林 瑤, 林春霖, 王 琴, 張 彬, 王少瑜, 朱廣偉

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350005；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科福建省腹部外科研究所，福建 福州 350005）

宮頸癌是婦科最常見的腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例約52.7 萬，每年死亡病例約26.1 萬，在女性惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率均位居第4 位［1］。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國家已明顯降低，而在發(fā)展中國家仍居高不下，均位居世界的第2 位［2］。在所有病理類型中，95%病例為鱗狀上皮細(xì)胞癌。盡管目前臨床對于宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌（宮頸鱗癌）的診治方法有了較多的改進(jìn)，但仍缺乏有效且穩(wěn)定可靠的診斷和預(yù)后標(biāo)志［3-4］。因此進(jìn)一步尋找宮頸鱗癌發(fā)病的分子機(jī)制并了解其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律具有重大意義。

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） 和高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫提供了多種癌癥的基因表達(dá)譜相關(guān)數(shù)據(jù)［5-6］。從數(shù)據(jù)庫中提取相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找腫瘤組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因，利用生物信息學(xué)方法分析差異基因潛在的分子功能，目前已廣泛應(yīng)用于尋找胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌等疾病發(fā)生發(fā)展的分子靶標(biāo)［7-10］，并已證明該方法切實可行。但這2 個數(shù)據(jù)庫在宮頸鱗癌研究中應(yīng)用的報道相對較少。因此，本研究利用TCGA 和GEO 2 個數(shù)據(jù)庫，使用生物信息學(xué)方法對宮頸鱗癌基因組學(xué)進(jìn)行分析，篩選出與疾病預(yù)后相關(guān)的分子，以期為宮頸鱗癌的診斷和治療提供潛在的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲得從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中下載并整理所有宮頸鱗癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，其中mRNA 表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的樣本共257 例，包括宮頸鱗癌組織255 例和正常組織2 例；宮頸鱗癌相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)共255 例，包括患者年齡、分期、生存時間和生存狀態(tài)。從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm.nih.gov/geo/）下載數(shù)據(jù)集GSE7803，提取并整理其中的10 例正常宮頸組織樣本和21 例宮頸鱗癌組織樣本數(shù)據(jù)。

1.2 TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)整理利用Perl 軟件（v5.30.0）將數(shù)據(jù)整理成行名為基因名、列名為樣品名的矩陣，分別獲得正常組織和宮頸鱗癌組織mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)TCGA_data 和GEO_data，以及獲得臨床數(shù)據(jù)TCGA_clin_data。

1.3 差異基因分析利用R 語言軟件（v3.6.3）的“edgR”和“l(fā)imma”程序包進(jìn)行數(shù)據(jù)矯正和差異基因分析篩選。其中篩選閾值均為：︳log2FC（fold change，F(xiàn)C） ︳＞1 且P＜0.05。并且利用“VennDiagram”程序包繪制韋恩圖，得到TCGA和GEO 數(shù)據(jù)集共有的差異表達(dá)基因（differential expression genes， DEGs）。

1.4 熱圖和火山圖的繪制利用R 語言的“heatmap”和“ggplot2”程序包分析DEGs 進(jìn)行可視化，繪制熱圖和火山圖。

1.5 基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因與基因百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析對大量基因進(jìn)行GO 富集分析是生物信息學(xué)重要的方法之一，可以從生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cell composition， CC）和分子功能（molecular function， MF）3 個方面對基因進(jìn)行注釋分析。同時應(yīng)用KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析，得到癌癥發(fā)展過程中的重要通路。采用R 語言的“enrichplot”程序包對DEGs 進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路富集分析，得出富集結(jié)果，并對結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)繪制STRING 在線網(wǎng)站（https：//string-db.org/）可以預(yù)測并構(gòu)建各個基因表達(dá)的蛋白之相互作用的關(guān)系，同時進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)繪制，得到相應(yīng)的基因相互作用文件，利用CytoScape 軟件（v3.7.2）進(jìn)行可視化并得到樞紐基因。

1.7 樞紐基因與生存的關(guān)系從臨床數(shù)據(jù)中提取所有患者的生存信息，包括總體生存時間（overall survival，OS）和生存狀態(tài)，并且與基因表達(dá)譜進(jìn)行匹配。利用R語言軟件的“survminer” 和“miner”程序包，以P＜0.05 作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本篩選，對所得到的樞紐基因進(jìn)行生存分析，明確其與宮頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.8 預(yù)后相關(guān)基因在組織中的表達(dá)人類蛋白表達(dá)圖集（The Human Protein Atlas， THPA）（https：//www.proteinatlas.org/） 可以提供超過24 000 種人蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)圖譜。利用該數(shù)據(jù)庫，查找與生存相關(guān)的樞紐基因在正常和宮頸癌組織中的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 的提取對于TCGA 數(shù)據(jù)庫的宮頸鱗癌中255 個腫瘤組織樣本和2 個正常組織樣本進(jìn)行匹配分析，根據(jù)條件進(jìn)行篩選，得到2 612 個DEGs，其中上調(diào)基因1 326 個，下調(diào)基因1 286 個。對數(shù)據(jù)集GSE7803 中21 個宮頸鱗癌腫瘤樣本和10 個正常組織樣本進(jìn)行匹配，根據(jù)條件進(jìn)行篩選，得到619 個差異基因，其中上調(diào)基因330 個，下調(diào)基因289 個（圖1）。取2 個數(shù)據(jù)集中共同的DEGs，得到226 個DEGs，其中上調(diào)基因170個，下調(diào)56個。見圖2。

圖1 TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫各自篩選DEGs 的熱圖和火山圖Fig.1 Heat maps and volcano plots of DEGs in TCGA and GEO databases.

