鄭 蘭, 樸松哲, 徐 然, 王馨悅, 王藝璇, 林貞花, 楊 洋

（1. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 吉林省科技廳婦科腫瘤生物信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉133002；2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臨海 317005；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院泌尿外科，浙江 臨海 317005）

目前手術(shù)及術(shù)后放化療是治療子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma， UCEC） 的常規(guī)方案，而對(duì)于復(fù)發(fā)或進(jìn)展期UCEC 仍缺乏有效治療手段［1］。因此，進(jìn)一步探索用于UCEC 早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)記物迫在眉睫。腫瘤免疫微環(huán)境的形成是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素，是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)：UCEC 組織中可見大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，參與UCEC發(fā) 生 發(fā) 展。 有 研 究［4］報(bào) 道CD8+T 細(xì) 胞 和CD45RO T 細(xì)胞浸潤(rùn)程度高的UCEC 患者預(yù)后較好，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 （tumor-associated macrophages，TAMs） 浸 潤(rùn) 程 度 高UCEC 患 者 預(yù)后較差。闡明UCEC 中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（tumorinfiltrating immune cells， TIICs）的作用和調(diào)控機(jī)制對(duì)于UCEC 的免疫治療有重要意義［5］。然而，目前關(guān)于TIICs 在UCEC 中的研究大多局限于單個(gè)樣本或1 種免疫細(xì)胞［6-7］，無法進(jìn)行綜合性評(píng)估。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine， m6A） 修飾是mRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾的重要調(diào)控過程，在調(diào)控mRNA 剪切、定位、轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用［8］。近來研究［8-9］顯示：m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 等多種人惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)聯(lián)。最新研究［10-11］顯示：m6A 能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控。但有關(guān)m6A調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平對(duì)UCEC 腫瘤免疫浸潤(rùn)和預(yù)后影響的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究利用腫瘤基因 組 圖 譜（The Cancer Genome Atlas， TCGA）和基因表達(dá)匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）等數(shù)據(jù)庫(kù)分析m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 中的表達(dá)水平，通過腫瘤免疫評(píng)估資源（Tumor Immune Estimation Resource， TIMER）和生存分析平臺(tái)（Kaplan-Meier Plotter）等數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估m(xù)6A調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平與腫瘤免疫浸潤(rùn)和預(yù)后的關(guān)系，以期為進(jìn)一步提高UCEC 的生存率奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 選擇m6A 調(diào)節(jié)基因根據(jù)WU 等［12］的研究，納入本研究的20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因包括寫入器METTL3、 METTL14、 RBM15、 RBM15B、WTAP、ZC3H13、VIRMA （KIAA1429），擦 除器FTO、ALKBH5和閱讀器YTHDC1、YTHDC2、IGF2BP1、 IGF2BP2、 IGF2BP3 （IMP3）、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPA2B1、HNRNPC、RBMX。根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)評(píng)估這些m6A RNA 甲基化調(diào)控因子的表達(dá)與不同臨床病理特征的關(guān)系。

1.2 TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析利用UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. xebabrowser.net） 下 載GDC TCGA-UCEC 數(shù) 據(jù)，獲 取554 例UCEC 組織和52 例癌旁組織樣本的RNA 序列數(shù)據(jù)、臨床病理參數(shù)和生存期數(shù)據(jù)，排除RNA 序列信息不全以及復(fù)發(fā)腫瘤病例共24例，最終獲得547例UCEC 和35 例癌旁樣本數(shù)據(jù)，比較癌旁與UCEC組織中m6A 調(diào)節(jié)基因mRNA 表達(dá)水平。所有患者病理分級(jí)依據(jù)2009 版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC） 系統(tǒng)，按照mRNA 中位值分為高和低水平表達(dá)2 組，比較UCEC組織和癌旁組織中m6A調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，并分析m6A調(diào)節(jié)基因與UCEC患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/），以“endometrial cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，采用GEO2R 在線工具篩選相關(guān)數(shù)據(jù)集。篩選條件：①mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)集；②以UCEC 為樣本；③以癌旁或正常子宮內(nèi)膜組織為對(duì)照。本研究選擇基于GPL570 平臺(tái)的GSE17025 數(shù)據(jù)集，其中包括81 個(gè)UCEC 樣本和12 個(gè)正常子宮內(nèi)膜樣本，利用R 軟件limma 包對(duì)所有基因進(jìn)行歸一化處理并設(shè)定篩選條件為| log foldchange（FC））|＞1和校準(zhǔn)后P值＜0.05對(duì)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs） 進(jìn)行篩選，logFC＞1 和logFC＜－1 分別定義為上調(diào)基因和下調(diào)基因，利用R 軟件ggplot 包繪制火山圖。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction， PPI）分析利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www/stringdb.org）對(duì)本研究中篩選的DEGs 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ualcan. path. uab. edu） 分析核心基因在TCGA-UCEC 腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并根據(jù)患者的年齡、月經(jīng)情況、腫瘤分級(jí)和腫瘤組織學(xué)情況進(jìn)行分層分析。

