成 津 王 聰 谷涌泉

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

引言

隨著生活水平的改善以及人口老齡化的不斷發(fā)展，心血管疾病已成為致使人類死亡的首要原因[1]。截至目前，血管旁路移植術(shù)仍然是實現(xiàn)長期血運重建的最佳治療措施。在此基礎(chǔ)上，小口徑(內(nèi)徑<6 mm)血管移植物在冠狀動脈搭橋，下肢動脈旁路移植及血液透析中的動靜脈造瘺等方面具有迫切的臨床需求。自體動靜脈仍然是血管替代物選擇的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于諸多原因，約1/3的患者無合適可用的自體血管[2]。另外，人造血管材料(膨體聚四氟乙烯等)作為小口徑血管替代物的通暢率并不理想[3]。因此，尋求合適的小口徑血管移植物成為臨床工作中亟待解決的問題。

組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為解決上述難題開辟了新的途徑。組織工程學(xué)是一門工程學(xué)、材料學(xué)和生命科學(xué)相結(jié)合的交叉學(xué)科，旨在體外構(gòu)建具有生物活性的組織替代物，用于替代、修復(fù)或改善人體組織器官的形態(tài)和功能[4]。來源于天然組織的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成為最新興起的一種組織工程支架材料，是指通過物理、化學(xué)、酶學(xué)等方法對天然組織進行脫細胞處理，去除組織內(nèi)具有免疫原性的細胞成分，僅保留低免疫原性的細胞外3D基質(zhì)骨架，用于異體或異種組織器官移植。因此，可使用脫細胞技術(shù)對異種或異體血管進行去細胞處理，以此構(gòu)建適用于體內(nèi)移植的脫細胞血管。脫細胞血管基質(zhì)主要由膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖以及其他多種生物活性因子構(gòu)成?；|(zhì)內(nèi)的膠原蛋白和彈性蛋白保證了脫細胞血管的機械強度和柔韌性。膠原蛋白、糖胺聚糖和多種活性因子的共同作用有助于細胞的黏附和生長?；|(zhì)支架內(nèi)的網(wǎng)狀空隙為細胞增值和基質(zhì)沉積提供了充足空間。總之，脫細胞處理后的ECM支架保留了復(fù)雜的細胞外3D組織結(jié)構(gòu)和生物活性，接近于原始血管的結(jié)構(gòu)和功能，更加符合組織工程材料對血管移植物的要求，具有重要的應(yīng)用價值。

1 脫細胞技術(shù)制備ECM的原理

供體細胞作為外來抗原，進入受體內(nèi)部會誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。顧名思義，脫細胞技術(shù)就是通過多種方法去除血管組織中可引起免疫排斥反應(yīng)的細胞和核酸，保留相對穩(wěn)定的ECM，用于構(gòu)建組織工程血管支架，使其植入體內(nèi)后可被宿主接受，從而避免移植后的排斥反應(yīng)。

脫細胞技術(shù)的最終目的是在盡可能徹底清除細胞的同時最大程度地保留原始血管的ECM結(jié)構(gòu)成分，使最終獲取的ECM支架具有接近天然血管的機械性能和生物活性，從而保證移植物在宿主體內(nèi)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和再生能力，以此來構(gòu)建合格的組織工程血管移植物用于血管旁路移植手術(shù)[1]。

2 脫細胞方法

為了徹底去除組織內(nèi)的細胞，研究人員嘗試了不同的脫細胞方法，但是任何一種脫細胞處理都會對ECM造成不同程度的損傷。因此，為了獲取滿意的脫細胞血管支架，合理選擇脫細胞方法至關(guān)重要。

2.1 物理方法

2.1.1凍融

反復(fù)凍融能夠有效裂解組織或器官內(nèi)的細胞。組織細胞經(jīng)過凍融處理后在其胞內(nèi)形成冰晶，致使剩余胞液鹽濃度增高使細胞溶脹破碎。凍融對ECM的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能影響甚微，組織經(jīng)過反復(fù)凍融處理后對后續(xù)化學(xué)脫細胞作用更加敏感，可以顯著提高脫細胞效率[5]。Daniel等[6]通過聯(lián)合凍融和化學(xué)脫細胞方法成功制備出人源脫細胞臍靜脈，并認(rèn)為凍融的最佳溫度為-80℃，溫度偏高會導(dǎo)致效率低下，而液氮溫度下凍融會導(dǎo)致纖維斷裂。為了使血管組織內(nèi)細胞充分裂解，可進行多次凍融循環(huán)[5]。反復(fù)凍融后，細胞內(nèi)容物仍然存在，必須借助酶或化學(xué)處理才能徹底清除。

