胡忠俊，周 昊，呂麗麗，李槿年

草魚白介素10基因的克隆表達(dá)及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

胡忠俊，周 昊，呂麗麗，李槿年*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036)

為建立檢測草魚白介素10（IL-10）的雙抗體夾心ELISA方法，首先克隆IL-10基因、構(gòu)建與表達(dá)原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-IL-10，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得重組IL-10（rIL-10）純化蛋白。然后，以純化的rIL-10蛋白為免疫原制備兔源及鼠源抗rIL-10的多克隆抗體，并對其進(jìn)行純化與酶標(biāo)記。最后，以純化的鼠抗rIL-10抗體為捕獲抗體，rIL-10純化蛋白為夾心抗原，HRP標(biāo)記的兔抗IL-10純化抗體為檢測抗體，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法。結(jié)果顯示，該方法的優(yōu)化反應(yīng)條件包括，捕獲抗體的最佳包被濃度為20 μg·mL-1，檢測抗體的最佳稀釋度為1∶3 200，最佳封閉條件是使用5%脫脂奶粉，37 °C封閉1.5 h，樣品反應(yīng)時間為2 h，以450值≥0.174作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。該方法的板內(nèi)及板間重復(fù)性變異系數(shù)小于10%，最低檢測限量為24.29 ng·mL-1，與草魚白介素6、草魚腫瘤壞死因子、小鼠白介素10、小鼠干擾素和小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白均無交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，建立的雙抗體夾心ELISA方法具有較好的特異性、重復(fù)性和靈敏度，可用于草魚白介素10的快速檢測。

草魚白介素10；克隆表達(dá)；抗體制備；雙抗體夾心ELISA

白介素-10（Interleukin 10，IL-10）是一種由單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞分泌的多功能免疫調(diào)節(jié)因子，參與多種細(xì)胞和疾病的生物調(diào)節(jié)[1-4]。IL-10不僅具有抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖、促炎因子的合成與抗原遞呈等免疫抑制作用，還可發(fā)揮促進(jìn)肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和分化，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用[5-7]。因此，體內(nèi)IL-10水平是評價機(jī)體免疫狀況或疫苗免疫效果的重要指標(biāo)之一。

細(xì)胞因子可通過生物活性、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測[8]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）因其快速、特異和靈敏等優(yōu)點，是最常用的細(xì)胞因子檢測方法[9]。目前已有商品化ELISA檢測試劑盒用于人源和鼠源IL-10檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原核表達(dá)載體pET-32a由實驗室保存，限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶和pMD-18T Vector Cloning Kit 購自（大連）TaKaRa生物技術(shù)工程有限公司，DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒以及BL21感受態(tài)細(xì)胞購自（北京）天根生化科技有限公司，標(biāo)記的鼠抗兔和兔抗鼠HRP-IgG 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Protein G 親和層析純化柱購自GE公司，親和層析鎳柱購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，BCA蛋白測定試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；新西蘭大白兔（約2 kg）和BALB/C 小鼠（5～6周齡，雌性）購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，草魚（約250 g）購自合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園，草魚白介素6重組蛋白（rIL-6）和草魚腫瘤壞死因子重組蛋白（rTNF-α）均由本實驗室制備，小鼠白介素10（mIL-10）、小鼠干擾素（mIFN-γ）和小鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1（mMCP-1）由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病學(xué)實驗室饋贈，VA5免疫增強(qiáng)劑由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所惠贈。

1.2 CiIL-10基因的克隆表達(dá)

1.2.1IL-10基因的克隆 以草魚頭腎組織cDNA為模板，用IL-10基因的特異性引物（F：5′- CCGTTAGTGCTTTTCTCTCTTT-3′，下劃線處為I酶切位點；R：5′-CCGATGA TTTTCTCTAGAGTCATCTT-3′，下劃線處為I酶切位點）PCR擴(kuò)增其全長序列。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包含2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物（20 μmol·L-1）各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物回收純化后，克隆至pMD-18T構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-IL-10。

1.2.2IL-10基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及純化 重組克隆質(zhì)粒和pET-32a載體質(zhì)粒經(jīng)I/I雙酶切后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板，次日挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并從陽性菌中抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。隨后，將陽性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至6000.4，加入終1.0 mmol·L-1的IPTG，180 r·min-1、30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心收集菌體后經(jīng)PBS洗滌、凍融、超聲破碎、離心收集上清和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。重組蛋白經(jīng)親和層析柱純化后再用BCA蛋白測定試劑盒檢測其濃度。