1.6 TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//cistrome. dfci. harvard. edu/TIMER/） 中的基因模塊分析了UCEC 中經(jīng)篩選的m6A 調(diào)節(jié)基因與免疫浸潤(rùn)程度的關(guān)系，包括B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell， DC）。此外，利用相關(guān)模塊探討篩選m6A 調(diào)節(jié)基因與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞標(biāo)記物的相關(guān)性。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞標(biāo)記物包括CD8+ T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、TAMs、巨噬細(xì)胞（M1 和M2）、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、DC 細(xì)胞、輔助型T 細(xì)胞 （Th1、Th2、Tfh 和Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）和衰竭T 細(xì)胞 等［13-16］。另外，本研究使用腫瘤純度校正（purity adjustment）來校正P值。

1.7 基因相關(guān)性分析通過基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分 析 （Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//gepia.cancer- pku. cn/），利用腫瘤和正常組織的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因相關(guān)性分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析及繪圖通過R 3.6.0軟件和Graphpad 8.0.1 軟件實(shí)現(xiàn)。各組癌和癌旁組織配對(duì)樣本中基因表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊性，2 組間樣本均數(shù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。各組癌和癌旁組織非配對(duì)樣本中基因表達(dá)水平比較采用Welch 檢驗(yàn)。不同基因表型組間比較核心基因的表達(dá)水平不服從正態(tài)分布，以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（P25，P75） 表示，組間比較采用Wilcoxon 檢驗(yàn)；使用Kaplan-Meier 法（Log-rank 檢驗(yàn)）進(jìn)行生存分析，比較各組間總生存期（overall survival， OS）的差異。單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析用于識(shí)別影響UCEC 患者OS 的核心基因。核心基因與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性及基因間的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，0.1≤|r| ≤1.0 時(shí)定義為有相 關(guān)性［17］。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 組織和癌旁組織中的表達(dá)水平通過UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具總體比較547 例UCEC 組織和35 例癌旁組織中20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。除YTHDC2 和HNRNPC 外，大多數(shù)m6A 調(diào)節(jié)基因在腫瘤和正常樣本中表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。在GSE17025 數(shù)據(jù)集包含81 例UCEC 組織樣本與12 例正常子宮內(nèi)膜組織樣本，包含除RBMX 外其他19 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖1B）。進(jìn)一步分析GSE17025 發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，UCEC 組織中共有2 776 個(gè)差異表達(dá)基 因 （differentially expressed genes， DEGs）（log|FC|＞1，P＜0.05），上調(diào)表達(dá)2 256 個(gè)，下調(diào)表達(dá)520個(gè)，其中包括9個(gè)m6A調(diào)節(jié)基因：METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429 和YTHDC1 表達(dá)上調(diào)，RBM15、IGF2BP3、YTHDF2 和HNRNPC表達(dá)下調(diào)（圖1C）。利用UCSC Xena 下載GDC TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)，進(jìn)一步比較上述9 個(gè)基因在23 對(duì)配對(duì)UCEC 組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與癌旁組織比較，UCEC 組織中RBM15、 IGF2BP3、 YTHDC1、 YTHDF2 和HNRNPC mRNA 呈高水平表達(dá)（P＜0.05），METTL14 和WTAP呈低水平表達(dá)（P＜0.05），而METTL3 和KIAA1429 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1D。推測(cè)m6A調(diào)節(jié)基因可能參與UCEC發(fā)生發(fā)展。

