李銘旭，仲成成，張功銘，胡偉,3，王仲,3

（徐州醫(yī)科大學附屬連云港醫(yī)院 1.肝膽外科 2.病理科，江蘇 連云港 222001；3.南京醫(yī)科大學康達學院第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 連云港 222001）

胰腺癌是最惡性的消化道腫瘤之一，是所有癌癥中第四大致死原因[1-2]。胰腺癌早期癥狀不明顯，且易侵犯血管，80%～85%的患者在診斷時已經(jīng)失去了根治性切除的機會[3-4]。手術(shù)切除是唯一可能治愈胰腺癌的方法。然而，其高復發(fā)率嚴重阻礙了胰腺癌患者術(shù)后預后的改善[5]。早期診斷困難、腫瘤易轉(zhuǎn)移和多藥耐藥性是導致預后不良的重要原因[6-7]。因此揭示胰腺癌快速增殖和高度侵襲的分子機制，尋找重要的相關(guān)致病因子，明確細胞內(nèi)各分子間的調(diào)控機制，對胰腺癌患者的預后有重要意義。

DEP結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)1B（DEPDC1B）位于5號染色體12.1，最早是在人類乳腺癌細胞MDA-MB231中通過mRNA表達譜發(fā)現(xiàn)的[8]，并進一步發(fā)現(xiàn)在胎盤和睪丸中表達，而在心臟和小腸中很少表達。研究發(fā)現(xiàn)DEPDC1B調(diào)節(jié)多種細胞活動功能，包括細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期進展及細胞骨架結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)[9-10]。在口腔癌[11]、非小細胞肺癌[12]、前列腺癌[13]、肝癌[14]中DEPDC1B過度表達。目前DEPDC1B在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義尚未清楚。本研究通過檢索癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和高通量基因表達（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，研究DEPDC1B與胰腺癌患者預后的相關(guān)性，并通過免疫組織化學方法檢測和驗證DEPDC1B在胰腺癌組織中的表達情況，分析其與胰腺癌臨床病理特征及預后的關(guān)系，以期判斷其作為胰腺癌臨床預后指標的可能性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集下載及整理

下載并分析了GEO 數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌隊列GSE28735、GSE16515、GSE21501、GSE15471，并分析具有臨床預后資料的數(shù)據(jù)集GSE28735和GSE21501。從TCGA下載胰腺癌的RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床信息。缺乏臨床信息的患者被排除在外。

1.2 病例資料

選取2010—2019年連云港市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)切除的胰腺癌患者，97例患者具有完整的臨床病理。其中，男性59例，女性38例；年齡37～92歲，中位年齡63歲。所有標本術(shù)后病理均證實為胰腺導管癌，高中分化66例，低分化31例。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標準：I～IIA期51例，IIB～IV期46例。所有入組患者術(shù)前均未接受任何針對腫瘤的治療。

1.3 組織學檢查及免疫組織化學檢查

手術(shù)切除的胰腺癌與癌旁組織標本經(jīng)4%多聚甲醛固定包埋在石蠟后切成4 μm厚的切片。之后切片脫水、固定并用蓋玻片覆蓋。根據(jù)公布的方案進行IHC試驗[15]。樣品與抗DEPDC1B的兔多克隆抗體一起孵育（5 g/mL稀釋，PA5-72875，Invitrogen，CA，美國）。

1.4 免疫組化評分

免疫組化評分[16-17]由陽性細胞比率和染色強度組成，根據(jù)陽性細胞比率：＜25%為1 分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將DEPDC1B表達的陽性細胞比率和染色強度相乘，陽性細胞率與染色強度之積分為0～4分為DEPDC1B陰性表達，5～12分為陽性表達；由2名病理醫(yī)師采用雙盲法獨立評估免疫組化評分。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用了R包中的“survival”、“survminer”來確定生存曲線的最佳截斷值來繪制Kaplan-Meier 生存率曲線[18-19]，臨床相關(guān)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，使用單因素和多因素Cox回歸分析來比較DEPDC1B對預后的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

2.1.1 DEPDC1B 在胰腺癌組織中高表達通過TCGA、GEO 數(shù)據(jù)庫分析DEPDC1B 在腫瘤組織和非腫瘤正常組織中的表達水平，結(jié)果顯示，在TCGA、GSE16515、GSE15471、GSE28735 數(shù) 據(jù)集中，胰腺癌組織中的DEPDC1B 表達量明顯高于非腫瘤正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（TCGA：P=0.002；GSE16515、GSE15471、GSE28735：均P＜0.001）（圖1）。