2.1.2壓力法

細胞膜在高壓力負(fù)荷下會出現(xiàn)變形破壞，機械壓力可有效破壞血管內(nèi)細胞，避免過多使用化學(xué)試劑引起支架內(nèi)有毒物質(zhì)殘留，因此該方法被廣泛應(yīng)用。壓力法主要作用于具有膜結(jié)構(gòu)的細胞和細胞器，而對于ECM的影響微弱。 Funamoto等[7]使用高靜水壓(high hydrostatic pressurization, HHP)對豬的降主動脈進行脫細胞處理，得到的支架的力學(xué)性能較新鮮動脈并無顯著差異，動物實驗證實該ECM支架可在體內(nèi)實現(xiàn)快速內(nèi)皮化。Mahara等[8]使用HHP制備脫細胞血管支架，通過比較多個壓力值和不同加壓時間對細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)在200 MPa下加壓10 min可使線粒體失活而致使細胞死亡。HHP聯(lián)合化學(xué)試劑可高效去除血管內(nèi)細胞，且不會顯著破壞ECM支架的機械性能，得到的脫細胞血管在動物體內(nèi)可保持通暢并成功內(nèi)皮化[9]。

2.1.3機械攪拌和超聲

機械攪拌往往貫穿于整個脫細胞過程。機械攪拌通常使用磁力攪拌托盤或者搖振器實現(xiàn)，機械攪拌有利于化學(xué)物質(zhì)與組織充分接觸并滲入組織內(nèi)部，可以顯著提高脫細胞效率，是常用的脫細胞輔助手段[10-11]。超聲波可有效增強化學(xué)試劑對組織的滲透作用，同時能夠減弱細胞膜的機械穩(wěn)定性，可有效協(xié)助其他脫細胞方法對組織進行脫細胞處理[12]。Azhim等[13]使用超聲波對豬降主動脈進行脫細胞處理，研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲波可顯著提升脫細胞效率，縮短脫細胞時間。對于脫細胞過程中的超聲波輸出功率等相關(guān)參數(shù)仍缺乏具體報道。

物理方法可顯著提高脫細胞效率，對ECM的結(jié)構(gòu)破壞較小而受到廣泛青睞，但單獨采用物理方法的脫細胞效果差，必須與其他脫細胞方法聯(lián)合使用。

2.2 化學(xué)試劑

2.2.1低滲或高滲溶液

低滲或高滲溶液引起的滲透壓改變可用于組織的脫細胞處理。高滲鹽水可以從蛋白中解離出DNA。低滲溶液可以導(dǎo)致細胞脹溶，且對ECM結(jié)構(gòu)破壞較小。Sakakibara等[14]通過單獨使用高滲鹽溶液(1 M NaCl)處理鼠的腹主動脈，得到的ECM支架回植入大鼠體內(nèi)，移植后1周即可觀察到新生的內(nèi)皮細胞，5周后形成完整的內(nèi)皮細胞層，1年后在ECM支架內(nèi)部可監(jiān)測到具有收縮活性的平滑肌細胞聚集，14個月后移植物仍保持通暢。Tondreau等[15]采用去離子水多次處理血管得到ECM，結(jié)果表明使用低滲溶液可達到良好的脫細胞效果，且不會影響ECM的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。為了強化滲透液脫細胞效果，研究人員將動物血管在高滲溶液和低滲溶液之間循環(huán)處理，以徹底去除殘留細胞[16]。然而，為了更加高效地制備ECM，多數(shù)情況下需要將滲透溶液和其他化學(xué)方法聯(lián)合使用[17]。