2.2 m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 中相互作用及相關(guān)性分析從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索納入本研究的20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因間的相互關(guān)系并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2A），納入標(biāo)準(zhǔn)為綜合得分＞0.4，共得到20個(gè)PPI節(jié)點(diǎn)和109 個(gè)蛋白互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因之間存在著密切而復(fù)雜的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。利用R軟件中的corrplot 軟件包對(duì)上述7 個(gè)在UCEC 組織和癌旁組織中差異表達(dá)的m6A 基因進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：在UCEC 組織中除IGF2BP3 與WTAP、YTHDF2 和HNRNPC 無關(guān)聯(lián)以外，其他基因之間呈正相關(guān)關(guān)系（0.1≤r≤1.0，P＜0.05）（圖2B）。

2.3 m6A 調(diào)節(jié)基因在評(píng)估UCEC 患者預(yù)后中的價(jià)值為了評(píng)估以上7 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 預(yù)后中的價(jià)值，進(jìn)行單因素Cox 回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 個(gè)調(diào)控因子中僅IGF2BP3 與OS 有關(guān)聯(lián)，且IGF2BP3 被認(rèn)為是危險(xiǎn)因素［風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR） =1.106，95% 可信區(qū)間（confidence interval，CI）：1.019～1.202，P=0.016］（圖3A）。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示：IGF2BP3 可作為評(píng)估患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.097，95% CI：1.003～1.199，P=0.043）（圖3B）。生存曲線分析結(jié)果顯示在UCEC （n=543） 中IGF2BP3 高水平表達(dá)患者OS 較IGF2BP3 低水平表達(dá)患者縮短（P=0.022）（圖3C）。以上結(jié)果與WANG 等［9］的研究結(jié)果一致。

圖1 m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 組織中的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of m6A regulatory genes in UCEC tissue

圖2 m6A 調(diào)節(jié)基因之間相互作用關(guān)系Fig.2 Interaction relationships among m6A regulatory genes

圖3 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Relationships between IGF2BP3 mRNA expression levels and prognosis in UCEC patients

2.4 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)比較UCEC 組織（n=546）和癌 旁 組 織（n=35） 中IGF2BP3 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在UCEC 組織中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P＜0.01）（圖4A）。如圖4B 所示：1～4 期UCEC組織中IGF2BP3 表達(dá)水平均高于癌旁組織（P＜0.01），且在3 期UCEC 組織中IGF2BP3 表達(dá)水平高于1 和2 期UCEC 組織（P＜0.05）。此外，在子宮內(nèi)膜漿液性腺癌組織中IGF2BP3 表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣腺癌（P＜0.01） 和混合性癌（P＜0.05）（圖4C）；絕經(jīng)前UCEC 組織（n=447） 中IGF2BP3 表達(dá)水平高于絕經(jīng)后UCEC 組織（n=37）（P＜0.01）（圖4D）。以上結(jié)果表明IGF2BP3可能參與UCEC 演進(jìn)。此外，研究［18］證實(shí)：PTEN、CTNNB1、 TP53、 PIK3CA、 ARID1A 和KRAS在UCEC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此本研究進(jìn)一步分析了IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與上述6 個(gè)基因表型的關(guān)系，結(jié)果顯示：發(fā)生PTEN、CTNNB1 和TP53 基因突變的UCEC 組織中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平高于其野生型高（P＜0.05）（圖5）。提示IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與PTEN、CTNNB1 和TP53 基因表型有關(guān)聯(lián)。

圖4 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 患者不同臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Fig. 4 Relationships between expression level of IGF2BP3 mRNA and different clinicaopathological features in UCEC patients

