劉向梅，許達(dá)峰，王春玲，符于正，王丹，武金才

（海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 肝膽胰外科，海南 ?？?570000）

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在美國癌癥病死率中排第四[1]。在我國，據(jù)2018年國家癌癥中心發(fā)布的 2003—2013年居民癌癥數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌發(fā)病率排第10位，病死率排第5位，其1年和5年生存率分別為26%和8%[2-5]。

由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在確診時已處于晚期或轉(zhuǎn)移，患者常在確診后1年內(nèi)死亡。手術(shù)仍是胰腺癌治療的主要手段，但治療效果并不佳。NIMA相關(guān)激酶2（NIMA-related kinases 2，NEK2）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其主要功能是調(diào)控與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)的紡錘體組裝和中心體復(fù)制[6]。在食管鱗癌[7]、前列腺癌[8]、肝癌[9]、 口腔鱗狀細(xì)胞癌[10]及腎癌[11]中NEK2高表達(dá)，且NEK2高表達(dá)與預(yù)后差及腫瘤進展相關(guān)。然而，尚無研究探討NEK2在胰腺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。本研究旨通過免疫組化研究NEK2在人胰腺癌組織中的表達(dá)，并闡明其臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集

收集海南省人民醫(yī)院肝膽胰外科于2013年 1月—2014年12月接受胰腺癌切除術(shù)的患者組織標(biāo)本，共108例。胰腺導(dǎo)管腺癌有83例、黏液癌 22例，鱗癌3例；TNM分期I期15例、II期29例、III期64例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 按照NCCN指南[12]患者均接受胰腺癌切除術(shù)，其中59例患者接受胰十二指腸切除術(shù)，49例患者接受胰體尾切除術(shù)，且病理確診為胰腺癌；(2) 患者臨床及隨訪資料齊全。剔除標(biāo)準(zhǔn)：患者存在其他部位腫瘤，且不能行手術(shù)治療者。經(jīng)手術(shù)切除下來的胰腺癌組織，均保存于科室研究室-80 ℃冰箱，并經(jīng)石蠟包埋，經(jīng)組織切片切成4 μm的組織切片待做免疫組化檢測。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意實施。

1.2 病歷收集及隨訪

對108例胰腺癌患者的性別、年齡、吸煙、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、腫瘤大小、腫瘤部位、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA19-9）、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等一般資料進行收集，術(shù)后隨訪每3個月隨訪1次，采用電話或門診復(fù)診的形式隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者生存及復(fù)發(fā)等。定義無瘤生存時間為胰腺癌術(shù)后至復(fù)發(fā)時間，定義總生存時間為胰腺癌術(shù)后至死亡時間，平均隨訪時間（55.3±6.7）個月，2020年1月為截止時間，6年為最長隨訪時間，108例患者共有4例失訪, 失訪病例在生存曲線上為截斷值。

1.3 實驗試劑

NEK2羊抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗羊二抗購自美國cell signaling Technology公司，兩步法免疫組化試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.4 免疫組化和組化評分

對108 例石蠟組織標(biāo)本切成約4 μm 厚的切片，按兩步法行免疫組織化學(xué)染色，簡要步驟如下：將組織切片在65 ℃烘片后，用二甲苯及酒精梯度脫蠟，采用3%雙氧水室溫滅活過氧化物酶15 min，檸檬酸鈉行抗原修復(fù)，漂洗，3%胎牛血清蛋白封閉30 min后，加入NEK2羊抗人一抗（1:300），并在4 ℃下孵育過夜，漂洗3次，加入兔抗羊二抗（1:500），37 ℃下避光孵育2 h后加入顯色劑，設(shè)立陽性及陰性對照，當(dāng)淺黃色出現(xiàn)時終止染色，蘇木素復(fù)染。免疫組化評分采用國際通用的評分規(guī)則，即總評分=染色強度評分+陽性細(xì)胞百分比評分，其中陽性細(xì)胞＜5%計0分；陽性細(xì)胞5%～35%計1分；陽性細(xì)胞36%～65%計 2分；陽性細(xì)胞＞66%計3分。不顯色計0分；淺黃色計1分；棕黃色計2分；深褐色計3分?？偡帧?分，為高表達(dá)組，共63例；總分＜4分，為低表達(dá)組，共45例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計軟件采用SPSS 19.0版本，以例數(shù)（百分比）[n（%）]表示計數(shù)資料，NEK2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗，無瘤生存率及總生存率的差異采用Kaplan-Meier曲線和Log-rank比較，影響預(yù)后的單因素及多因素分析采用Cox風(fēng)險比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NEK2 在正常胰腺及胰腺癌組織中的表達(dá)

