田 帥，譚夢超，韋 維，楊 娟，劉慧勤，黃桂香，王國全

（1 植物科學國家級實驗教學示范中心，廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005）

（2 南寧師范大學地理與海洋研究院）

（3 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院）

（4 廣西大學輕工與食品工程學院）

柑橘類種質(zhì)資源在我國分布廣泛，總產(chǎn)量在我國眾多水果中位居首位，深受人們喜愛。柑橘類果皮中富含黃酮類化合物、類胡蘿卜素、精油、纖維素等多種有益成分，其中柑橘精油用途最廣泛[1-5]。柑橘精油具有很好的保鮮、抗氧化、抑菌等特點，主要應用于天然香料、食品保鮮、化妝品等行業(yè)[6-12]?！指獭恰蛊諣枴俪群汀の鳌t橘的雜交品種，因具有外觀好、晚熟、豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)等特點，是廣西近年發(fā)展速度最快的柑橘品種，但該品種果實受銹螨危害易發(fā)生黑皮果。

柑橘銹螨，即柑橘皺葉刺癭螨［Phyllocoptruta oleivora（Ashmead）］，又稱柑橘銹壁虱，是世界性柑橘害螨。柑橘銹螨體型微小、繁殖快，隨風力、昆蟲、器械等途徑傳播蔓延[13-14]。目前，關于柑橘銹螨的研究主要集中于形態(tài)特征[15-16]、生物學[17-20]、發(fā)生規(guī)律[21-22]、防治措施[23-27]等方面。柑橘銹螨主要為害柑橘的幼芽、枝葉、果實等各個部位[28-31]。在果實發(fā)育期，柑橘銹螨成螨、若螨將自身口器刺入柑橘果實中吸取汁液，柑橘果實油細胞受到損傷產(chǎn)生破裂，形成黑皮果[32-34]，也稱為“油皮坨”“油皮柑”。目前，柑橘銹螨危害形成黑皮果僅限于果實品質(zhì)方面的研究，測定了黑皮果的可溶性固形物、糖酸比、維生素C 含量等生理指標[35-36]。本試驗以‘沃柑’正常果和銹螨為害果為試驗材料，研究了柑橘銹螨對‘沃柑’果皮的微觀結(jié)構(gòu)和揮發(fā)油成分2 個方面的影響，以期為全面分析柑橘銹螨的危害機理提供新的研究思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘沃柑’果實于2019 年10 月7 日采自廣西大學標本園，分別采摘正常‘沃柑’果實和銹螨為害果實，用蒸餾水沖洗干凈，迅速收集果皮放入液氮中運回實驗室，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 儀器與藥品

超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司，DW-86L338J 型號）、冷凍干燥機（德國CHRIST公司，ALPHAL-4 LD PLUS 型號）、掃描電鏡（荷蘭PHENOM 公司，F(xiàn)16502 型號）、高精度恒溫水槽（THCY-18Q）、手動進樣手柄（SPME）、萃取頭（50-30UM DVB-CVR on PDMS 萃取）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司，TQ8040 型號）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 電鏡樣品前處理

取超低溫冰箱中的果皮（長5 mm、厚3 mm），迅速轉(zhuǎn)移到低溫冷凍干燥機干燥24 h，用雙面導電膠將干燥后的果皮樣品粘貼在樣品臺上，噴金處理后進行掃描電鏡觀察拍照。

1.3.2 揮發(fā)油成分樣品前處理

先將果皮粉碎，迅速取0.5 g 樣品裝入樣品瓶中，再將萃取頭插入進樣口于250 ℃老化2 min，老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，推出纖維頭，80 ℃條件下恒溫磁力攪拌吸附1 h，然后從樣品瓶上拔出萃取頭，插入設置好條件的GC-MS 進樣口，250 ℃條件下解析2 min 開始采集數(shù)據(jù)。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱（DB-5MS，30.0 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，色譜柱起始溫度50 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min 的速率上升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持10 min。載氣（氦氣），流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，離子化方式SIM，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍45～600 m/z。

通過NIST14.lib 標準譜庫檢索確定成分種類，采用面積歸一法計算各成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡結(jié)果分析

由圖1、圖2 可以看出，‘沃柑’正常果皮表面整體呈平滑狀，局部具有柑橘類果皮特有的皺褶，氣孔完整，視野內(nèi)未觀察到角質(zhì)層損傷，結(jié)構(gòu)保持完整；柑橘銹螨為害果皮角質(zhì)層出現(xiàn)明顯龜裂，裂縫無固定方向，結(jié)構(gòu)完整性受到嚴重破壞。

圖1 ‘沃柑’正常果皮電鏡圖

圖2 銹螨為害‘沃柑’果皮電鏡圖

2.2 揮發(fā)性成分結(jié)果分析

由表1 可知，‘沃柑’正常果皮共檢測出來75種成分，占總峰面積的81.60%，萜烯烴類、酯類、醇類為主要成分，含量較高的成分有檸檬烯（52.26%）、月桂烯（5.25%）、2-蒎烯（1.75%）、芳樟醇（1.33%）、棕櫚酸甲酯（1.20%）等。銹螨為害果皮共檢測出來79 種成分，占總峰面積的72.87%，萜烯烴類、酯類、醇類為主要成分，含量較高的成分有檸檬烯（44.17%）、月桂烯（5.16%）、2-蒎烯（1.82%）、α-衣蘭油烯（1.21%）、棕櫚酸甲酯（1.17%）等。

‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮共有相同成分54 種，其中檸檬烯含量均最高，‘沃柑’正常果皮中含量為52.26%，銹螨為害果皮中含量為44.17%（表1），與前人測定的柑橘類品種基本一致[37-38]。月桂烯的含量僅次于檸檬烯，其具有香油和天竺葵的特有香味。芳樟醇是柑橘香氣的主要成分之一，具有特殊的花香味[39-41]。酯類、醛類、酮類等都是柑橘果皮揮發(fā)油中重要的香味成分，使果實散發(fā)出特有的芳香味[42-43]。