圖5 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與基因表型的關(guān)系Fig.5 Relationships between expression level of IGF2BP3 mRNA and gene phenotypes

2.5 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性以往有研究［6，19］報(bào)道免疫浸潤(rùn)與UCEC 的預(yù)后有關(guān)聯(lián)。因此本研究利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析了IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與腫瘤免疫浸潤(rùn)程度的相關(guān)性， 結(jié)果顯示：IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC中CD8+T細(xì)胞（r=0.126，P＜0.05）、中性粒細(xì)胞（r=0.324，P＜0.01）、DC 細(xì)胞（r=0.120，P＜0.05）的免疫浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)關(guān)系，而與B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)程度無相關(guān)性（|r| ≤0.1，P＞0.05）。見圖6。

2.6 IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與不同類型免疫細(xì)胞標(biāo)記物的相關(guān)性本研究進(jìn)一步利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)探討了UCEC 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與不同類型免疫細(xì)胞標(biāo)記物的相關(guān)性，包括B 細(xì)胞、CD8 + T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞、Th1 細(xì) 胞、Th2 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和單核細(xì)胞標(biāo)記物（表1）。結(jié)果顯示：UCEC 中的IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與B 細(xì)胞中的CD19、M1 巨噬細(xì)胞中的IRF5、M2 巨噬細(xì)胞中的CD163、DC 細(xì)胞中的CD209、Th1 細(xì)胞中的STAT1、Th17 細(xì)胞中的STAT3 和Treg 細(xì)胞中的STAT5B 呈正相關(guān)關(guān)系（0.1≤r≤1.0，P＜0.05），該結(jié)果與腫瘤純度校正后相關(guān)性結(jié)果一致（表1）。本研究發(fā)現(xiàn)：在腫瘤純度校正后相關(guān)性結(jié)果中，大多數(shù)TAMs、M1 巨噬細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平與IGF2BP3 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（0.1≤r≤1.0，P＜0.05）（表1）。故本研究進(jìn)一步在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了UCEC 組織和正常組織中單核細(xì)胞和TAMs 標(biāo)記物CD68 和IL10、M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)記物INOS 和IRF5、Th1 細(xì)胞標(biāo)記物STAT1、Th2 細(xì)胞標(biāo)記物STAT3、Th17 細(xì)胞標(biāo)記物STAT3 及Treg 細(xì)胞標(biāo)記物STAT5B 與IGF2BP3 表達(dá)水平的關(guān)系（表2），結(jié)果與TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 腫瘤免疫浸潤(rùn)程度有關(guān)。

圖6 UCEC 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與免疫浸潤(rùn)程度的相關(guān)性Fig.6 Correlations between IGF2BP3 mRNA expression level and immune infiltration degrees in UCEC

表1 通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析UCEC 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記物的相關(guān)性Tab. 1 Correlations between IGF2BP3 mRNA expression level and biological markers of immune cells analyzed with TIMER database

續(xù)表

2.7 基于免疫細(xì)胞豐度行亞組分析IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 患者預(yù)后的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn)IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 腫瘤免疫浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)關(guān)系，且IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平高的UCEC 患者OS 短于IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平低的患者。因此推測(cè)IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平影響患者預(yù)后與免疫浸潤(rùn)程度有關(guān)聯(lián)。利用Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)，基于相關(guān)免疫細(xì)胞亞組中IGF2BP3 的表達(dá)水平對(duì)UCEC 患者進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)在B細(xì)胞低浸潤(rùn)組（HR=3.37，95%CI：1.09～10.49）、CD8+T細(xì)胞低浸潤(rùn)組（HR=2.29，95% CI：1.04～5.06）、Treg 細(xì)胞低浸潤(rùn)組（HR=2.40，95%CI：1.05～5.47）和Th2 細(xì)胞低浸潤(rùn)組（HR=10.55， 95%CI：1.29～86.47） 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平高的患者 OS 較IGF2BP3 mRNA表達(dá)水平低的患者更短（P＜0.05），但在免疫細(xì)胞高浸潤(rùn)組中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 患者OS無關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。以上結(jié)果說明在UCEC組織中IGF2BP3 mRNA表達(dá)水平影響預(yù)后可能一定程度上與腫瘤免疫浸潤(rùn)有關(guān)聯(lián)。見圖7。