2.2.2酸和堿

酸堿溶液不但可以有效溶解胞質(zhì)成分，而且能夠清除核酸物質(zhì)。Mangold等[18]用0.1%過氧乙酸對人臍靜脈血管進行脫細胞處理，得到的ECM成分保留完好。Van等[19]將NaOH處理后的豬頸動脈植入大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞在ECM支架內(nèi)生長良好。此外，研究認(rèn)為NaOH可以導(dǎo)致血管基質(zhì)內(nèi)膠原纖維斷裂和降解[20]。由于酸堿溶液易引起蛋白變性而影響ECM的結(jié)構(gòu)和功能，因此在血管組織的脫細胞過程中需謹(jǐn)慎使用。酸堿溶液常與去垢劑配合使用達到脫細胞目的[17, 21]。

2.2.3非離子去垢劑

Triton X-100是最常用的非離子去垢劑,通過破壞DNA-蛋白之間、脂質(zhì)之間及脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互連接而達到脫細胞目的，對蛋白質(zhì)之間的作用影響較小。Triton X-100對疏松壁薄的組織可以起到滿意的脫細胞效果，1% Triton X-100常用來制備脫細胞血管支架。Dahl等[22]比較了3種脫細胞方法對豬頸動脈的影響，結(jié)果顯示單獨使用Triton X-100并不能有效清除動脈內(nèi)的核酸物質(zhì)，脫細胞效果并不理想。筆者認(rèn)為，Triton X-100作用相對溫和，而該實驗中各處理組脫細胞時間都不超過24 h，導(dǎo)致Triton X-100作用時間過短未能達到脫細胞目的。在此基礎(chǔ)上，Zou等[23]將Triton X-100作用時間延長至48 h，使得到的脫細胞豬胸主動脈的基質(zhì)結(jié)構(gòu)和機械強度保留完好。Triton X-100對蛋白質(zhì)作用較弱，因此對細胞外基質(zhì)和蛋白類生物活性因子破壞較小，有利于細胞在基質(zhì)支架表面黏附生長[24]。Triton X-100 脫細胞作用溫和，現(xiàn)已較少單獨用于脫細胞處理，常與酶和(或)離子去垢劑聯(lián)合使用。Triton X-100毒性較強，殘留在ECM內(nèi)的Triton X-100容易導(dǎo)致細胞死亡，且會引發(fā)受體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此脫細胞處理后應(yīng)充分清洗。

2.2.4離子去垢劑

離子去垢劑可以有效溶解細胞膜并能將DNA從蛋白中分離出來，但容易對ECM蛋白造成損害，常用的離子去垢劑主要有十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)和脫氧膽酸鈉 (sodium deoxycholate, SD)。Bertanha等[25]比較了2% SD和1% SDS對兔腔靜脈的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SDS顯著破壞了血管內(nèi)膠原蛋白和顯微結(jié)構(gòu)。相比于其他去垢劑，SDS脫細胞效力較強，對于致密組織也能起到良好的脫細胞效果，但也更易引起ECM 蛋白變性，同時會導(dǎo)致糖胺聚糖及生長因子丟失[7]。在脫細胞血管的制備過程中，SDS的使用濃度從0.1%～1%不等，對于細胞的清除和ECM的損傷隨使用濃度和脫細胞時間的增加而愈加顯著。低濃度SDS可以有效清除靜脈血管壁細胞，且不會顯著破壞ECM[26]。通過對羊的頸動脈進行脫細胞處理發(fā)現(xiàn)，1%SDS會破壞ECM的機械性能，相比之下Triton X-100并無明顯影響[27]。Tuan等[28]通過對比0.1%、0.5%、1%等3種不同濃度SDS對人臍動脈的影響，脫細胞處理48 h后發(fā)現(xiàn)1%SDS處理后的ECM內(nèi)無核酸殘留，然而脫細胞血管的GAG含量明顯下降，脫細胞后的血管爆破強度顯著降低。該結(jié)果表明高濃度SDS易損傷ECM。為了避免對細胞外成分的破壞，一些研究使用較低濃度SDS成功去除了動脈壁內(nèi)細胞，得到性能良好的脫細胞動脈支架[29-30]。上述研究表明低濃度SDS對ECM影響較小，更合適用于血管的脫細胞處理。SDS對蛋白質(zhì)親和作用較強，可破壞部分蛋白類生物活性因子，影響脫細胞血管的生物活性。ECM中殘留的SDS影響支架植入后受體細胞的增殖，但不會阻礙外源種植細胞的生長[31]。

