王院霞，姚鋰鳳，鄭巧平，陳 旭

（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院檢驗科，上海 200011）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的重要病原體，可導致皮膚軟組織感染（如癤、癰、手術傷口感染、創(chuàng)面感染）和侵襲性感染（如骨髓炎、關節(jié)炎、膿毒癥）等[1-4]。MRSA 感染于1961 年由英國首次報道，后相繼在其他國家出現(xiàn)，并在全球的醫(yī)院環(huán)境中流行傳播。20 世紀90 年代起，MRSA 不再局限于醫(yī)院或醫(yī)療環(huán)境中，世界各地相繼報道了社區(qū)獲得MRSA（community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus,CA-MRSA）感染[5-7]。由此，MRSA 可以分為醫(yī)療機構獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（healthcare-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus，HA-MRSA）和CA-MRSA。HA-MRSA 與CA-MRSA在分子特征、耐藥性及毒力因子等方面均具有一定差異。我國HA-MRSA 克隆一般攜帶葡萄球菌盒式染色體基因mec （Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）Ⅱ和Ⅲ，而CA-MRSA 一般攜帶SCCmec Ⅳ和Ⅴ。HA-MRSA 通常具有多重耐藥性，而CA-MRSA 一般僅對β-內酰胺類抗生素耐藥；CA-MRSA 通常攜帶較多的毒力基因[如殺白細胞素基因 （panton-valentine leukocidin gene,pvl 基因）]，具有較強的致病性。隨著人群（主要為患者）在醫(yī)院環(huán)境和社區(qū)環(huán)境中的相互流通，CA-MRSA也開始逐漸進入醫(yī)院環(huán)境中，并引起相應的感染，且隨著CA-MRSA 菌株的進化，CA-MRSA 開始對多種非β-內酰胺類抗生素產生耐藥性。本研究收集2014 年4 月至2015 年12 月期間住院患者臨床分離的CA-MRSA 菌株，并對其進行分子特征和耐藥性分析，目前國內尚無類似報道，為進一步監(jiān)測CA-MRSA 流行、治療提供研究基礎。

材料與方法

一、材料

收集2014 年4 月到2015 年12 月期間符合CA-MRSA 診斷標準的住院患者臨床分離的金黃色葡萄球菌菌株，采用VITEK-2 鑒定系統(tǒng)（生物梅里埃公司，法國）進行鑒定。菌株純化后保存于含30%甘油的肉湯中，置于-80 ℃深低溫冰箱內保存。CAMRSA 感染診斷依據(jù)美國疾病預防控制中心在2003 年公布的CA-MRSA 的診斷標準，具體如下。①在門診或入院后48 h 內的送檢標本中檢測出MRSA；②患者在過去1 年內無住院、無外科手術、無透析、無人住家庭病房、無使用護理設施等；③患者無持續(xù)性留置導管或經(jīng)皮進入身體的醫(yī)療裝置。同時符合以上條件者可診斷為CA-MRSA 感染。

二、方法

1.SCCmec 分型：根據(jù)SCCmec 中ccr 基因復合物和mec 基因復合物的不同（見表1），采用PCR 檢測ccr1-5、mec1 基因（mec 復合物A）、IS1272-mecR1基因（mec 復合物B）和IS431-mecA 基因（mec 復合物C2）。

表1 不同SCCmec 分型的基因結構組成

2.金黃色葡萄球菌A 蛋白（Staphylococcus protein A，SPA）基因分型：擴增并測序spa 基因X區(qū)域的重復序列，根據(jù)重復序列的數(shù)目、排列進行分型（https://spa.ridom.de/index.shtml）。

3.多位點序列分型 （multilocus-sequence typing，MLST）：檢測金黃色葡萄球菌7 個管家基因，與標準序列（http://saureus.mlst.net/）進行比對，得到相應的序列號，根據(jù)不同管家基因序列號組合得到相應的序列型（ST）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并測序。

4.藥物敏感試驗：參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南，采用紙片擴散法檢測菌株對青霉素、頭孢西丁、慶大霉素、妥布霉素、紅霉素、克林霉素、磺胺甲唑、利福平、利奈唑胺、莫匹羅星、夫西地酸和替考拉寧等藥物的敏感性；誘導性克林霉素耐藥試驗采用D-試驗法檢測，ATCC25923 作為質控菌株。