3 討 論

本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了UCEC 組織和正常子宮內(nèi)膜組織中m6A 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，在差異表達(dá)的m6A 調(diào)節(jié)基因集中應(yīng)用單因素和多因素Cox 回歸分析篩選與UCEC 預(yù)后有關(guān)聯(lián)的核心基因，進(jìn)一步分析核心基因表達(dá)水平與UCEC 臨床病理指標(biāo)、預(yù)后及腫瘤免疫浸潤(rùn)的關(guān)系。UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示：本研究納入的20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因中，除了YTHDC2 和HNRNPC 外，大多數(shù)m6A 調(diào)節(jié)基因在腫瘤和正常樣本中表達(dá)存在差異，且該差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)GSE17025 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證，共鑒定出9 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因在UCEC 和正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)水平存在差異：METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、YTHDC1呈高表達(dá)，RBM15、IGF2BP3、YTHDF2和HNRNPC 呈低表達(dá)。但在23 對(duì)配對(duì)UCEC 組織及癌旁組織中，METTL3 mRNA 和KIAA1429mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UCEC 組織中METTL14 和WTAP呈低表達(dá)，而包括IGF2BP3 在內(nèi)的其余5 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因呈高表達(dá)。該結(jié)果與GSE17025 數(shù)據(jù)集分析結(jié)果不一致，考慮與樣本量及樣本選擇不同有關(guān)。GSE17025 腫瘤組納入了92 例1 期UCEC 樣本和12 例絕經(jīng)后女性子宮內(nèi)膜樣本，其中UCEC 樣本包括80 例子宮內(nèi)膜樣癌和12 例漿液性子宮內(nèi)膜癌樣本；而TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包含1～4 期UCEC 樣本及絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后UCEC （n=547） 和癌旁組織樣本（n=35）。本文作者發(fā)現(xiàn)在20 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)因子之間存在著密切而復(fù)雜的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。本研究選擇配對(duì)樣本中表達(dá)水平存在明顯差異的7 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)除IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與WTAP、YTHDF2 和HNRNPC 無相關(guān)性以外，與其他基因之間呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步評(píng)估上述7 個(gè)m6A 調(diào)節(jié)基因mRNA 表達(dá)水平與UCEC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。單因素及多因素COX 回歸分析結(jié)果提示IGF2BP3 可作為評(píng)估患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即IGF2BP3 mRNA 高表達(dá)組UCEC 患者的OS 較IGF2BP3 低表達(dá)組患者縮短。此前有學(xué)者［20-22］應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：IGF2BP3 在 人UCEC組織中呈高表達(dá)， 且IGF2BP3（IMP3）在漿液性癌中的表達(dá)高于子宮

內(nèi)膜樣腺癌，可用于二者的鑒別診斷［20，23］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)IGF2BP3 mRNA 在TCGA 非配對(duì)樣本及23 對(duì)配對(duì)樣本的UCEC 組織中均呈高表達(dá)，且在不同UCEC 組織學(xué)分型中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平存在差異，在子宮內(nèi)膜漿液性腺癌中的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜樣腺癌和混合性癌；IGF2BP3 mRNA 在3 期UCEC 組織中表達(dá)水平高于1 和2 期UCEC 組織。而且，本研究結(jié)果顯示：絕經(jīng)前UCEC 患者腫瘤組織中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平高于絕經(jīng)后UCEC患者。有研究［24］報(bào)道：IGF2BP3 在妊娠早期胎盤絨毛中的表達(dá)水平高于妊娠晚期胎盤絨毛中的表達(dá)水平，IGF2BP3 在子癇前期胎盤中的表達(dá)水平低于胎齡匹配的正常胎盤，且IGF2BP3 表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力。以上結(jié)果提示IGF2BP3 可能參與UCEC 演進(jìn)。此外，本研究結(jié)果顯示：存在PTEN、CTNNB1和TP53 基因突變的UCEC 組織中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平較其野生型上調(diào)，提示IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與PTEN、CTNNB1 和TP53 基因表型有關(guān)聯(lián)。VISSER 等［22］研究顯示：在晚期（Ⅱ-Ⅳ期）、低分化（3 級(jí)）子宮內(nèi)膜樣腺癌、非子宮內(nèi)膜樣癌組織學(xué)亞型、伴深部肌層、淋巴血管間隙侵犯和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的UCEC 組織中IMP3 表達(dá)陽性率高，且IMP3 陽性患者較IMP3 陰性患者預(yù)后更差。該結(jié)果與本研究結(jié)果一致，提示IGF2BP3 高表達(dá)與UCEC 惡性表型及不良預(yù)后有關(guān)聯(lián)，可能參與UCEC 發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制尚不清楚。