1.3 兔抗CiIL-10多克隆抗體的制備、純化及酶標(biāo)記

1.3.1 多克隆抗體的制備 用PBS將rIL-10蛋白配成濃度為1 mg·mL-1的蛋白液，與司本白油佐劑以及VA5 免疫增強(qiáng)劑乳化混合成免疫原。以1 mg rIL-10·只-1注射于兔頸背部皮內(nèi)，免疫后第14、 21天各加強(qiáng)一次。第28天采集心臟血、分離免疫血清。

1.3.2 多克隆抗體的純化與酶標(biāo)記 免疫血清依次經(jīng)飽和硫酸銨分級沉淀、PBS透析除鹽和Protein G 親和層析柱純化來提純兔抗IL-10抗體。BCA蛋白測定試劑盒測定純化抗體的濃度，SDS-PAGE分析其純度。采用碘酸鈉法[16]用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗IL-10抗體，并用50%飽和硫酸銨沉淀法除去游離的酶及酶-酶聚合體，得到酶標(biāo)兔抗IL-10抗體，通過SDS-PAGE分析其純度，間接ELISA法檢測其效價。

1.4 鼠抗CiIL-10多克隆抗體的制備與純化

免疫原制備同1.3.1。以200 μg·只-1的劑量頸背部皮下多點注射，免疫BALB/C小鼠，其余免疫程序同1.3.1。鼠源免疫血清經(jīng)Protein G親和層析純化柱純化后，采用1.3.2方法測定其濃度、純度與效價。

1.5 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

1.5.1 捕獲抗體與檢測抗體最佳工作濃度的確定 采用方陣滴定法確定捕獲抗體（純化的鼠抗IL-10抗體）和檢測抗體（酶標(biāo)兔抗IL10抗體）的最佳工作濃度。主要步驟是：分別以濃度為20、10、5、2.5和1.25 μg·mL-1的捕獲抗體按100 μL·孔-1包被酶標(biāo)板。次日，經(jīng)PBST洗滌后，用含5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。洗板后，加入濃度為30 ng·mL-1的rIL-10蛋白，100 μL·孔-1，37 ℃作用2 h。洗板后，分別加入1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400稀釋的檢測抗體，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。洗板后，加TMB底物液，37 ℃顯色5 min，加50 μL終止液，測定450值。同時作陰性對照和空白對照，根據(jù)450值以及P/N值確定兩種抗體的最佳工作濃度。

通過對部分職業(yè)院校教師調(diào)查和分析，目前教師在教科研能力主要兩種傾向，第一種傾向是認(rèn)為自己只要上好課就行了，高不可攀的教科研與自己關(guān)系不大，有這種認(rèn)識的大多數(shù)是普通專業(yè)教師；第二種傾向是想致力于提升自己教科研綜合能力，但找不到交流合作培訓(xùn)的平臺，持這種觀點的教師基本都是骨干教師、專業(yè)帶頭人。

1.5.2 最佳封閉液與封閉條件的選擇 分別用5%脫脂奶粉、5%BSA和5%明膠作為封閉液，在37 ℃ 1.5 h、37 ℃ 2 h和4 ℃ 12 h條件下封閉后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，每組重復(fù)3孔，經(jīng)底物液顯色后測定450值，取平均值并計算P/N值，確定最佳封閉液及封閉條件。

1.5.3 雙抗體夾心ELISA檢測方法的操作程序 根據(jù)上述優(yōu)化最佳條件，加入待檢樣品（100 μL·孔-1，重復(fù)3孔），37 ℃作用2 h，PBST洗滌3次，加入1∶3 200稀釋的酶標(biāo)兔抗IL-10（100 μL·孔-1），37 ℃作用1 h，再洗滌。最后，加TMB底物液，37 ℃避光顯色5 min，終止反應(yīng)后測定450值。同時設(shè)立陽性、陰性和空白對照。

1.6 雙抗體夾心ELISA檢測方法的靈敏度試驗

將rIL-10純化蛋白倍比稀釋為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906和1.953 ng·mL-110個不同濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程，計算檢測下限。