圖1 在匹配的非腫瘤組織與腫瘤組織DEPDC1B 基因表達的比較 A：TCGA；B：GSE16515；C：GSE15471；D：GSE28735Figure 1 Comparison of DEPDC1B gene expressionSBetween cancer tissues and paired non-tumoral tissues A: TCGA; B: GSE16515; C: GSE15471; D: GSE28735

2.1.2 DEPDC1B 表達與胰腺癌預后的關(guān)系為進一步明確DEPDC1B 的表達與胰腺癌患者預后之間的關(guān)系，在GSE28735 數(shù)據(jù)集和TCGA 數(shù)據(jù)集中提取了有關(guān)DEPDC1B 的臨床相關(guān)參數(shù)，選取最佳截斷值后運用Kaplan-Meier 生存曲線進行分析。GSE28735 與TCGA 中，DEPDC1B 的低表達與良好的預后明顯有關(guān)（GSE28735：P=0.032；TCGA：P＜0.001）（圖2A-B），在GSE21501 中DEPDC1B 表達與胰腺癌患者預后無明顯相關(guān)性（P=0.14）（圖2C）。

圖2 DEPDC1B 表達與胰腺癌預后的關(guān)系 A：GSE28735；B：TCGA；C：GSE21501Figure 2 Relationship between DEPDC1B expression and prognosis of pancreatic cancer A: GSE28735; B: TCGA; C:GSE21501

2.1.3 胰腺癌患者預后影響因素Cox 單因素分析發(fā)現(xiàn)，在TCGA 數(shù)據(jù)集中，DEPDC1B 的表達水平、年齡與胰腺癌患者預后明顯有關(guān)（均P＜0.05），腫瘤分期、性別與胰腺癌患者總體生存率無明顯關(guān) 系（ 均P＞0.05）； 在GSE21501 數(shù) 據(jù) 集 中， N 分期與胰腺癌患者預后明顯有關(guān)（均P＜0.05），DEPDC1B 表達水平、腫瘤分期、性別與胰腺癌患者總體生存率無明顯關(guān)系（均P＞0.05）。多因素分析發(fā)現(xiàn)，在TCGA 數(shù)據(jù)集中，DEPDC1B 的表達水平、年齡與胰腺癌患者預后的獨立影響因素（均P＜0.05），腫瘤分期、性別與胰腺癌患者總體生存率無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 3 個隊列總生存率影響因素的單變量和多變量分析Table 1 Univariate and multivariate analysis of the influencing factors for overall survival rates in the 3 cohorts

2.2 臨床標本分析結(jié)果

2.2.1 DEPDC1B 在胰腺癌及癌旁組織中的表達通過上述數(shù)據(jù)集的結(jié)果，收集我院97 例胰腺癌患者的臨床樣本及數(shù)據(jù)，通過免疫組化方法進一步驗證上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DEPDC1B 主要表達于胰腺癌細胞的胞漿，DEPDC1B 蛋白的陽性表達率為69.07%（67/97）；而在癌旁組織中DEPDC1B 陽性表達率僅為11.34%（11/97），低于胰腺癌組織（χ2=62.058，P＜0.001）（圖3）。

2.2.2 DEPDC1B 表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系在97 例胰腺癌患者中，DEPDC1B 表達與胰腺癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.031、P＜0.001、P＜0.001），而與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、神經(jīng)浸潤、血管侵犯及遠處轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05） （表2）。

圖3 免疫組化檢測DEPDC1B 的表達（×100）Figure 3 Immunohistochemical staining for DEPDC1B expression (×100)

表2 DEPDC1B表達與胰腺癌患者臨床特征的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations if DEPDC1B expression with the clinicopathologic features of pancreatic cancer patients [n (%)]

2.2.3 DEPDC1B 表達與胰腺癌患者預后的關(guān)系在97 例胰腺癌患者中，采用Kaplan-Meier 生存曲線發(fā)現(xiàn)DEPDC1B 表達與預后明顯有關(guān)（P＜0.001）（圖4）；Cox 單因素分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織中DEPDC1B 表達、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與胰腺癌預后有關(guān)（P=0.001、P=0.019、P=0.007），而患者年齡、性別、腫瘤大小、部位、分化程度及神經(jīng)浸潤與預后無關(guān)（均P＞0.05）。Cox 多因素回歸分析結(jié)果顯示DEPDC1B 表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素（HR=1.126，95%CI=1.012～1.253，P=0.029；HR=4.198，95%CI=1.105～15.954，P=0.035）（表3）。

圖4 97 例胰腺癌患者中不同DEPDC1B 表達水平患者的生存曲線Figure 4 Survival curves of cases with different DEPDC1B expression levels in the 97 pancreatic cancer patients