表2 利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的相關(guān)性Tab. 2 Correlations between IGF2BP3 mRNA expression level and markers of immune cells analyzed with GEPIA database

圖7 基于免疫細(xì)胞亞組分析UCEC 組織中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 患者預(yù)后的關(guān)系Fig. 7 Correlations between IGF2BP3 mRNA expression level in UCEC tissue and prognosis in patients with UCEC based on immune cell subgroups analysis

近來HAN 等［25］發(fā)現(xiàn)：m6A 修飾可影響腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，該研究發(fā)現(xiàn)了m6A 修飾參與調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)的新機(jī)制。且越來越多的研究［4，26］也支持該結(jié)論，即m6A 修飾可通過調(diào)控免疫識(shí)別、激活先天性和獲得性免疫反應(yīng)等過程對(duì)免疫浸潤(rùn)有調(diào)節(jié)作用。故推測(cè)IGF2BP3 可能與UCEC 腫瘤免疫浸潤(rùn)程度有關(guān)。本研究利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與UCEC 腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)程度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC 細(xì)胞免疫浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步在UCEC 中分析IGF2BP3 與免疫細(xì)胞標(biāo)記物的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在腫瘤純度校正后， 大多數(shù)TAMs、 M1 和M2 巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)水平與IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示IGF2BP3 在TAMs 極化中具有潛在調(diào)控作用。此外，在UCEC 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平與輔助性T 細(xì)胞（Th1、Th2 和Th17）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）標(biāo)記物呈正相關(guān)關(guān)系，提示IGF2BP3 可能參與調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能。經(jīng)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，IGF2BP3 與TAMs 標(biāo)記物（CD68 和IL10）、M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)記物（INOS 和IRF5）、M2 細(xì)胞標(biāo)記物（VSIG4）、Th1 細(xì)胞標(biāo)記物（STAT1）、Th2 細(xì)胞標(biāo)記物（STAT3）、Th17 細(xì)胞標(biāo)記物（STAT3）和Treg 細(xì)胞標(biāo)記物（STAT5B） 呈正相關(guān)關(guān)系，與TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明：IGF2BP3 可能在調(diào)節(jié)UCEC 腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)中起重要作用?；诿庖呒?xì)胞浸潤(rùn)程度和UCEC 中IGF2BP3 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果顯示：在B 細(xì)胞、CD8 +T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和Th1低浸潤(rùn)亞組中IGF2BP3 mRNA 高表達(dá)的UCEC 患者預(yù)后更差。說明IGF2BP3 mRNA 高表達(dá)在UCEC 中影響癌癥患者的預(yù)后，可能一定程度上受免疫浸潤(rùn)調(diào)節(jié)。

