謝麗基，謝芝勛，王盛，黃嬌玲，鄧顯文，謝志勤，羅思思，曾婷婷，張艷芳，張民秀，范晴

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

禽呼腸孤病毒(ARV)主要引起家禽的病毒性關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎、矮小綜合征及吸收不良綜合征等，尤為嚴(yán)重的是誘發(fā)免疫抑制，造成家禽對(duì)疫苗免疫應(yīng)答能力和各種病原體抵抗力降低。σA蛋白是禽呼腸孤病毒S2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，能激活PI3K-AKT信號(hào)通路的作用[1]，與禽呼腸孤病毒抗干擾素作用有關(guān)[2]，在ARV的感染致病過程中發(fā)揮重要作用。本課題組在前期的免疫共沉淀(CO-IP)、質(zhì)譜鑒定以及酵母雙雜交篩選的研究中發(fā)現(xiàn)，禽源NME2是潛在的與禽呼腸孤病毒 σA 蛋白互作的宿主蛋白[3]。

NME(non-metastasis cells)基因即NM23基因，是Steeg等[4]學(xué)者從7株轉(zhuǎn)移能力不同的小鼠黑色素瘤細(xì)胞系中，用差示雜交的方法蹄選鑒定出的一種與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)的基因，他們將此基因命名為NME基因。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)屬于基因家族的有10種，它們分別是到NME1到NME10[5]。二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)活性是NME家族共同的特征[6]，其中，NME2(NME/NM23核苷二磷酸激酶2)編碼的NDPK的B亞基，具有核苷二磷酸激酶活性，催化二磷酸核苷轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的三磷酸核苷[7]，參與細(xì)胞的的能量代謝[8]、微管解聚[9]等過程，影響腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

因此，本研究構(gòu)建禽源NME2基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-NME2，為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證宿主蛋白NME2是否與禽呼腸孤病毒σA相互作用，并研究其對(duì)σA基因功能的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)試劑

RT-PCR試劑盒、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit、pEF1α-Myc載體和限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)公司；T4 DNA連接酶和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購(gòu)自Invitrogen 公司；Anti-Myc tag Mouse mAb購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；山羊抗鼠IgG (FITC)購(gòu)自Abcam 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自碧云天公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中禽源NME2基因序列(登錄號(hào)：NM_205047.1)，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物(表1)，引物序列的斜體標(biāo)記為酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和NotⅠ)。

表1 引物序列

1.3 NME2基因的克隆

1.3.1 RT-PCR擴(kuò)增NME2基因

提取雞胚成纖維細(xì)胞傳代系(DF-1)的RNA，使用PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用表1中的特異性引物，對(duì)NME2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2 NME2基因的克隆

將50 μL PCR產(chǎn)物電泳后，切膠后用DNA片斷膠回收試劑盒純化回收。將純化PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體，得到pMD-18T-NME2重組菌。抽提重組菌及空載體pEF1α-Myc的質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ同時(shí)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后，用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化到 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，得到pEF1α-Myc-NME2重組菌。對(duì)重組菌進(jìn)行PCR檢測(cè)、雙酶切驗(yàn)證，并送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 NME2基因的表達(dá)

1.4.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

參照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒說明書，大量提取質(zhì)粒(pEF1α-Myc、pEF1α-Myc-NME2)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明書，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染長(zhǎng)成單層的DF1細(xì)胞(6孔板)，同時(shí)設(shè)立陰性細(xì)胞組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)。

1.4.2 間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)NME2的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后棄掉培養(yǎng)液，用PBST洗滌3次，用預(yù)冷的甲醇和丙酮混合溶液于冰上固定細(xì)胞10 min，用PBS(4 ℃預(yù)冷)洗滌3次。在pEF1α-Myc、pEF1α-Myc- NME2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加入Anti-Myc tag Mouse mAb(1∶1 000稀釋)，37 ℃作用2 h。棄去細(xì)胞板中的一抗，用PBS(4 ℃預(yù)冷)輕洗細(xì)胞5次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，37 ℃避光作用1.5 h。棄去細(xì)胞板中的二抗，用PBS(4 ℃預(yù)冷)輕洗細(xì)胞5次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

同時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后的DF1細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[10]的方法，使用Anti-Myc tag Mouse mAb和堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，對(duì)目的蛋白NME2進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定及測(cè)序

通過菌液PCR對(duì)所構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-NME2的陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。如圖1所示，NME2擴(kuò)增的基因片段大小為462 bp，與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果也證實(shí)了pEF1α-Myc-NME2重組質(zhì)粒的正確性。

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc- NME2的雙酶切鑒定結(jié)果見圖2。重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-NME2雙酶切后，得到4 622 bp的載體條帶和462 bp的NME2基因條帶，說明NME2基因已經(jīng)正確插入到表達(dá)載體pEF1α-Myc。

M.Trans DNA Marker；1、2.pEF1α-Myc-NME2圖1 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的PCR鑒定

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.pEF1α-Myc-NME2圖2 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

2.3 間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)

如圖3所示，在熒光顯微鏡下，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-NME2轉(zhuǎn)染組的DF1細(xì)胞均可觀察到綠色熒光的出現(xiàn)，而分別以鼠源Myc標(biāo)簽抗體為一抗的陰性對(duì)照組則無綠色熒光的出現(xiàn)。

A.陰性對(duì)照；B.pEF1α-Myc-NME2圖3 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

2.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)

如圖4所示，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-Myc-NME2表達(dá)的Myc-NME2融合蛋白在大約19.4 kDa處有單一的目的條帶，而陰性對(duì)照組沒有條帶。

M.蛋白Maker；1.陰性對(duì)照；2.pEF1α-Myc-NME2圖4 Western blot檢測(cè)目的基因的表達(dá)

3 討論

NME2參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、黏附和分化[11]。NME2 蛋白對(duì)于細(xì)胞凋亡也發(fā)揮重要作用。研究表明，NME2 蛋白作為Diva和Bcl2- L-10特異性結(jié)合蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮新的生物學(xué)功能[12-13]。NME2蛋白的過量表達(dá)能夠誘導(dǎo)凋亡。Xiao等[14]研究報(bào)道，高表達(dá)量的NME2蛋白能夠和TIP30轉(zhuǎn)移抑制因子協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡；NME2蛋白的缺失引起Diva性凋亡活動(dòng)的增加[15]。

本課題組在前期的CO-IP、質(zhì)譜鑒定以及酵母雙雜交的研究中，發(fā)現(xiàn)了禽源NME2基因蛋白是潛在的、與禽呼腸孤病毒σA蛋白互作的宿主蛋白[3]。為進(jìn)一步的驗(yàn)證，需要將NME2基因克隆到真核表達(dá)載體，并與禽呼腸孤病毒 σA基因的重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行雙向CO-IP和Western blot，驗(yàn)證NME2與禽呼腸孤病毒σA的相互作用。因此，本研究選定禽源NME2基因，分別設(shè)計(jì)了特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、雙酶切和克隆，構(gòu)建了宿主蛋白NME2的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并命名為pEF1α-NME2。本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒，所選用的真核表達(dá)載體pEF1α-Myc帶有Myc標(biāo)簽，Myc這種標(biāo)簽的分子量較小，對(duì)后續(xù)表達(dá)的外源靶蛋白空間結(jié)構(gòu)影響小，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響。

本研究將真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEF1α-NME2轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞后，經(jīng)間接免疫熒光和Western blot兩種方法，驗(yàn)證了Myc-NME2融合蛋白的正確表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證禽源宿主蛋白NME2是否與禽呼腸孤病毒σA蛋白相互作用奠定基礎(chǔ)。