劉理冠 葉巧霞 嚴(yán)彥 顏燕燕 黃志杰 張小曼

核苷(酸)類似物(NAs)因抑制病毒復(fù)制能力強(qiáng)、使用方便和不良反應(yīng)小等已成為我國治療乙型肝炎的主要藥物，主要包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、阿德福韋酯(ADV) 和替諾福韋酯(TDF)[1]。但其也存在缺點(diǎn)，如停藥困難，患者須長期使用，部分患者出現(xiàn)了NAs耐藥，導(dǎo)致治療失敗[2]。究其原因發(fā)現(xiàn)與患者HBV反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(reverse transcriptase,RT)產(chǎn)生耐藥突變有關(guān)，HBV-RT耐藥突變可使機(jī)體發(fā)生病毒學(xué)和生化學(xué)突破，是慢性HBV相關(guān)肝病進(jìn)展的重要原因[3-5]。此外，耐藥突變可能與HBV基因型亦存在一定關(guān)聯(lián)[6]。本研究探討慢性HBV相關(guān)肝病患者HBV基因型和耐藥突變位點(diǎn)與疾病進(jìn)展的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1月至2019年12月于解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九一〇醫(yī)院診療的慢性HBV相關(guān)肝病患者230例，其中男150例，女80例；年齡為18～79歲。慢性乙型肝炎患者175例，乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者40例，乙型肝炎相關(guān)肝癌患者15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[8]；②使用NAs治療超過24周；③知情且簽署知情同意書；排除：①合并甲、丙、丁及戊型肝炎病毒共同感染者；②合并酒精性肝病和或自身免疫性肝病。慢性乙型肝炎患者中，男120例，女55例；年齡為(54.8±11.3)歲；乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者中，男29例，女11例；年齡為(55.0±11.2)歲；乙型肝炎相關(guān)肝癌患者中：男12例，女3例；年齡為(54.1±10.9)歲；3組患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

二、方法

(一)標(biāo)本收集 抽取空腹靜脈血，分離血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱待用。

(二)HBV RT區(qū)測(cè)序 采用ABI 3500XL型基因測(cè)序儀檢測(cè)血清HBV RT區(qū)核苷酸序列，試劑盒購自上海申友生物技術(shù)有限公司。具體操作如下：第一，HBV DNA提取，將血清標(biāo)本復(fù)溶，取200 μL血清加入同等體積HBV DNA提取液I，振蕩混勻，以13 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入 50 μL HBV DNA提取液II，充分混勻后短暫離心，100℃干浴或沸水浴10 min，振蕩混勻，以15 000 r/min離心5 min，取4 μL上清液DNA作為 PCR反應(yīng)模板。第二，PCR擴(kuò)增，在配制好的反應(yīng)液中加入標(biāo)本DNA、對(duì)照及定量參比品各4 μL，并在ABI 7500 PCR儀上設(shè)好反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，94 ℃ 8 min，94 ℃ 7 s,60 ℃ 50 s，45個(gè)循環(huán)，72 ℃ 2 min。第三，PCR產(chǎn)物酶解，取3 μL PCR產(chǎn)物加入2 μL SAP MIX，充分混勻，37℃反應(yīng)60 min，80 ℃反應(yīng)15 min，將產(chǎn)物保存于4 ℃。第四，測(cè)序，取3 μL陽性PCR酶解產(chǎn)物與1 μL測(cè)序試劑和2 μL測(cè)序引物混合進(jìn)行測(cè)序PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 1 min , (94 ℃ 10 s, 50 ℃ 5 s, 60 ℃ 4 min)×30個(gè)循環(huán)，4 ℃下使用乙醇將其純化，并溶于甲酰胺溶液中。第五，DNA變性：在ABI 7500 PCR儀完成DNA變性，94 ℃ 5 min,4 ℃ 4 min。第六，基因測(cè)序及結(jié)果判斷，將上述產(chǎn)物置于ABI 3500XL型基因測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，用配套軟件打開測(cè)序峰圖，對(duì)rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236、rt250共8個(gè)耐藥位點(diǎn)進(jìn)行突變分析。

(三)HBV基因型檢測(cè) 將上述 HBV-RT區(qū)核苷酸堿基序列與美國國立生物技術(shù)信息中心基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formage.cgi)中信息進(jìn)行比對(duì)，獲取HBV基因型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、慢性HBV相關(guān)肝病患者NAs耐藥突變分析

230例慢性HBV相關(guān)肝病患者中100例(43.47%)檢出NAs耐藥突變，以LAM/LdT耐藥最多見(30.00%,69/230)、ADV耐藥次之(7.83%,18/230)、ETV耐藥最少(5.65%,13/230)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=67.392,P<0.01)。在LAM/LdT耐藥中，單點(diǎn)耐藥55例(79.71%)，以rtM204V/I突變多見(17.39%,40/230)，其余還包括rtL180M突變8例和rtV173L突變5例；多點(diǎn)耐藥14例(20.29%)，以rtL180M+rtM204V/I突變多見(5.65%,13/230)，其余還包括rtL180M+rtM204V/I+rt V173L突變3例。在ADV耐藥中，以單點(diǎn)耐藥為主(11例,占61.11%)，rtA181T是其主要突變位點(diǎn)(3.91%,9/230)，其余還包括rt236T突變1例、rtA181T+rt236T突變2例、rtL180M+rtA181T突變2例和rtL180M+rtA181T+rt236T突變4例。在ETV耐藥中，均為多點(diǎn)耐藥，以rtM204V/I+rtA181T+rtS202G/I突變?yōu)橹?3.04%,7/230)，其余還包括rtM204V/I+rtA181T+rtT184A/G/I/S突變3例、rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rtT184A/G/I/S+rt250V/I突變2例和rtM204V/I+rtL180M+rtA181T+rt236T+rt250V/I突變1例。