‘沃柑’正常果皮特有的成分有21 種（表1），其中特有的青葉醛和共有的香茅醛是主要的脂肪類香氣，具有特殊的香味，可用于高級香料和精油的調(diào)制[44]?！指獭麑嵤茕P螨危害后產(chǎn)生了25 種特有的成分，有研究證實[45]，角鯊烯可參與清除果實內(nèi)部的自由基，并提高氧負荷，可以起到很好的保鮮作用。

表1 ‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮揮發(fā)油GC-MS 分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

由表2 分析得出，‘沃柑’受柑橘銹螨危害后，果皮醇類、萜烯烴類、醛類、酮類、酚類的含量降低，酯類、烷烴類、酸類、醚類的含量上升?！指獭９]發(fā)油成分有8 類，分別為醇類（6.94%）、萜烯烴類（65.89%）、酯類（3.59%）、醛類（2.89%）、酮類（0.58%）、酚類（0.29%）、烷烴類（1.02%）、酸類（0.40%），分別包含了20、19、15、8、4、3、3、3 種成分。柑橘銹螨為害果皮揮發(fā)油成分有9 類，分別為醇類（3.59%）、萜烯烴類（59.86%）、酯類（4.04%）、醛類（2.61%）、酮類（0.33%）、酚類（0.03%）、烷烴類（1.58%）、酸類（0.76%）、醚類（0.07%），分別包含了18、21、18、8、2、1、7、3、1 種成分。

表2 ‘沃柑’正常果皮和銹螨為害果皮揮發(fā)油成分的種類及相對含量

3 討論與結(jié)論

柑橘銹螨為害果實誘發(fā)黑皮果，導致果型變小、果囊硬實、色澤和可口性變差，嚴重降低了果實品質(zhì)。本研究重點討論了銹螨為害后‘沃柑’果皮的微觀結(jié)構(gòu)和揮發(fā)油成分變化，證實了柑橘銹螨為害果實會引發(fā)果皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)破壞。果皮最外側(cè)覆蓋著一層疏水性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)——角質(zhì)層，是一種復合的、異質(zhì)分布的生物聚合物，主要參與蒸騰作用、氣體交換、親酯物質(zhì)運輸?shù)壬砩磻恼{(diào)控，同時具有保持果實表面潔凈、防止微生物和昆蟲侵染等多種功能[46-56]。外源物的刺激會引起柑橘果皮角質(zhì)層的成分和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而角質(zhì)層結(jié)構(gòu)和成分的異常改變與果實正常膨大發(fā)育之間的不協(xié)調(diào)，最終會引起果皮呈現(xiàn)大面積褐斑和果實內(nèi)部生理紊亂，進而影響果實品質(zhì)[57-60]。結(jié)合之前相關學者對柑橘角質(zhì)層的研究結(jié)論對比分析得出，柑橘銹螨為害‘沃柑’果實會引起果皮角質(zhì)層出現(xiàn)大面積龜裂，破壞果皮角質(zhì)層正常結(jié)構(gòu)，影響果實內(nèi)部膨大發(fā)育和正常生理反應，從一定程度上可以解釋柑橘黑皮果果型較小、色澤度和口感差的形成機理。

柑橘表皮角質(zhì)層主要由脂肪族化合物和萜類化合物等組分構(gòu)成，脂肪族化合物主要為C23～C33醛、C20～C31初級醇、C16～C34偶數(shù)碳原子鏈飽和脂肪酸、C18∶1、C18∶2不飽和脂肪酸和C21～C33奇數(shù)碳原子鏈烷烴，其中C24、C26、C28是主要的醛類物質(zhì)，C29和C31在烷烴中占據(jù)著主要地位，部分柑橘角質(zhì)層還檢測到次級代謝物——微量膽固醇和酮類物質(zhì)[58,61-62]。研究表明，環(huán)境改變和外源刺激會導致角質(zhì)層組分發(fā)生改變，影響化合物的合成途徑[63-64]。由此分析本試驗中柑橘銹螨為害‘沃柑’果實引起醇類、萜烯烴類等物質(zhì)含量的下降和酯類、烷烴類等物質(zhì)含量的上升，根本原因是角質(zhì)層中相應的生化反應途徑受到柑橘銹螨危害刺激后發(fā)生了改變，引發(fā)了不同組分之間的相互轉(zhuǎn)變。柑橘角質(zhì)層的研究在生物合成、成分變化、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面雖取得一定進展，但是存在成分研究具有偏好性，研究方向集中在含量和組分、種類方面，深層機理和多種功能相關性驗證研究較少[65-67]。鑒于目前技術水平和相關機理研究的缺乏，試驗數(shù)據(jù)尚不能很好地揭示揮發(fā)油成分種類及含量變化的生化反應途徑機理。

柑橘銹螨危害形成黑皮果機理研究方面，明確相關侵染機制、角質(zhì)層防御機制、果實內(nèi)部的生理生化防御機制、分子水平的防御機制和反應通路顯得尤其重要。由于柑橘種質(zhì)資源眾多，不同品種對柑橘銹螨的抗性不同，未來可以根據(jù)分子水平上的防御機制選育對柑橘銹螨具有特定抗性基因的優(yōu)良品種，最終從根源上降低柑橘銹螨危害，提高柑橘果實品質(zhì)。鑒于柑橘眾多品種之間親緣關系復雜，柑橘銹螨對不同柑橘品種的侵染機制，以及不同品種對柑橘銹螨的抗性機制是否會存在較大差異，仍有待于進一步的研究。