彭 穎 周文蔚 姚 慧 劉志薇 張 琛 魏國清

(安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036)

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，在分類學上屬于真菌界 (Fungi)擔子菌門 (Basidiomycota)蘑菇綱 (Agaricomycetes)銹革孔菌目 (Hymenochaetales)銹革孔菌科 (Hymenochaetaceae)木層孔菌屬 (Phellinus)[1]，多生于楊、柳、樺樹等闊葉樹的枯立樹枝或者樹干上，其子實體的大小不一，外觀形態(tài)均接近褐色馬蹄形，難以通過形態(tài)特征進行鑒別。因此，桑黃曾經(jīng)的學名有鮑姆木層孔菌 (Phellinusbaumii)、裂蹄木層孔菌 (Phellinuslinteus)、火木層孔菌 (Phellinusigniarius)等[1]。直至2012年，吳聲華[2]研究表明桑黃是未曾發(fā)表過的新種Inonotussanghuang，而后桑黃被歸于新屬桑黃孔菌屬 (Sanghuangporus)[3]，學名改為桑黃 (Sanghuangporussanghuang)。由于過去一段時間的桑黃物種分類不明確，常有同名異物、同物異名的現(xiàn)象發(fā)生[4-5]，這非常不利于對桑黃的進一步研究與開發(fā)利用 。

桑黃是一種多年生的藥用真菌，具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、抗肺炎、降血糖等作用[6]，引起了國內(nèi)外醫(yī)藥與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的興趣，市場前景廣闊，但是桑黃對于生長環(huán)境要求較高且桑黃的開發(fā)力度大，使得野生的桑黃資源非常稀缺。目前，人們已經(jīng)實現(xiàn)了桑黃的工廠化人工袋料栽培[7-9]。

雖然無法直接由形態(tài)特征區(qū)分桑黃的不同品種，但為了適應(yīng)不同地理、生態(tài)條件，桑黃菌株的基因組產(chǎn)生了一定的變異，從而可為桑黃的分類鑒定提供分子基礎(chǔ)。核糖體DNA (ribosomal DNA，rDNA)具有廣泛的異種同源性，其編碼區(qū)序列較為保守，而非編碼區(qū)序列進化速率快，具有豐富的變異，在不同形態(tài)的真菌物種間表現(xiàn)出較高的差異性[10-11]。尤其是rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)又分為18S rDNA與5.8S rDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(rDNA ITS1)和5.8S rDNA與28S rDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(rDNA ITS2)。rDNA ITS1和rDNA ITS2都是中度保守序列，均表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致、種間差異比較明顯的保守性[12]，即使是親緣關(guān)系非常近的2個種也能夠在rDNA ITS序列上顯示出差異，從而表現(xiàn)出序列的多態(tài)性[13]。rDNA ITS序列分析技術(shù)具有穩(wěn)定性好、準確度高、特異性強等特點[14]，因此成為真菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析的常用方法。

本文通過對桑黃Y1菌株rDNA ITS的克隆與分子進化分析，期望能夠為桑黃的分類及鑒定奠定基礎(chǔ)，也為其他真菌的分類和鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 桑黃菌株Y1為安徽農(nóng)業(yè)大學蠶絲生物技術(shù)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，購自北京Transgene公司；DNA純化回收試劑盒，購自美國Axygen公司；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker，購自日本TaKaRa公司；其他試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司，均為分析純。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 S1000PCR儀，購自美國BIO-RAD公司；Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能科技有限公司；SYC-2101水平搖床，購自美國精騏有限公司；電泳槽、DYY-6C/PowerPAC3000電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 母種培養(yǎng)基按照周蔓[4]的方法配制馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂[potato dextrose agar (medium)，PDA] 固體培養(yǎng)基。

1.2.2 桑黃菌絲的培養(yǎng) 將低溫保存的桑黃Y1菌株接種到試管斜面固體PDA培養(yǎng)基后，26 ℃恒溫活化5～7 d，再轉(zhuǎn)管2次，恒溫培養(yǎng)5～7 d后，即可獲得活力旺盛的菌絲。