1.7 雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性試驗

按上述雙抗體夾心ELISA程序，在同一條件下對rIL-10、rIL-6、rTNF-α、mIL-10、mIFN-γ和mMCP-1樣品進(jìn)行檢測，確定方法的特異性。

1.8 雙抗體夾心ELISA檢測方法的重復(fù)性試驗

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-CiIL-10構(gòu)建與鑒定

結(jié)果如圖1顯示，PCR擴(kuò)增出與預(yù)期目的基因大小一致（558 bp）的DNA條帶，見圖1(a)；雙酶切后得到大小約為6 539 bp和558 bp的DNA條帶，見圖1(b)，分別與空載體pET-32a和IL-10 基因的大小相符，見圖1(b)。結(jié)果表明原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-IL-10構(gòu)建成功。

2.2 重組CiIL-10蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

結(jié)果如圖2所示，空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分別在21 kDa和39 kDa附近出現(xiàn)2條濃染的蛋白條帶，分別與預(yù)期的標(biāo)簽蛋白與rIL-10蛋白的分子量大小一致，說明重組質(zhì)粒pET-32a-IL-10得到表達(dá)（泳道1, 2）。超聲后的上清和沉淀部分經(jīng)電泳分析顯示重組蛋白可同時以可溶性與包涵體形式表達(dá)，但以后者為主（泳道4）。可溶性表達(dá)的rIL-10蛋白經(jīng)親和層析柱純化后，凝膠成像系統(tǒng)軟件分析其純度約為97%（泳道5），BCA蛋白測定試劑盒測得其濃度為0.9 mg·mL-1，可用作后續(xù)試驗中的免疫原和夾心抗原。

2.3 兔抗rCiIL-10抗體的制備與標(biāo)記

免疫血清經(jīng)飽和硫酸銨分級沉淀法、PBS透析除鹽和Protein G 親和層析法純化。12% SDS-PAGE分析顯示其純度約為95%，見圖3(a)，BCA蛋白測定試劑盒測得其濃度為1.7 mg·mL-1。12% SDS-PAGE分析顯示酶標(biāo)抗體的純度約為97%，見圖3(b)，間接ELISA方法測得其效價高達(dá)1∶838 860 800。結(jié)果表明，所制備的酶標(biāo)兔抗rIL-10抗體可作后續(xù)雙夾心ELISA檢測方法建立中的檢測抗體。

(a) pET-32a-CiIL-10的PCR鑒定,(b)pET-32a-CiIL-10的雙酶切鑒定；M. DNA分子質(zhì)量DL2 000, 1. pMD18-T-CiIL- 10的PCR產(chǎn)物, 2. pET-32a-CiIL-10的PCR產(chǎn)物, 3. 陰性對照,4.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CiIL-10,5.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-CiIL-10的EcoRI/XhoI酶切產(chǎn)物,M1.DNA分子質(zhì)量DL5 000。

Figure 1 PCR and double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET-32a-IL-10

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),1.誘導(dǎo)的空質(zhì)粒pET-32a,2.誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pET-32a-CiIL-10,3.超聲破碎后的上清部分,4.超聲破碎后的沉淀部分,5.純化的rCiIL-10蛋白。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of expression products obtained by inducing recombinant plasmid pET-32a-IL-10

2.4 鼠抗rCiIL-10抗體的純度、濃度與效價

小鼠免疫血清經(jīng)Protein G親和層析法純化后，其純度約為95%（圖4），濃度為1.2 mg·mL-1，間接ELISA方法測得其效價為1∶6 553 600。結(jié)果表明所制備的抗體可作后續(xù)雙夾心ELISA檢測方法建立中的檢測抗體。

2.5 CiIL-10雙抗體夾心ELISA檢測方法的條件優(yōu)化

2.5.1 捕獲抗體和檢測抗體的最佳工作濃度 方陣滴定試驗的結(jié)果，捕獲抗體（鼠抗IL-10抗體）的最佳包被濃度為20 μg·mL-1，檢測抗體（酶標(biāo)兔抗IL10抗體）的最佳稀釋度為1:3 200，此時的P/N值最大，為4.082。