表3 97 例胰腺癌患者預后因素的Cox 回歸模型分析Table 3 Cox regression model analysis of factors in the 97 pancreatic cancer patients

3 討 論

DEPDC1B基因包含兩個重要的結(jié)構(gòu)域：DEP結(jié)構(gòu)域和Rho-GAP結(jié)構(gòu)域[20-21]，DEP結(jié)構(gòu)域在介導膜定位和調(diào)節(jié)廣泛的細胞功能中起一定作用，例如確定細胞極性和測定視網(wǎng)膜感光細胞的高度特異度信號[22]；DEP結(jié)構(gòu)域還使蛋白質(zhì)能夠與G蛋白偶聯(lián)受體和帶負電荷的膜磷脂相互作用，并介導GPCR信號通路[23]；而Rho-GAP結(jié)構(gòu)域負責Rho-GAP酶信號轉(zhuǎn)導[9]。DEPDC1B可以與多種信號分子相互作用，從剪接調(diào)節(jié)劑到跨膜蛋白，DEPDC1B的表達受到P53的正向調(diào)控，這是由于DEPDC1B在轉(zhuǎn)錄起始處與P63存在結(jié)合位點[24-25]；此外，DEPDC1B是協(xié)調(diào)有絲分裂中死亡事件和細胞周期過程所必需的[26]。在口腔癌細胞系中，DEPDC1B通過Rac1-ERK1/2信號軸促進細胞的生長、侵襲，該過程主要由Rho-GAP結(jié)構(gòu)域介導[11]。 在非小細胞肺癌細胞系中，DEPDC1B通過激活Wnt/β-catenin通路來促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[12]。在膀胱癌細胞系中，DEPDC1B通過調(diào)控SHC1在膀胱癌中的發(fā)生發(fā)展從而起到腫瘤促進劑的作用[27]。在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中，小干擾RNA(siRNA)抑制內(nèi)源性DEPDC1表達抑制細胞活力并且誘導細胞凋亡[28]。DEPDC1B在非小細胞肺癌[12]、前列腺癌[29]中組織中高表達，且與病理分化程度相關(guān)。本研究顯示，在TCGA、GSE16515、GSE15471、GSE28735數(shù)據(jù)集中，胰腺癌組織中的DEPDC1B表達量顯著高于非腫瘤正常組織；而在97例胰腺癌患者組織中DEPDC1B的表達明顯高于癌旁組織，與上述結(jié)果一致，并且在低分化組中表達要明顯高于高分化組，表明了DEPDC1B與胰腺癌分化程度呈正相關(guān)，提示DEPDC1B的高表達可能與胰腺癌細胞的遷移和侵襲相關(guān)。

在惡性黑色素瘤中敲除DEPDC1B抑制了惡性黑色素瘤的細胞遷移和侵襲，而在惡性黑色素瘤組織中DEPDC1B的異位表達促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲[30]。此外，在口腔癌中，DEPDC1B在培養(yǎng)的胚胎成纖維細胞系中誘導細胞遷移，并在口腔癌細胞系中誘導細胞侵襲[11]。膠質(zhì)母細胞瘤細胞中DEPDC1B高表達可以促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖、侵襲[31]。筆者先前的細胞學實驗發(fā)現(xiàn)干擾DEPDC1B表達后能抑制胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和CFPAC-1的遷移和侵襲，過表達DEPDC1B反而起到促進作用[32]。DEPDC1B與胰腺癌臨床樣本的關(guān)系仍不明確，本研究發(fā)現(xiàn)DEPDC1B高表達與胰腺癌患者臨床分期較晚（IIB～IV）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。無論在TCGA、GSE28735數(shù)據(jù)集，還是我們97例胰腺癌樣本中，DEPDC1B低表達組與高表達組相比，具有生存優(yōu)勢，總生存期相對延長。提示DEPDC1B可能參與胰腺癌進展，可以作為預測胰腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的潛在指標，可能為尋找胰腺癌藥物治療靶點提供有用的信息。

本研究進一步分析來自TC G A 及GSE數(shù)據(jù)庫的RNA-seq數(shù)據(jù)及臨床信息，并使用Cox單因素及多因素分析，發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)庫中，DEPDC1B表達與胰腺癌患者預后密切相關(guān)，是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素；隨后對97例胰腺癌患者進行Kaplan-Meier生存分析及單因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，DEPDC1B陽性表達較陰性表達患者的生存時間縮短，預后相對較差。通過Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，DEPDC1B陽性表達可以作為判斷胰腺癌患者預后的獨立危險因素。與上述TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)果一致。

綜上所述，胰腺癌組織中高表達的DEPDC1B可能參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程，與胰腺癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后不良有關(guān),并可作為判斷胰腺癌預后的重要指標。