在正常胰腺組織中NEK2不表達(dá)，在胰腺癌組織中NEK2染色定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，在胰腺癌組織中NEK2高表達(dá)組有63例，占58.3%，NEK2低表達(dá)組有45例，占41.7%，NEK2在正常胰腺及胰腺癌組織中的典型組化圖見圖1。

圖1 免疫組化檢測NEK2 表達(dá)（×200） A：NEK2 在正常胰腺組織中呈陰性表達(dá)；B：NEK2 在胰腺癌組織中呈低表達(dá)；C：NEK2 在胰腺癌組織中呈高表達(dá)Figure 1 Immunohistochemical staining for NEK2 expression (×200) A: Negative NEK2 expression in normal pancreas tissue; B: Low NEK2 expression in pancreatic cancer tissue; C: High NEK2 expression in pancreatic cancer tissue

2.2 NEK2 的表達(dá)與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系

NEK2表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、CEA、腫瘤大小、腫瘤部位無明顯關(guān)系（均P＞0.05），而與CA19-9（P=0.015）、TNM分期（P=0.002）、腫瘤分化程度（P=0.034）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.043）明顯有關(guān)（表1）。

2.3 NEK2 的表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系

NEK2高表達(dá)組1、3、5年無瘤生存率分別為60.5%、20.7%、5.2%，NEK2低表達(dá)組1、3、5年無瘤生存率分別為75.4%、50.6%、24.9%，NEK2 高表達(dá)組無瘤生存率低于NEK2 低表達(dá)組（P=0.000）。NEK2高表達(dá)組1、3、5年總生存率分別為75.6%、42.2%、15.3%，NEK2低表達(dá)組1、3、5年總生存率分別為85.7%、60.6%、30.1%，NEK2高表達(dá)組總生存率低于NEK2低表達(dá)組（P=0.000）（圖2）。

2.4 影響胰腺癌無瘤生存率的危險因素分析

單因素分析示CA19-9、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NEK2高表達(dá)為影響無瘤生存率的危險因素，多因素分析示TNM分期（P=0.029）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.016）及NEK2高表達(dá)（P=0.032）為影響無瘤生存率的危險因素（表2）。

2.5 影響胰腺癌總生存率的危險因素分析

單因素分析示TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NEK2表達(dá)為影響總生存率的危險因素，多因素分析示TNM分期（P=0.035）、分化程度（P=0.042）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.006）及NEK2高表達(dá)（P=0.000）為影響總生存率的危險因素 （表3）。

表1 NEK2 的表達(dá)與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relationship between NEK2 expression and clinicopathologic factors of pancreatic cancer [n (%)]

圖2 不同NEK2 表達(dá)水平患者生存曲線 A：無瘤生存曲線；B：總生存曲線Figure 2 Survival curves of patients with different NEK2 expression levels A: Tumor-free survival curve; B: Overall survival curve

表2 影響胰腺癌患者無瘤生存率的危險因素分析Table 2 Analysis of risk factors influencing disease-free survival of pancreatic cancer patients