(a)純化前后兔抗rCiIL-10抗體的SDS-PAGE分析,(b)純化后兔抗rCiIL-10酶標(biāo)抗體的SDS-PAGE分析；M.蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)量,1.純化前兔抗rCiIL-10抗體,2.飽和硫酸銨沉淀后的兔抗rCiIL-10抗體,3.純化的兔抗rCiIL-10抗體,M1.蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)量,4.純化后的兔抗rCiIL-10酶標(biāo)抗體。

Figure 3 SDS-PAGE analyses of rabbit anti-rIL-10 antibody before and after purification as well as purified Rabbit anti rIL-10 antibody labelled with enzyme

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化前的；2.純化后的。

Figure 4 SDS-PAGE analysis for the mouse anti- rIL-10 antibody before and after purification

表1 最佳封閉液與封閉條件的確定

表2 30份陰性血清的OD450值

2.5.2 最佳封閉液與封閉條件 用5%脫脂奶粉、5%BSA和5%明膠作為封閉液，在不同條件下進(jìn)行封閉酶標(biāo)板，經(jīng)底物液顯色后選擇450值接近1.0時對應(yīng)的封閉液及其作用溫度與時間作為最佳封閉液與封閉條件。由表1可見，5%脫脂奶粉為最佳封閉液，其最佳封閉條件為37 ℃封閉1.5 h。最佳封閉液篩選結(jié)果與李艷婷等[18]和王方等[19]報道一致。

圖5 CiIL-10雙抗體夾心ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 5 The standard curve of double antibody sandwich ELISA for detectingIL-10

2.6 CiIL-10雙抗體夾心ELISA檢測方法的臨界值

2.7 CiIL-10雙抗體夾心ELISA檢測方法的靈敏性

以rIL-10濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，450值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。由圖5所示， rIL-10蛋白濃度的對數(shù)值范圍在1.495～2.699內(nèi)與450值具有較好的線性關(guān)系。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為=0.665 4?0.747 8，為rIL-10濃度的對數(shù)，相關(guān)系數(shù)2為0.994 9。將陰陽臨界值0.174代入線性回歸方程，得出所建立方法的最低檢測限量為24.29 ng·mL-1。

表3 特異性試驗結(jié)果

2.8 CiIL-10雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性

采用建立的雙抗體夾心ELISA方法在同一條件下對rIL-10、rIL-6、rTNF-α、mIL-10、mIFN-γ和mMCP-1樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3，除了rIL10的檢測結(jié)果為陽性外，其余樣品均為陰性，說明所建立的雙抗體夾心ELISA方法的特異性強(qiáng)。

表4 板內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

表5 板間重復(fù)性試驗結(jié)果

2.9 CiIL-10雙抗體夾心ELISA檢測方法的重復(fù)性

用LPS刺激后的草魚腸巨噬細(xì)胞上清液作為檢樣進(jìn)行板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗。結(jié)果由表4和5可見，板內(nèi)與板間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于10%，說明建立雙抗體夾心ELISA檢測方法的重復(fù)性好。

3 討論

白介素-10（IL-10）是一種多功能免疫調(diào)節(jié)因子。針對目前尚無檢測IL-10檢測試劑盒的現(xiàn)狀，本研究建立了檢測IL-10的雙抗體夾心ELISA方法。夾心抗原、捕獲抗體與檢測抗體是影響雙抗體夾心ELISA的三大關(guān)鍵因素。由于無商品化的IL-10蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)IL-10基因，制備rIL-10純化蛋白。rIL-10可同時以可溶性和包涵體形式表達(dá)。盡管包涵體蛋白的表達(dá)量較高，但其空間結(jié)構(gòu)的變化可能影響其抗原性，而可溶性表達(dá)蛋白能夠保持與天然蛋白在結(jié)構(gòu)和活性上基本一致。因此，本試驗使用Ni-Charged Resin親和層析柱僅對可溶性rIL-10蛋白進(jìn)行純化，凝膠成像系統(tǒng)軟件分析其純度約為97%，BCA蛋白測定試劑盒測得其濃度為0.9 mg·mL-1。結(jié)果表明，所制備的rIL-10純化蛋白可用作抗體制備的免疫原和方法建立中的夾心抗原。

