秦雯，陳泰文，鄭海平，楊建宇，朱小東

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院 1.病理科 4.腫瘤科，廣西 南寧 530199；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胃及腹部腫瘤病區(qū)，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

胰腺癌是一種致命性疾病。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，僅2019年美國大約有55770例被診斷為胰腺癌，而其中約45750例死于該疾病[1-2]；在我國，胰腺癌患者5年總生存率不足10%[3]。目前仍然缺乏胰腺癌檢測的敏感方法和有效的治療手段，并且大部分胰腺癌患者在確診時都有無法切除的局部浸潤灶或轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致其無法治愈[4]。長期以來，臨床上普遍采用特異度較差的胰腺癌腫瘤標(biāo)記物—血清中糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9），用于胰腺癌的篩查和輔助診斷；而CA19-9又稱為胃腸道相關(guān)抗原，在胰腺癌[5-6]、膽管癌[7-8]、結(jié)腸癌[9-10]和胃癌[11-12]等腫瘤中都會升高。不僅如此，CA19-9 水平的升高常發(fā)生在胰腺癌的晚期。因此，發(fā)現(xiàn)潛在的胰腺癌標(biāo)志物，并探索其與臨床病理特征的關(guān)系，對于胰腺癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義。血管生成素樣蛋白2（angiopoietin-like protein 2，ANGPTL2）由Kim等[13]在1999年首次確認(rèn)及克隆，是分子質(zhì)量為57kDa的分泌性糖蛋白。ANGPTL2具有廣泛的生物學(xué)功能，在炎癥[14]、 腫瘤[15-16]、肥胖、胰島素抵抗及相關(guān)代謝性疾 病[17-18]中均見報道，而上述因素幾乎都是胰腺癌的高危因素，因此筆者推測ANGPTL2有成為胰腺癌診斷標(biāo)志物的潛質(zhì)。本研究檢測胰腺癌患者血清ANGPTL2水平，探討其用于胰腺癌診斷的實(shí)用價值和與臨床病理特征的關(guān)系，以期為胰腺癌的臨床診斷及評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2018年1月間在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院被確診為胰腺癌的 125例患者的血清標(biāo)本。其中，男69例，女56例，分別占所有患者的55.2%、44.8%，男女比例為1.23:1；年齡為（62.06±8.27）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 留取血清標(biāo)本后行胰腺癌根治手術(shù)或姑息手術(shù)，術(shù)前穿刺或術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為胰腺導(dǎo)管腺癌者；(2) 術(shù)前未進(jìn)行放射治療、化學(xué)治療、新輔助治療或免疫治療；(3) 具有完整的臨床和隨訪信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 合并其他部位惡性腫瘤患者；(2) 有既往惡性腫瘤病史者；(3) 臨床資料不完整者。另選同期健康體檢者66 例作為健康對照組，其中男36 例，女30 例；年齡為（62.91±8.77）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會核準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

血清ANGPTL2的檢測使用中國武漢USCN生命科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒，儀器為美國Thermo公司生產(chǎn)的Multiskan酶標(biāo)儀。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄所有入組者的基本臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、腫瘤分期等；其中腫瘤分期采用2018版美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）推出的胰腺癌分期系統(tǒng)進(jìn)行分期；記錄所有入組者的實(shí)驗室指標(biāo)；同時以胰腺癌組患者ANGPTL2水平的平均值為界把胰腺癌患者分為ANGPTL2 高表達(dá)組和ANGPTL2低表達(dá)組。

1.4 實(shí)驗方法及步驟

用ELISA法測定血清ANGPTL2濃度。根據(jù)試劑盒要求在室溫下嚴(yán)格進(jìn)行試驗操作，檢測波長為450 nm。所有樣本設(shè)置2個復(fù)孔檢測A值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為濃度，結(jié)果取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0及Graph Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；相關(guān)性分析使用Spearman檢驗；胰腺癌危險因素采用單因素和多因素分析；診斷價值及聯(lián)合診斷價值采用ROC曲線進(jìn)行分析，曲線下面積（area under curve，AUC）＞0.700提示診斷價值較高；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況及實(shí)驗室指標(biāo)