3 討 論

胰腺癌病情進展快，惡性程度高，全球范圍內(nèi)發(fā)病呈逐漸增加趨勢[13]，雖然手術(shù)可延長患者總生存時間，但僅20%的胰腺癌可手術(shù)切除，15%～20%的胰腺癌患者在確診時就是晚期不可切除狀態(tài)，總生存率較低[14-17]。盡管已經(jīng)有以手術(shù)為主、放化療為輔的胰腺癌綜合治療策略，由于缺乏可靠的早期標(biāo)志物，且容易發(fā)生血管浸潤轉(zhuǎn)移，在確診時多數(shù)患者處于晚期，胰腺癌患者中位生存期也僅6～12個月[18]。深入研究胰腺癌的發(fā)病機制對靶向藥物的研發(fā)，提升胰腺癌的治療水平極其重要。

遺傳不穩(wěn)定性是腫瘤發(fā)生的常見機制，一方面由于DNA損傷修復(fù)異常導(dǎo)致突變增加。另外，非整倍體和染色體不穩(wěn)定是常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的產(chǎn)生常是由于細(xì)胞有絲分裂失控、紡錘體形成異常所致[6]。染色體有絲分裂調(diào)控失常是多種惡性腫瘤發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。NEK2是中心體的一個核心組成原件，在細(xì)胞分裂周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NEK2能夠在有絲分裂的初始階段對多種蛋白磷酸化，導(dǎo)致中心體的正確分離，另外還可調(diào)節(jié)中心體中微管的結(jié)構(gòu)[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)NEK2作為絲氨酸/蘇氨酸激酶參與調(diào)控細(xì)胞周期，且可通過與多態(tài)性蛋白復(fù)合體異常結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞通過細(xì)胞周期檢驗點異常，最終形成非整倍體細(xì)胞，進而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能基因異常表達(dá)[20]。在乳腺癌中，NEK2及cyclin D1的異常高表達(dá)可能與中心體擴增而導(dǎo)致的癌癥發(fā)展有關(guān)[21]。

文獻[22]報道在乳腺癌細(xì)胞系中敲除NEK2基因會導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成被抑制，同時侵襲和遷移能力也有相應(yīng)削弱，另外癌細(xì)胞的凋亡顯著增加。在胰腺癌細(xì)胞系中也有類似的現(xiàn)象，敲除NEK2可抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[23]。在本研究中，通過免疫組化對108例胰腺癌組織的NEK2表達(dá)進行分析，發(fā)現(xiàn)NEK2在胰腺癌組織中表達(dá)高于正常胰腺組織，這提示NEK2可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。臨床病理相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NEK2高表達(dá)與CA19-9、TNM分 期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。進一步行生存分析發(fā)現(xiàn)，NEK2高表達(dá)組無瘤生存率及總生存率均低于NEK2低表達(dá)組，表明NEK2高表達(dá)提示胰腺癌患者術(shù)后預(yù)后不佳。具體的分子機制尚不清楚，已有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中，NEK2可通過激活PP1/Akt及Wnt信號途徑促進腫瘤發(fā)展[24]。PAKT/NF-кB和MMP也可被NEK2激活而促進肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[25]。在胰腺癌中，本研究推測NEK2的高表達(dá)可能通過影響染色質(zhì)穩(wěn)定性及非整倍體誘導(dǎo)，而導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移。

在尤文氏瘤和非霍奇金淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)， NEK2 mRNA表達(dá)水平與此類腫瘤表達(dá)密切相關(guān)[26]。而在濾皰性淋巴瘤惡化成侵襲性更高的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，NEK2高表達(dá)與腫瘤惡性程度相關(guān)，伴隨著患者存活期縮短，對化療反應(yīng)性也減弱[27]。在腎乳頭狀癌中，NEK2高表達(dá)的患者預(yù)后較差，NEK2高表達(dá)可作為影響腎乳頭狀癌預(yù)后的獨立危險因子[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NEK2表達(dá)為影響無瘤生存率的危險因素，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NEK2表達(dá)為影響總生存率的危險因子，NEK2高表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)。這些結(jié)果提示NEK2可作為胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)NEK2在胰腺癌中高表達(dá)，NEK2高表達(dá)與胰腺癌惡性臨床病理特征及預(yù)后差相關(guān)，NEK2高表達(dá)為影響胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后的獨立危險因素，可作為胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后判斷的指標(biāo)。