2.2.5兩性離子去垢劑

相比非離子去垢劑，兩性離子去垢劑更易引起ECM蛋白變性。3-[3-(膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(3-[(cholamidoproyl)dimethy lammonia]-1-propanesulfonate, CHAPS)是最為常用的兩性離子去垢劑。CHAPS的脫細胞效力介于Triton X-100與SDS之間，屬于相對溫和的脫細胞試劑。研究表明，內(nèi)皮細胞在CHAPS處理后的脫細胞腹主動脈管腔面生長良好[32]。與此相反，Simsa等[24]通過對豬的腔靜脈進行脫細胞處理發(fā)現(xiàn)，CHAPS顯著降低了血管內(nèi)GAG和可溶性蛋白含量，阻礙了內(nèi)皮細胞在腔靜脈表面生長。筆者認(rèn)為這種差異可能是靜脈血管壁組織薄弱，更易受脫細胞作用影響，導(dǎo)致ECM受損。隨著脫細胞方法的不斷改進，研究人員將CHAPS與SDS聯(lián)合使用對血管進行脫細胞處理，處理后的ECM支架各結(jié)構(gòu)成分保留完好，體內(nèi)實驗證實其良好的可再生活性[33]。

2.2.6醇類

醇類溶劑如丙三醇，可促使細胞脫水溶解而達到清除細胞的目的。醇類溶劑單獨使用時效果較差，因此常與去垢劑或酶聯(lián)用[34]。Van等[35]通過乙醇和丙酮的混合溶液去除人臍靜脈內(nèi)的細胞，與SDS相比，該方法得到的ECM支架可降低血小板在其表面聚集。McFetridge等[36]使用醇類試劑成功萃取出豬頸動脈血管內(nèi)的甘油三脂，但處理后血管基質(zhì)的力學(xué)性能受到影響。Uchimura等[37]使用乙二醇分別對大鼠和豬的動脈血管進行了脫細胞處理，結(jié)果顯示乙二醇的脫細胞作用比Triton X-100更加高效，脫細胞血管的基膜結(jié)構(gòu)保留完好，體外種植細胞后觀察到細胞在脫細胞血管表面黏附生長。一些醇類，如甲醇、乙醇等易使蛋白沉淀，損害ECM的亞顯微結(jié)構(gòu)，使用時需格外小心。

2.2.7螯合劑

二價陽離子(鈣、鎂等)對于細胞在ECM蛋白上的接觸黏附是必不可少的。螯合劑可分離位于其中心的金屬離子，破壞細胞對ECM的黏附，從而將細胞從組織中分離出來，起到協(xié)助脫細胞的作用。常用的螯合劑主要有乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)及乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)，前者更為常用。螯合劑單獨使用并不能去除組織內(nèi)的細胞，多與去垢劑或/和酶連用[38]。另一方面，EDTA可以抑制脫細胞過程中細胞破裂釋放的內(nèi)源性金屬蛋白酶對ECM的破壞，從而在脫細胞過程中起到保護作用。

2.3 酶

2.3.1胰蛋白酶

胰蛋白酶(Trypsin)對水解賴氨酸和精氨酸的肽鏈具有特異性，37℃、pH=8條件下其活性最強。相比于其他脫細胞試劑，Trypsin更易引起ECM內(nèi)蛋白變性，大量研究證明單獨Trypsin脫細胞后的ECM受損嚴(yán)重。Zou等[23]使用0.5% Trypsin處理豬胸主動脈，脫細胞處理48 h后觀察到ECM支架內(nèi)的膠原纖維破壞嚴(yán)重。Yong等[39]使用0.25% Trypsin成功清除犬頸動脈細胞，得到的脫細胞支架與內(nèi)皮細胞親和性良好。Liu等[40]將胎豬的主動脈在0.1% Trypsin中作用36 h進行脫細胞處理，脫細胞前后血管的爆破強度和抗張強度無明顯變化，內(nèi)皮細胞在支架表面生長良好。這可能提示低濃度Trypsin更適合于血管的脫細胞處理。然而，對于管壁薄弱的冠狀動脈來說，低濃度Trypsin仍會破壞ECM的結(jié)構(gòu)成分[41]。研究人員通常將Trypsin與EDTA合用，以提高脫細胞效率。殘留的Trypsin必須徹底清除，防止ECM進一步受損。