1.2.3 桑黃全基因組DNA的提取 取適量桑黃菌絲置于事先滅菌的研缽中，用液氮研磨成粉后轉(zhuǎn)移至離心管中。然后利用DNA提取試劑盒從桑黃Y1菌株的菌絲中提取其全基因組DNA，檢測所提取的DNA的質(zhì)量，將獲得的桑黃Y1菌株的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 桑黃Y1菌株rDNA ITS序列的PCR擴增及產(chǎn)物膠回收 以提取獲得的桑黃Y1菌株基因組DNA為模板，上游引物為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、下游引物為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，對桑黃rDNA的ITS序列進行PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min→94 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次→72 ℃總延伸10 min。PCR反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，并利用DNA純化回收試劑盒將目的條帶純化回收。

1.2.5 連接反應(yīng) 將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，反應(yīng)體系為10 μL，4 ℃連接過夜。

1.2.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞 將連接產(chǎn)物與50 μL大腸桿菌感受態(tài)細胞輕輕吹打，混勻；再在冰上靜置30 min；42 ℃水浴熱激1 min；之后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2 min；取600 μL不含抗生素的LB無菌液體培養(yǎng)基加入到2 mL離心管中，置于37 ℃、170 r/min的搖床中復(fù)蘇1.5 h；在無菌操作臺上取100 μL菌液均勻涂布到含氨芐青霉素 (Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上；最后將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。

1.2.7 菌液PCR鑒定 取若干已滅菌的PCR管加入20 μL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基，挑取單菌落，做好標記，置于相應(yīng)的PCR管中混勻。另取對應(yīng)數(shù)量的PCR管進行菌液PCR，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min→94 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次→72 ℃總延伸10 min。完成后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳分析菌液PCR擴增產(chǎn)物，得到陽性克隆后，將相應(yīng)菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.8 rDNA ITS序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 在GenBank中選擇并下載12個木層孔菌屬桑黃同源物種及1個外群物種——杜波特集毛孔菌(Hydnochaeteduportii)的rDNA ITS序列(表1)，利用ClustalX對測得序列與下載序列進行完全比對，再利用Mega7.0軟件分析桑黃rDNA ITS1、5.8S rDNA、rDNA ITS2及rDNA ITS序列的長度、鳥嘌呤胞嘧啶含量(G+C)、堿基轉(zhuǎn)換數(shù)、顛換數(shù)、總替換數(shù)及轉(zhuǎn)換與顛換的比值，并計算各菌株間的遺傳距離，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 13個菌株材料的rDNA ITS序列登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃Y1 rDNA ITS序列的PCR擴增

利用通用引物對桑黃Y1菌株的rDNA的ITS片段進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果表明：擴增產(chǎn)物能產(chǎn)生均勻的單一條帶(圖1)，且無拖尾與降解現(xiàn)象，長度大約在750 bp左右，與預(yù)測片段大小基本一致，說明該擴增產(chǎn)物可供進一步純化與克隆使用。

圖1 桑黃Y1 rDNA ITS序列PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 桑黃Y1 rDNA ITS的序列分析

經(jīng)測序表明，桑黃Y1的rDNA ITS序列總長度為709 bp，由長度為311 bp的rDNA ITS1序列、長度為154 bp的5.8S rDNA 序列、長度為244 bp的rDNA ITS2序列構(gòu)成。從表2可以看出，Phellinus屬真菌的rDNA ITS序列長度區(qū)別明顯，P.baumii、P.linteus、P.igniarius的rDNA ITS區(qū)域序列總長度分別為669～747 bp、608～706 bp、603～612 bp；而rDNA ITS1序列長度分別為284～328 bp、285～300 bp、217～225 bp；5.8S rDNA 序列長度完全一致，均為154 bp；rDNA ITS2序列長度分別為231～265 bp、169～252 bp、232～233 bp。相較而言，P.baumii的rDNA ITS區(qū)域序列、rDNA ITS1序列及rDNA ITS2序列都較長，而P.igniarius的rDNA ITS區(qū)域序列、rDNA ITS1序列及rDNA ITS2序列則較短。進一步比較分析Phellinus屬真菌的rDNA ITS序列的堿基構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)rDNA ITS1及rDNA ITS2序列的G+C含量存在一定的差異，除了P.baumii-1及P.igniarius-2外，其它菌株rDNA ITS1序列的G+C含量均少于rDNA ITS2序列的G+C含量，而5.8S rDNA 序列的G+C含量完全一致?？傂蛄械腉+C含量基本接近50%，說明無堿基偏好。比較發(fā)現(xiàn)桑黃Y1的rDNA ITS序列構(gòu)成與P.baumii的序列構(gòu)成較為相似，可初步判斷桑黃Y1為P.baumii。