胰腺癌組和健康對照組的一般情況及實(shí)驗室指標(biāo)比較，兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05）；胰腺癌組身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）和總膽固醇水平均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；胰腺癌組C反應(yīng)蛋白、ANGPTL2、CA19-9、甘油三酯水平均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

表1 一般情況及實(shí)驗室指標(biāo)Table 1 General condition and laboratory indexes

2.2 血清ANGPTL2 水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌患者血清ANGPTL2的高表達(dá)與腫瘤的大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

2.3 血清ANGPTL2 水平與CA19-9 水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清ANGPTL2水平與CA 19-9 水平呈明顯正相關(guān)（r=0.772，P＜0.001）（圖1）。

表2 血清ANGPTL2 水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of ANGPTL2 level with the clinicopathologic factors of Pancreatic Cancer patients [n (%)]

圖1 血清ANGPTL2 與CA19-9 的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis of serum ANGPTL2 and CA19-9

2.4 胰腺癌危險因素的單因素和多因素分析

單因素分析顯示，糖尿?。≒=0.002）、高血壓（P=0.041）、甘油三酯（P=0.009）和ANGPTL2（P=0.002）是引起胰腺癌的危險因素（表3）。多因素分析顯示，糖尿?。≒=0.016）和ANGPTL2（P=0.014）是引起胰腺癌的獨(dú)立危險因素（表4）。

表3 胰腺癌危險因素單變量分析Table 3 Univariate analysis of risk factors for pancreatic cancer

表4 胰腺癌危險因素多變量分析Table 4 Multivariate analysis of risk factors for pancreatic cancer

2.5 血清ANGPTL2、CA19-9 及兩者聯(lián)合檢測對胰腺癌的診斷價值

ROC曲線分析顯示，血清CA19-9用于胰腺癌診斷的AUC為0.953（95%CI=0.927～0.979），血清ANGPTL2用于胰腺癌診斷的AUC為 0.939（95%C I=0.905 ～0.973）（圖2A）；ANGPTL2 聯(lián)合CA19-9 用于胰腺癌診斷的A U C為0.966（95%CI=0.944～0.987）（圖2B）。CA19-9單獨(dú)用于胰腺癌診斷取臨界值為25.035時，診斷敏感度為91.2%，特異度為84.8%，陽性預(yù)測值為91.9%，陰性預(yù)測值為83.6%，Youden指數(shù)為0.760。ANGPTL2 單獨(dú)用于胰腺癌診斷取臨界值為4.555 時，診斷敏感度為88.8%，特異度為92.4%，陽性預(yù)測值為95.7%，陰性預(yù)測值為81.3%，Youden指數(shù)為0.812。ANGPTL2+ CA19-9聯(lián)合診斷胰腺癌取臨界值為6.344時，診斷敏感度為86.4%，特異度為98.5%，陽性預(yù)測值為96.4%，陰性預(yù)測值為80.2%，Youden指數(shù)為0.849（表5）。

圖2 ROC 曲線 A：血清ANGPTL2 與CA19-9 用于胰腺癌診斷的ROC 曲線；B：血清ANGPTL2 聯(lián)合CA19-9 用于胰腺癌診斷的ROC 曲線Figure 2 ROC curves A: ROC curves of serum ANGPTL2 and CA19-9 for pancreatic cancer diagnosis; B: ROC curve of combined detection of ANGPTL2 and CA19-9 for pancreatic cancer diagnosis

表5 血清ANGPTL2、CA19-9 對胰腺癌的診斷價值Table 5 Diagnostic value of serum ANGPTL2 and CA19-9 in pancreatic cancer

3 討 論

胰腺癌是一種高度惡性腫瘤，但由于其發(fā)病早期癥狀和體征不典型，容易引起誤診和漏診。目前對于胰腺癌的診斷主要依賴于B超引導(dǎo)下穿刺病理活檢，難以應(yīng)用于大規(guī)模人群的篩查。血清學(xué)生物標(biāo)志物CA19-9雖然檢測較為方便，但是仍存在特異度不足和敏感度不高的缺點(diǎn)。因此，尋找新的檢測指標(biāo)用于胰腺癌的診斷和病情判斷有著重要意義。

眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展與腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞分泌因子表達(dá)的改變有關(guān)。有研究報道，血管生成素樣蛋白家族（angiopoietin-like proteins，ANGPTL）也參與到細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移的過程中。目前發(fā)現(xiàn)ANGPTL有7個成員，即ANGPTL1至7。ANGPTL家族都包含N端的卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil domain，CCD）和C端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域（fibrinogenlike domain，F(xiàn)LD），即與血管生成素具有一定的同源性和相似的結(jié)構(gòu)域。但是，ANGPTL家族成員都不能與血管生成素受體酪氨酸激酶Tie1或Tie2結(jié)合[19]。該家族中的ANGPTL2在N末端具有高度疏水區(qū)域和兩個連續(xù)共有的N-糖基化位點(diǎn)，其編碼基因位于人類染色體9q34。ANGPTL2基因在不同物種之間進(jìn)化上非常保守，例如小鼠和人ANGPTL2 基因的核苷酸序列相似度高達(dá)89%，這間接說明ANGPTL2蛋白具有非常重要的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)過N-糖基化修飾的、分泌到胞外的ANGPTL2 才能對靶細(xì)胞起作用。一旦分泌到細(xì)胞外，ANGPTL2 就參與到一些重要的生理和病理過程中，并發(fā)揮關(guān)鍵作用，如：誘導(dǎo)血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、抗細(xì)胞凋亡、發(fā)揮生長因子的作用、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等[20]。 最早對ANGPTL2的研究集中于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[21]、II型糖尿病[22-23]、冠狀動脈疾病[23]等。近年來，隨著人們對ANGPTL2研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)ANGPTL2還與胃癌、白血病、腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌等惡性腫瘤[24-31]的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。關(guān)于ANGPTL2 促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，有學(xué)者通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗進(jìn)行了一系列研究。研究表明，沉默ANGPTL2的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），減少細(xì)胞的遷移；阻斷細(xì)胞中ANGPTL2的受體—白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B2（leukocyte immunoglobulin-like receptorSB2，LILRB2），可抑制ANGPTL2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL2在胰腺癌患者血清中的水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。單因素和多因素分析證實(shí)ANGPTL2是引起胰腺癌的獨(dú)立危險因素（P=0.014）。胰腺癌患者血清ANGPTL2的高表達(dá)與腫瘤的大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P＞0.05）。腫瘤越大、腫瘤組織分化程度越低，血清中ANGPTL2越趨向于高表達(dá)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者相比，血清中ANGPTL2趨向于高表達(dá)。在臨床病理TNM分期中，III～I(xiàn)V期患者與I～I(xiàn)I期患者相比，血清中ANGPTL2趨向于高表達(dá)。這些結(jié)果都表明胰腺癌患者血清ANGPTL2水平隨著癌細(xì)胞生物狀態(tài)的改變而改變，在一定程度上反映了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清ANGPTL2水平與CA19-9水平呈顯著正相關(guān)；而CA19-9是目前常用的胰腺癌篩查指標(biāo)，即提示我們：血清ANGPTL2也有可能成為胰腺癌輔助診斷的實(shí)驗室指標(biāo)用于胰腺癌的篩查。目前僅有1篇外文文獻(xiàn)初步探討了血清ANGPTL2單獨(dú)或聯(lián)合CA19-9對胰腺癌的診斷價值，但該研究樣本例數(shù)太少[32]。本研究分別探討了血清ANGPTL2、CA19-9 及ANGPTL2 聯(lián)合CA 19-9對胰腺癌的診斷價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清ANGPTL2、C A 19-9 及ANGPTL2聯(lián)合CA19-9對胰腺癌均具有較高的診斷價值，其中聯(lián)合檢測時的特異度（98.5%）和陽性預(yù)測值（96.4%）是最高的，因此聯(lián)合檢測可提高對胰腺癌的診斷效能。與其他研究相比，聯(lián)合檢測ANGPTL2和CA19-9進(jìn)行胰腺癌篩查的方法簡便易行，價格低廉，利于推廣應(yīng)用。而對胰腺癌標(biāo)志物的探索有助于臨床及時診斷和治療，延長患者生存時間，改善遠(yuǎn)期預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價值。