5.耐藥基因和毒力基因檢測：采用PCR 擴增并檢測mecA 基因、erm(A)、erm(B)、erm(C)基因、pvl基因等[3,8]，擴增引物序列見表2。

結 果

一、CA-MRSA 菌株信息

本研究共收集到147 株分離自住院患者標本中的金黃色葡萄球菌菌株，根據(jù)頭孢西丁紙片法和mecA 基因檢測確認，其中共58 株為mecA 基因介導的MRSA 菌株。進一步對這些菌株進行SCCmec分型，篩選出SCCmecⅣ型和Ⅴ型的MRSA 菌株（CA-MRSA 基因型菌株）共9 株，其中SCCmecⅣ型3 株，SCCmecⅤ型6 株。

二、MRSA 的分子特征

采用SPA 分型和MLST，對9 株CA-MRSA 菌株進行分析，共檢測到4 種SPA 型別，即t008（1 株）、t034（1 株）、t127（1 株）和t437（6 株）；ST 型別共5 種，包括ST1（1 株）、ST8（1 株）、ST59（5 株）、ST338（1 株）和ST804（1 株）。分子特征分析結果表明，CA-MRSA 中以t437-ST59 克隆為主，每個菌株的具體分子特征信息見表3。

三、CA-MRSA 對非β-內酰胺類抗生素耐藥性

采用紙片擴散法檢測CA-MRSA 對常用抗生素的敏感性，結果表明，CA-MRSA 對氨基糖甙類、大環(huán)內酯類和林可霉素類耐藥率高于β-內酰胺類抗生素。9 株CA-MRSA 菌株中有8 株對大環(huán)內酯類和林可霉素類耐藥，其中有2 株D-試驗陽性，為誘導性大環(huán)內酯和林可霉素及鏈陽霉素B 耐藥（inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B,iMLSB）表型，攜帶耐藥基因erm(C)，另外6 株D-試驗結果為陰性，表現(xiàn)為固有型大環(huán)內酯-林可霉素-鏈陽霉素B 耐藥 （constitutive macrolide-lincosamidestreptogramin B,cMLSB），由erm(B)基因介導。此外，有8 株CA-MRSA 菌株對氨基糖苷類抗生素產生耐藥，主要對卡那霉素耐藥，也有對妥布霉素耐藥及慶大霉素耐藥的菌株，每株CA-MRSA 具體的耐藥情況見表3。

四、CA-MRSA 菌株pvl 基因攜帶情況

9 株CA-MRSA 菌株中有5 株檢測出pvl 基因陽性，主要集中在t437-ST59 克隆（4 株），另外一株分子特征為t437-ST338，表明從這些住院患者標本中分離的CA-MRSA 具有典型的克隆流行特征，且攜帶pvl 基因。

表2 耐藥基因和毒力基因引物

表3 CA-MRSA 菌株的分子特征、耐藥情況及毒力基因

討 論

MRSA 是臨床上引起患者感染的重要病原體，由于其大多具有多重耐藥性，使得治療比較困難。近年來的臨床數(shù)據(jù)表明，毒力較強的CA-MRSA 菌株也正逐漸進入醫(yī)院環(huán)境中，引起住院患者的感染[2-3,9]。有研究報道，我國的HA-MRSA 流行克隆為ST239-SCCmecⅢ，CA-MRSA 流行克隆為ST59-SCCmecⅣ、ST59-SCCmecⅤ[1,10]。典型的CA-MRSA 菌株一般僅對β-內酰胺類抗生素耐藥，但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著菌株的進化，CA-MRSA 逐漸開始對非β-內酰胺類抗生素產生耐藥，尤其是對大環(huán)內酯和林可霉素等耐藥[2,9-11]。因此，對CA-MRSA 的耐藥性進行檢測，具有重要的臨床意義。本研究收集分離自住院患者標本的CA-MRSA 菌株，對其分子特征和耐藥性進行分析，為進一步監(jiān)測CA-MRSA 流行及治療、控制CA-MRSA 感染提供研究依據(jù)。