表2 桑黃Y1 rDNA ITS序列長度及G+C含量變異分析

分析桑黃屬rDNA ITS序列的堿基替換數(shù)得到表3，從表3可以看出，各菌株rDNA ITS1序列的堿基替換數(shù)與rDNA ITS2的堿基替換數(shù)相比明顯增多，而5.8S rDNA的堿基替換數(shù)與rDNA ITS1、rDNA ITS2相比則明顯減少，各菌株都只有4個堿基發(fā)生替換，說明5.8S rDNA序列較為保守。此外，堿基替換在rDNA ITS1與rDNA ITS2序列中發(fā)生較多，而rDNA ITS1序列比rDNA ITS2序列更易發(fā)生堿基替換。在rDNA ITS總序列的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)與堿基顛換數(shù)比例基本接近1∶1，其中rDNA ITS1序列的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)明顯少于堿基顛換數(shù)，而rDNA ITS2序列則相反；另外，5.8S rDNA序列的堿基轉(zhuǎn)換數(shù)也多于堿基顛換數(shù)?？梢?，堿基顛換在rDNA ITS1序列出現(xiàn)的可能性更高，而堿基轉(zhuǎn)換則更有可能發(fā)生在rDNA ITS2序列中，但總序列發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換與顛換的頻率基本相同。

表3 桑黃屬ITS序列堿基替換數(shù)

圖2 桑黃各菌株rDNA ITS1序列比對結(jié)果

圖3 桑黃各菌株5.8S rDNA序列比對結(jié)果

從桑黃各菌株的rDNA ITS序列比對結(jié)果 (圖2-4)可以看出，桑黃各菌株的5.8S rDNA序列同源性達100%，序列完全一致，說明5.8S rDNA序列在進化上極端保守；而rDNA ITS1序列和rDNA ITS2序列既有同源性達100%的區(qū)域，也有同源性大于75%的區(qū)域，同時還存在同源性大于50%的區(qū)域，說明rDNA ITS1和rDNA ITS2序列雖然也具有一定的保守性，但是仍然保留了很多變異位點，呈現(xiàn)出顯著的序列多態(tài)性，這也為利用rDNA ITS序列鑒別桑黃的種屬及進行系統(tǒng)進化分析提供了一定的依據(jù)。同時還可以發(fā)現(xiàn)P.linteus與P.baumii的rDNA ITS序列同源性相對更高，而P.igniarius的rDNA ITS序列與這兩者的rDNA ITS序列同源性相對較低，存在很多缺失位點，說明P.igniarius的rDNA ITS序列與這兩者的rDNA ITS序列存在一定程度的分化。

圖4 桑黃各菌株rDNA ITS2序列比對結(jié)果

2.3 基于桑黃rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究以桑黃Y1菌株的rDNA ITS序列及從GenBank中獲取的其它13個真菌的rDNA ITS序列為依據(jù)，利用Mega7.0軟件計算出各菌株間的遺傳距離，結(jié)果列于表4。從表4可以看出，桑黃Y1與P.baumii的遺傳距離最近，說明它們的親緣關(guān)系較近；桑黃Y1與P.igniarius的遺傳距離較遠，說明它們的親緣關(guān)系較遠，從而可以進一步推斷桑黃Y1在分類學上應(yīng)屬于P.baumii。從表4還可以發(fā)現(xiàn)，P.baumii和P.linteus之間的親緣關(guān)系相對較近，意味著它們種群之間基因交流頻繁，產(chǎn)生分化的時間可能較晚，但是這兩者都與P.igniarius有著較遠的親緣關(guān)系，存在明顯的遺傳分化。P.baumii-3與P.baumii-4以及P.baumii-3和P.baumii-4這兩者與P.baumii-1和P.baumii-2也存在一定的種間分化；P.linteus-1與其他3個P.linteus之間也存在明顯的遺傳分化。