2.3.2核酸酶

核酸酶通過催化核酸和脫氧核糖核酸肽鏈的水解來破壞DNA和RNA。核酸內(nèi)切酶促使DNA或RNA內(nèi)部鍵的斷裂，而核酸外切酶主要作用于DNA或RNA的末端鍵。因此，核酸內(nèi)切酶對核苷酸的破壞最用更強。Mangold等[18]發(fā)現(xiàn)，相比于單純?nèi)ス竸┟摷毎?，去垢劑?lián)合核酸酶處理后的ECM成分和顯微結(jié)構(gòu)都受到嚴(yán)重破壞，力學(xué)性能下降，且不利于細胞生長。Simsa等[24]同樣發(fā)現(xiàn)，核酸酶可能會破壞血管基質(zhì)的力學(xué)穩(wěn)定性并降低細胞糖胺多糖含量。然而，部分研究并未發(fā)現(xiàn)核酸酶在脫細胞過程中的負(fù)面效應(yīng)[42-43]。到目前為止，核酸酶主要用于去除脫細胞后殘留的核酸，關(guān)于其對ECM 的影響研究較少，有待進一步探索。殘留在支架內(nèi)的核酸酶可能會引發(fā)受體的免疫反應(yīng)[44]。

2.4 血清

血清內(nèi)的脫氧核糖核酸酶I可以將DNA消化成碎片，用于除去殘留的DNA。Mg2+和酸性環(huán)境能夠促進血清的脫細胞作用。脫細胞血管經(jīng)過受體血清處理后得到的ECM纖維結(jié)構(gòu)保留完好，而且能夠避免在受體內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)[45]。因此有研究小組將血清用于制備脫細胞血管支架[46]。然而異種血清中的免疫原性物質(zhì)會引起不良的宿主反應(yīng)，限制了血清在脫細胞方面的應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

脫細胞方案的選擇常常需要聯(lián)合上述多種方法，在盡可能清除細胞成分的同時保留ECM結(jié)構(gòu)和功能完整，從而保證足夠的機械強度和生物活性以利于脫細胞支架在體內(nèi)發(fā)揮作用。盡管后期可通過交聯(lián)、負(fù)載多種生物活性分子來改善脫細胞血管的整體性能，但是這些外來物質(zhì)在體內(nèi)長期作用的有效性和安全性并未被充分證實。目前研究者使用的脫細胞試劑和方法多種多樣，但因為脫細胞材料的組織來源不同和對最終產(chǎn)品性能要求的差異，現(xiàn)有的脫細胞方案用于制備異種小口徑組織工程血管的確切效果并未被廣泛證實。制定高效合理的脫細胞標(biāo)準(zhǔn)方案仍需深入探索。

脫細胞血管的制備工藝簡單，不受時間、技術(shù)和場所的限制，易于滅菌和消毒，加之異體或異種血管組織來源豐富，為脫細胞血管的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和存儲提供了可能，能夠滿足臨床醫(yī)療耗材的需求。此外，脫細胞血管為生物植入物，必須達到不同國家對臨床批準(zhǔn)的嚴(yán)格監(jiān)管要求。

脫細胞血管應(yīng)具備良好的力學(xué)強度和順應(yīng)性，可承受縫線牽拉和血流沖擊并有效預(yù)防吻合口內(nèi)膜增生，避免形成動脈瘤，以符合臨床應(yīng)用對血管移植物的基本要求。Lindsey等[47]將脫細胞血管應(yīng)用于下肢動脈硬化閉塞患者的血管旁路移植，取得了滿意的通暢率和保肢率。盡管如此，對于組織工程血管的安全性和有效性仍需要對特定患者人群的多中心前瞻性臨床研究來逐步證實。值得注意的是，由于血管組織來源長度受限，對于臨床上需要進行長段血管移植的病例仍存在挑戰(zhàn)。

隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，脫細胞技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其在構(gòu)建小口徑血管移植物方面具有獨特優(yōu)勢。然而目前國內(nèi)的相關(guān)技術(shù)并不成熟，因此需要多學(xué)科合作來共同推動國內(nèi)組織工程領(lǐng)域向前發(fā)展，構(gòu)建具有臨床應(yīng)用前景的血管替代物，為廣大的心血管疾病患者送去福音。