捕獲抗體與檢測抗體的選擇及其質(zhì)量直接影響雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性與靈敏度。多數(shù)學(xué)者傾向于使用相較于多克隆抗體有更好的特異性與均一性的鼠源單克隆抗體作為捕獲抗體，兔源多克隆抗體作為檢測抗體[20]。但是，多克隆抗體制備簡便、成本低廉、與固相載體的結(jié)合能力強(qiáng)，有文獻(xiàn)報道[21]鼠源抗體IgG重鏈可變區(qū)的氨基酸數(shù)目比兔源抗體多，有利于結(jié)合更多的抗原表位，使鼠源多克隆抗體結(jié)合抗原的特異性更強(qiáng)。已有學(xué)者利用兔源及鼠源二種多克隆抗體成功建立了雙抗體夾心ELISA方法[22-25]。因此，本研究選用鼠抗rIL-10純化多克隆抗體為捕獲抗體，酶標(biāo)兔抗rIL-10多克隆抗體為檢測抗體，以提高雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性。

本研究采用方陣滴定法確定了捕獲和檢測抗體的最佳工作濃度，并優(yōu)化了封閉液種類與封閉條件，最終建立了檢測IL-10的雙抗體夾心ELISA方法。進(jìn)一步對所建方法進(jìn)行性能評估，結(jié)果顯示該方法的最低檢測限量為24.29 ng·mL-1，與草魚其他細(xì)胞因子以及小鼠IL-10、小鼠干擾素和鼠單核細(xì)胞趨化因子等均無交叉反應(yīng)，板內(nèi)及板間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于10%。結(jié)果表明本研究所建立方法的特異性強(qiáng)、重復(fù)性好且靈敏度較好。此外，該方法能在5～6 h完成檢測且對儀器要求不高，解決了采用熒光定量PCR檢測方法帶來的操作繁瑣，耗時費力，易受操作條件影響等問題，從而為監(jiān)測或檢測草魚體內(nèi)IL-10水平提供了快速有效的方法。

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Cloning and expression ofinterleukin-10 (IL-10) gene and establishment of double antibody sandwich ELISA for detection ofIL-10

HU Zhongjun, ZHOU Hao, LVU Lili, LI Jinnian

(School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

To establish a double-antibody sandwich ELISA method for the detection ofinterleukin 10 (IL-10). Firstly,IL-10 gene was cloned, the prokaryotic expression recombinant plasmid pET-32a-IL-10 was constructed and expressed in the study, and the recombinantIL-10 (rIL-10) protein was purified to obtain the purified protein. Subsequently, rabbit anti-rIL-10 polyclonal antibody and mouse anti-rIL-10 polyclonal antibody were prepared using the purified rIL-10 protein as an immunogen purified and labeled with enzyme. Finally, double-antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) was used, in which the purified mouse anti-rIL-10 antibodies, the purified rIL-10 protein and the HRP-labeled rabbit anti-IL-10 purified antibodies were used as capture antibodies. The sandwich developed the antigen and detected the antibody by optimizing the reaction conditions. The results showed that the optimal reaction conditions of the developed method included coating with the capture antibodies at the concentration of 20 μg·mL-1, probing with the HRP-labeled rabbit anti-IL-10 antibodies at the proportion of 1∶3 200, sealed with 5% degreasing milk powder at 37 °C for 1.5 hours, 2 hours of reaction time, and judging with450value≥0.174 as a positive criterion. The coefficient of variation of repeatability within and between plates was all less than 10%, in the developed method minimum detection limit was 24.29 ng·mL-1. In addition, the established DAS-ELISA could detectIL-10specifically, no cross-reaction with other cytokines including grass carp interleukin-6, grass carp tumor necrosis factor, mouse interleukin-10, mouse interferon, or mouse monocyte chemoattractant protein. Our results indicated that the estab-lished double-antibody sandwich ELISA in this study possessed a better specificity, reproducibility and sensitivity, which might be used for the rapid detection ofIL-10.

interleukin 10; clone and expression; antibody preparation; double- antibody sandwich ELISA

S917; S965.112

A

1672-352X (2021)01-0073-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.021

2021-3-24 9:43:10

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20210319.1548.042.html

2020-02-09

國家自然基金面上項目（31672698）資助。

胡忠俊，碩士研究生。E-mail：hzj19962020@163.com

李槿年，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：lijinnian2000@163.com