表4 各菌種序列間的遺傳距離

以H.duportii為外種群，依據(jù)Y1的rDNA ITS序列及從GenBank中獲取的其它12個真菌的rDNA ITS序列信息，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖5)，從圖5可以看出，Phellinus屬真菌存在明顯聚類，可分為3個類群，類群I為P.baumii，類群II為P.linteus，類群III為P.igniarius。在系統(tǒng)進化樹中類群I、類群II、類群III又分為兩大支，類群I與類群II聚類在一起，說明它們兩者的同源性更高，親緣關(guān)系更近，而類群III則產(chǎn)生了一定的分化。Y1與P.baumii聚類在一起的相似性為99%，因此可以進一步推斷Y1為P.baumii。此外，與各菌株rDNA ITS序列信息分析的結(jié)果相比，具有較高的一致性，進一步體現(xiàn)了基于桑黃rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹的可信度。

圖5 基于桑黃rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結(jié)與討論

長期以來，真菌主要通過形態(tài)學特征鑒定和生理生化指標鑒定來鑒定其種屬，如通過觀察菌落及子實體形態(tài)特征、分析菌絲的酯酶同工酶、鑒定子實體成分等方式來鑒定真菌種屬[15-16]。但是很多真菌的菌落及其子實體形態(tài)極為相似，而且形態(tài)學觀察不僅易受環(huán)境等客觀因素的影響，還易受觀察者自身的主觀因素影響，因此，僅通過形態(tài)學觀察對難以分辨真菌的鑒定易產(chǎn)生較大的誤差，所耗時間還長，存在一定的局限性[4，17]。而生理生化指標也易受多種因素的影響，存在較大的不穩(wěn)定性[18]。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，真菌分類鑒定的途徑也有了更多的選擇，不再局限于形態(tài)學及生理生化鑒定。目前，分子鑒定技術(shù)相較于傳統(tǒng)的真菌分類鑒定技術(shù)，具有操作簡單、特異性好、可靠性高，且不受外界環(huán)境干擾，能夠直接反映出菌株的遺傳本質(zhì)等特點[14，18]。主要的分子鑒定技術(shù)包括隨機擴增多態(tài)性分析技術(shù)(RAPD)、DNA限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)、SSR分子標記技術(shù)、rDNA ITS序列分析技術(shù)等，這些分子鑒定技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于真菌的分類鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析等[18]。但是相較于RAPD在鑒定中的低可靠性和低重復(fù)性，RFLP的高技術(shù)要求及在鑒定某些物種時存在的較低靈敏性，rDNA ITS所具有的優(yōu)點如進化速率快、序列多態(tài)性廣泛等對真菌的分子鑒定有著更好的靈敏性和準確性，從而適用于不同物種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。迄今為止，已成功應(yīng)用于Lactarius屬真菌、Armillaria屬真菌、Puccinia屬真菌、Pneumocystis屬真菌、Alnus屬真菌等多種真菌的分子鑒定中[10，19-20]。利用rDNA ITS序列分析技術(shù)，可獲得足夠的信息，從而準確檢測出真菌屬間、種間以及菌株間的堿基對差異；反映出菌株的親緣關(guān)系與分類情況。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于同一菌種不同菌株、真菌近似屬間及同屬近緣種間的系統(tǒng)發(fā)育研究，能夠快速鑒別出利用傳統(tǒng)形態(tài)學方法無法區(qū)別的相似菌株[4，10，16]。

基于rDNA ITS序列的分子鑒定技術(shù)對桑黃種內(nèi)菌株的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進行分析，不僅研究了桑黃的進化歷程，也為我國桑黃資源開發(fā)利用、資源保護、品種選育、栽培技術(shù)等研究提供理論依據(jù)[21]。但是目前，桑黃菌種用名混亂，GenBank中收錄的菌株信息不夠標準，而標準菌株的數(shù)量又較少，缺乏完整性。因此，有時僅靠分子鑒定也無法區(qū)別那些富有爭議、來源不清的菌株，還需要結(jié)合形態(tài)學鑒定及生理生化分析，才能真正鑒別桑黃菌株及進行可靠的系統(tǒng)發(fā)育分析。隨著分子生物學的進步，人們將會開發(fā)出更具代表性的分子標記技術(shù)，屆時，對桑黃的分類、遺傳多樣性、系統(tǒng)進化等方面的研究都將起到巨大的推動作用。