一、CA-MRSA 分子特征和耐藥性

本研究共收集到9 例CA-MRSA 菌株，在分子流行病學特征上有5 株為t437-ST59 型，與報道的CA-MRSA 流行克隆一致，表明CA-MRSA 菌株不再局限于社區(qū)環(huán)境，也進入了醫(yī)院環(huán)境中。2013 年，《公共科學圖書館病原體》雜志上一項數(shù)理模型研究[12]預測，CA-MRSA 菌株與HA-MRSA 菌株將會在彼此的環(huán)境中共存，認為由于HA-MRSA 菌株具有多重耐藥性，使其能在抗生素使用較多的醫(yī)院環(huán)境中流行，而CA-MRSA 菌株的耐藥性較低，則在社區(qū)流行傳播，但隨著抗生素的使用、菌株耐藥性的改變以及人群結構的變化，CA-MRSA 菌株會與HA-MRSA 菌株在醫(yī)院環(huán)境中同時存在。因此，采用傳統(tǒng)的流行病學定義對CA-MRSA 進行區(qū)分具有一定的局限性，采用分子特征對MRSA 菌株進行區(qū)分可以作為有效的實驗室依據(jù)。本研究的前期研究顯示，鼻腔攜帶MRSA 菌株在CA-MRSA 傳播中具有重要作用[13]，但該結論仍需進一步在大規(guī)模樣本中進行驗證。2011 年的美國傳染病學會指南指出，克林霉素、四環(huán)素及利奈唑胺等是治療CA-MRSA 感染的重要藥物，而耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，歐美地區(qū)CA-MRSA 對克林霉素和四環(huán)素的耐藥率為3%～24%[14]。另外一項來自國內的研究數(shù)據(jù)表明，我國的CA-MRSA 菌株對克林霉素的耐藥率竟高達92%[15]。這表明CA-MRSA 的耐藥性日益增加，且呈現(xiàn)對多種非β-內酰胺類抗生素耐藥（多重耐藥）的趨勢。在本研究的9 株CA-MRSA 菌株中，有8 株對紅霉素和克林霉素耐藥，進一步分析其耐藥表型，檢測耐藥基因后發(fā)現(xiàn)，CA-MRSA 中以cMLSB耐藥表型為主，主要為erm(B)基因介導，而HA-MRSA 中主要為erm(A)和erm(C)基因介導[13]，提示相對于erm(A)和erm(C)基因，erm(B)基因較小且位于可以水平傳播的質粒上，使得這種耐藥機制得以在菌株之間廣泛傳播[15]。結合分子特征與耐藥表型及機制可以發(fā)現(xiàn)，t437-ST59 克隆主要為erm(B)基因介導的cMLSB耐藥表型，其他克隆如t034-ST804、t008-ST8 具有erm(C)基因介導的iMLSB耐藥表型，因此在探索耐藥機制的同時，對CA-MRSA 菌株的分子特征進行研究，也具有重要意義。

二、pvl 基因表達差異

本研究對與CA-MRSA 密切相關的pvl 基因進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)9 株CA-MRSA 中有5 株攜帶pvl 基因，這表明并非所有的CA-MRSA 均攜帶pvl基因。近來有另一項研究發(fā)現(xiàn)，pvl 陰性CA-MRSA引起的感染增加，但從皮膚與軟組織中分離的CAMRSA 菌株pvl 基因的攜帶率仍然較高[16]，這值得進一步探究。雖然有些pvl 基因陽性的CA-MRSA菌株感染可以導致嚴重的感染性疾病，如壞死性筋膜炎，但pvl 基因在CA-MRSA 感染發(fā)病中的作用一直未能被完全確認，臨床上觀察到pvl 基因陽性CA-MRSA 與pvl 基因陰性CA-MRSA 所引起的感染率間差異無統(tǒng)計學意義[17]，這可能與其他的影響因素（如宿主免疫）有關。

總而言之，本研究對分離自住院患者標本的9 株CA-MRSA 菌株進行了分子特征及耐藥性分析，結果發(fā)現(xiàn)其中有5 株屬于流行克隆t437-ST59-SCCmecⅣ、t437-ST59-SCCmecⅤ；菌株對氨基糖苷類藥物（主要為卡那霉素）、紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，表明致病性較強的CA-MRSA 菌株正逐漸進入醫(yī)療環(huán)境中，同時其對非β-內酰胺類藥物的耐藥性也逐漸增加，提示臨床應加強監(jiān)控住院患者CA-MRSA 感染。