二、慢性HBV相關(guān)肝病患者HBV基因型分析

230例慢性HBV相關(guān)肝病患者均為B基因型和C基因型，未檢測(cè)到A、D、E、F、G、H、J基因型，其中B基因型患者162例(70.43%)，C基因型患者68例(29.57%)。

三、不同HBV基因型NAs耐藥突變情況比較

HBV B基因型和C基因型在rt180突變率和rt181突變率上比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，但其他位點(diǎn)突變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

四、不同HBV基因型疾病進(jìn)展情況比較

慢性乙型肝炎組B基因型和C基因型分別為114例和51例，乙型肝炎相關(guān)肝硬化組B基因型和C基因型分別為12例和28例，乙型肝炎相關(guān)肝癌組B基因型和C基因型分別為5例和10例，HBV基因型在3組分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.012,P<0.01)。

表1 不同HBV基因型NAs耐藥突變情況比較(例)

五、不同NAs耐藥突變疾病進(jìn)展情況比較

慢性乙型肝炎組、乙型肝炎相關(guān)肝硬化組和乙型肝炎相關(guān)肝癌組在rt204耐藥位點(diǎn)上比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，但在其他位點(diǎn)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同NAs耐藥突變疾病進(jìn)展情況比較(例)

討 論

研究表明，HBV疾病進(jìn)展可能與基因型有關(guān)[9]。目前，根據(jù)HBV全基因序列差異≥8%和(或)S區(qū)基因序列差異≥4%進(jìn)行分型，可將HBV基因型分為A-J10個(gè)基因型，而我國以B型和C型為主，其中南方以B型為主，北方以C型為主[10]。本研究中，230例慢性HBV相關(guān)肝病患者HBV B基因型約占70.43%，略高于張小曼等[11]的報(bào)道，可能與人群分布差異有關(guān)。此外，本研究還對(duì)比了HBV不同基因型患者疾病進(jìn)展情況發(fā)現(xiàn)，HBV B基因型患者和HBV C基因型患者有一定差異，其中C型患者更易進(jìn)展為肝硬化甚至是肝癌，可能是與C基因型患者HBV復(fù)制能力更強(qiáng)，肝功能損傷較重有關(guān)。

目前已明確的NAs耐藥模式有6種，包括L型核苷耐藥模式、無環(huán)磷酸鹽耐藥模式、共享(公共)耐藥模式、雙重耐藥模式、ETV初治耐藥模式和多藥耐藥模式[12]。由于經(jīng)濟(jì)原因，我國以低屏障耐藥(LAM、LdT和ADV)為主，高屏障耐藥(EVT)為輔，但無論是何種，均不利于HBV相關(guān)肝病治療及恢復(fù)[13]。本研究對(duì)230例慢性HBV相關(guān)肝病患者NAs常見耐藥突變點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以rt204位點(diǎn)突變占比最高，約69%，與國內(nèi)主流意見基本一致，提示rt204位點(diǎn)突變者NAs耐藥率高，提醒臨床工作者可將HBV-RT區(qū)rt204位點(diǎn)突變檢測(cè)納入抗病毒療效監(jiān)測(cè)中，以便及時(shí)調(diào)整治療方案，提高治療效果。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)230例慢性HBV相關(guān)肝病患者中rt180和rt181突變也相對(duì)較高，提示以上兩者可成為耐藥監(jiān)測(cè)的另一檢測(cè)指標(biāo)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，除了藥物本身，耐藥產(chǎn)生可能與病毒基因型具有一定關(guān)聯(lián)[14]；但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)B 基因型和C基因型患者在耐藥位點(diǎn)突變率上無明顯差異[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，除rt180位點(diǎn)和rt181位點(diǎn)外，HBV B基因型和C基因型在其他位點(diǎn)的突變率無明顯差異，與上述觀點(diǎn)基本一致，也提示C基因型患者更易發(fā)生rt180位點(diǎn)和rt181位點(diǎn)突變，導(dǎo)致耐藥。此外，rt204位點(diǎn)突變對(duì)疾病進(jìn)展更為重要，提示應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注rt204位點(diǎn)突變患者的疾病進(jìn)展?fàn)顩r，盡可能采取有效措施減緩其進(jìn)程。

綜上，本地區(qū)慢性HBV相關(guān)肝病患者基因型以B型和C型為主，NAs主要耐藥突變點(diǎn)檢出率較高，其中不同基因型的疾病進(jìn)展情況和耐藥突變情況存在差異，而在rt204耐藥位點(diǎn)突變率上不同疾病階段亦存在差異，建議HBV感染者常規(guī)進(jìn)行基因型和NAs耐藥檢測(cè)，以便建立個(gè)體化治療方案，減緩疾病進(jìn)程。本研究存在以下不足：①本地區(qū)樣本量不足，尤以乙型肝炎相關(guān)肝癌者缺乏；②研究對(duì)象均為本院患者，可能存在一定地區(qū)差異性。