg的溶液，即得。

1.3.4 混合溶液 取丙戊酸鈉適量，精密稱定，加對(duì)照品溶液溶解并定量稀釋劑制成每1 mL中分別約含丙戊酸鈉2 mg、醋酸10 μg的溶液，即得。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

精密量取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，相關(guān)圖譜如下(圖1)。結(jié)果表明，空白及供試品均不干擾供試品溶液中醋酸測(cè)定，醋酸峰與相鄰峰間分離良好。

圖1 專屬性色譜圖

2.2 系統(tǒng)適用性

精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果表明，醋酸峰的保留時(shí)間RSD為0.05%，峰面積RSD為0.5%，理論板數(shù)均>7 000，拖尾因子均<1.4，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 靈敏度

取醋酸對(duì)照品溶液，用稀釋劑逐級(jí)稀釋，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比(S/N)約為10∶1為定量限，結(jié)果為5.4 ng，相當(dāng)于供試品進(jìn)樣量的0.03%；按信噪比約為3∶1為檢測(cè)限，結(jié)果為1.6 ng，相當(dāng)于供試品進(jìn)樣量的0.01%，靈敏度能滿足檢測(cè)要求。

2.4 重復(fù)性

根據(jù)專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，供試品中無醋酸檢出，故取同一批供試品(批號(hào)：1808P109)平行配制6份混合溶液，按照“1.2”色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算混合溶液中加入醋酸的回收率，各回收率均在99.0%～101.0%，RSD為0.7%，重復(fù)性良好。

2.5 線性關(guān)系

精密量取100 mg/L的醋酸對(duì)照品溶液0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀釋劑定容，搖勻，另取“2.3”項(xiàng)下定量限溶液。分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以醋酸對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)線性關(guān)系圖，得到線性回歸方程為Y =717.89X +26.96，相關(guān)系數(shù)r為1.000 0(圖2)。結(jié)果表明，醋酸在進(jìn)樣濃度0.54～21.66 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 醋酸線性關(guān)系圖

2.6 回收率

取丙戊酸鈉約50 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，共9份，分成3組，備用。每組分別加入0.25 g/L的醋酸對(duì)照品溶液各0.5、1.0、1.5 mL，按照“1.2”色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算醋酸回收率，低、中、高3個(gè)濃度回收率(n=3)分別為100.4%、100.2%、100.9%，總回收率(n=9)為100.5%，RSD(n=9)為1.1，結(jié)果表明本研究方法準(zhǔn)確度良好(表2)。

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果表

2.7 溶液穩(wěn)定性

取同1份對(duì)照品溶液(同“1.3.2”項(xiàng)配制)和混合溶液(同“1.3.4”項(xiàng)配制)于冰箱中冷藏保存，分別于0、3、5 d取出，按“1.2”項(xiàng)色譜條件檢測(cè)對(duì)照品溶液中醋酸含量和混合溶液中醋酸回收率，測(cè)得其RSD分別為2.3%和1.9%。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和混合溶液于冰箱中冷藏保存5 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品中醋酸含量測(cè)定

取3批丙戊酸鈉原料藥，同“1.3.2”和“1.3.3”項(xiàng)制備方法，分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，參照“1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示各批次樣品中均未檢出醋酸殘留。

3 討論

3.1 pH確定

采用中華人民共和國藥典二部2015版[2]中所收載的測(cè)定醋酸的方法，醋酸峰峰形較差，可能與丙戊酸鈉的存在有關(guān)，調(diào)節(jié)pH至2.5以下可獲得良好峰形，但同時(shí)考慮到色譜柱的pH承受范圍，故選擇了pH為2.3。

3.2 色譜柱確定

在方法開發(fā)階段，選擇用C18色譜柱也能獲得峰形良好的醋酸峰，但丙戊酸鈉在C18填料的色譜柱上保留過強(qiáng)，不出峰。為防止進(jìn)樣過多導(dǎo)致色譜柱堵塞，故更換C8填料的色譜柱，使供試品中主成分丙戊酸鈉能正常洗脫。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了使用HPLC測(cè)定丙戊酸鈉中醋酸含量的方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明此方法良好，確認(rèn)可行。