目前m6A 調(diào)控免疫表型的相關(guān)研究尚處于起步階段，有關(guān)IGF2BP3 與腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，但近期發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)有助于解釋IGF2BP3 與UCEC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及預(yù)后的關(guān)系。m6A 修飾是mRNA 上最常見的修飾類型，主要負(fù)責(zé)mRNA 分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。已知m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（如METTL3/14 等） 充當(dāng)m6A 書寫器（writers），去甲基化酶（如FTO 和ALKBH5）充當(dāng)擦除器（erasers），還有一系列m6A 結(jié)合蛋白（YTHDF1/2/3 和IGF2BP1/2/3 等） 作為閱讀器（readers），決定m6A 修飾的靶mRNA 轉(zhuǎn)錄本的命運(yùn)［10］。當(dāng)前主要觀點(diǎn)認(rèn)為：m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶通過調(diào)控靶基因mRNA 的m6A 修飾水平，進(jìn)一步招募不同的m6A 結(jié)合蛋白，識(shí)別并結(jié)合RNA 上的m6A 修飾位點(diǎn)，對(duì)下游靶基因產(chǎn)生不同的影響。有研究［27］顯示：在病毒感染增強(qiáng)了RNA解旋酶DDX46 與編碼抗病毒蛋白MAVS、TRAF3和TRAF6 的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合作用，導(dǎo)致ALKBH5 募集，使得上述基因轉(zhuǎn)錄本去甲基化，該去甲基化過程反過來使得上述轉(zhuǎn)錄本滯留在細(xì)胞核內(nèi)，下調(diào)其蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）反應(yīng)。說明m6A 修飾通過促進(jìn)Ⅰ型IFN 通路不同成分的核輸出進(jìn)而在增強(qiáng)抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。相反，有研究發(fā)現(xiàn)m6A 修飾抑制抗病毒反應(yīng)。IFNB 和IFNA mRNA 和驅(qū)動(dòng)Ⅰ型IFN 反應(yīng)的主要細(xì)胞因子編碼基因受m6A 修飾調(diào)控，且在METTL3 或METTL14 敲除后穩(wěn)定性增強(qiáng)，并在Ⅰ型IFN 反應(yīng)和干擾素刺激基因誘導(dǎo)后表達(dá)水平上調(diào)。METTL3 或METTL14 敲除細(xì)胞中不同病毒繁殖能力明顯受抑制［28-29］。在Treg 細(xì)胞中敲除METTL3 的小鼠因發(fā)生嚴(yán)重的自身免疫性疾病而死亡［30］；HAN 等［25］發(fā)現(xiàn)YTHDF1 敲除小鼠比野生型小鼠腫瘤抗原特異性CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答更強(qiáng)；經(jīng)典的DC 細(xì)胞中敲除YTHDF1 后增強(qiáng)了體內(nèi)腫瘤抗原的交叉呈遞作用和CD8+T 細(xì)胞的交叉激活。多個(gè)DC 溶酶體組織蛋白酶的轉(zhuǎn)錄本均存在m6A 修飾，YTHDF1 可通過結(jié)合這些轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)溶酶體組織蛋白酶在DC 中的翻譯。在小鼠腫瘤模型中程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1（programmed cell death-ligand 1， PD-L1） 阻斷劑可提高YTHDF1缺失的DC 誘導(dǎo)的CD8+T 細(xì)胞抗腫瘤能力，治療效果得到提高。YTHDF1 低表達(dá)的結(jié)腸癌樣本中T 細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高。說明m6A 修飾在調(diào)節(jié)DC 的成熟和啟動(dòng)效率過程中發(fā)揮重要作用。IGF2BP3與YTHDF1 同樣屬于m6A 結(jié)合蛋白，推測(cè)IGF2BP3 可能通過m6A 修飾通過調(diào)節(jié)RNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在UCEC 組織中IGF2BP3 mRNA呈高表達(dá)，與UCEC 中CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC 細(xì)胞免疫浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)關(guān)系，在B 細(xì)胞、CD8 +T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞和Th2 低浸潤(rùn)亞組中IGF2BP3 mRNA 高表達(dá)患者OS 較IGF2BP3 mRNA 低表達(dá)患者縮短。此外，在UCEC 中，IGF2BP3 mRNA 表達(dá)可能參與調(diào)控TAMs、Th 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞免疫反應(yīng)。IGF2BP3 mRNA 高表達(dá)促進(jìn)UCEC 的免疫浸潤(rùn)，提示UCEC 患者預(yù)后不良；IGF2BP3 可能成為判定UCEC 患者預(yù)后的分子標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。