2.2 DEGs 的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析DEGs 通過GO 富集分析其生物學(xué)的BP、CC和MF 功能。在BP 中，DEGs 主要富集在細(xì)胞核分裂、細(xì)胞器分裂、有絲分裂和DNA 復(fù)制方面；在CC 中，DEGs 主要富集在染色體區(qū)域、有絲分裂紡錘體和中間體方面；在MF 中，DEGs 主要富集在DNA 酶活性催化、DNA 解旋酶活性和ATP 酶活性方面。而在KEGG 通路富集分析中，DEGs 主要富集于細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、p53 信號通路和堿基修復(fù)等。見圖3。

圖2 TCGA 數(shù)據(jù)庫和GSE7803 數(shù)據(jù)集中DEGs 的韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of overlapping DEGs in TCGA database and GSE7803 dataset

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析通過STRING 數(shù)據(jù)庫對DEGs 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化，選用Cytohubba 的Degree 方法篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中連接程度前30 位的樞紐基因，分別為CDK1、 CCNB1、 TOP2A、 MCM2、 CDC45、AURKA、 KIF11、 TTK、 CDC20、 NCAPG、MAD2L1、 FEN1、 MCM10、 RFC4、 RRM2、MCM6、 DTL、 NDC80、 ASPM、 KIF20A、MELK、 DLGAP5、 KIF23、 PCNA、 TPX2、MCM5、RACGAP1、PRC1、SMC4 和NUSAP1。見圖4。

2.4 樞紐基因的生存分析為篩選出與宮頸鱗癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物，對30 個樞紐基因進(jìn)行生存分析，最后得到4 個與宮頸鱗癌生存相關(guān)的基因，即微小染色體蛋白（minichromosome maintenance proteins， MCMs） 家 族 中 的MCM2、 MCM5、MCM6 和染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4（minichromosome maintenance of chromosome 4， SMC4），其 中MCM2、MCM5 和MCM6 在腫瘤組織中高表達(dá)，并且高表達(dá)MCM2、MCM5 和MCM6 宮頸癌患者具有較高的總體生存率（P＜0.05）；SMC4 在腫瘤組織中高表達(dá)，但高表達(dá)SMC4 宮頸鱗癌患者總體生存率較低（P＜0.05）。見圖5。

圖3 DEGs 功能富集可視化結(jié)果Fig. 3 Visualization results of DEGs function enrichment

2.5 預(yù)后相關(guān)基因在組織中的表達(dá)情況利用THPA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗證生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的4 個基因MCM2、MCM5、MCM6 和SMC4 在組織中的表達(dá)情況。與正常組織比較，腫瘤組織中MCM2、MCM5、MCM6 和SMC4 基 因 的 抗 體 染色均呈強(qiáng)陽性。見圖6。

3 討 論

圖4 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因Fig.4 PPI network of DEGs and hub genes

宮頸癌是女性生殖器官最常見的腫瘤之一，并且以鱗癌最為常見。因?qū)m頸鱗癌發(fā)病初期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致患者早期診斷困難，多數(shù)患者就診時已是晚期，治療難度大［11-12］，且有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率［13］。 基于宮頸鱗癌的這些特點，對其深入研究，尋找潛在的靶向分子，并應(yīng)用于疾病的早期診斷與治療，對改善患者的預(yù)后尤其重要。目前研究［14-16］表明：基因的異常表達(dá)引起細(xì)胞的無序增殖與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)聯(lián)。因此，從分子生物學(xué)方面對宮頸鱗癌進(jìn)行深入研究，可以為該疾病的診斷與治療提供新的思路。本研究通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫和GEO 數(shù)據(jù)庫的挖掘，發(fā)現(xiàn)4 個與宮頸鱗癌患者生存相關(guān)的基因，即MCM2、MCM5、MCM6 和SCM4。其 中MCM2、MCM5和MCM6 均 屬 于MCMs 家 族。研 究［17-18］顯 示：MCMs 家族是一類在真核生物中廣泛存在、具有高度保守性的蛋白質(zhì)，其家族成員之間常形成多聚體，構(gòu)成DNA 復(fù)制的復(fù)合物，從而結(jié)合DNA 并促使其發(fā)生復(fù)制的過程。MCMs 蛋白的mRNA 水平會隨著細(xì)胞周期的不同而發(fā)生改變，在G1期向S 期轉(zhuǎn)換時其表達(dá)水平最高，而當(dāng)細(xì)胞到衰老和死亡時表達(dá)水平最低，這與本文作者在GO 分析方面的結(jié)果相符，即MCM2、MCM5 和MCM6 富集于DNA復(fù)制相關(guān)的功能上，并且KEGG 分析也證實了這些基因與細(xì)胞周期和細(xì)胞復(fù)制通路有關(guān)聯(lián)。

研究［19-23］顯示：與正常組織比較，MCM2、MCM5 和MCM6 蛋白在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌等腫瘤組織中均為過表達(dá)，其與腫瘤復(fù)發(fā)以及腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖有明顯關(guān)聯(lián)，是判斷腫瘤惡性程度以及評估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。MCM5和MCM6 作為MCMs 家族的成員，能與核染色質(zhì)結(jié)合，調(diào)控DNA 的復(fù)制，與細(xì)胞增殖緊密相關(guān)，從而直接反應(yīng)細(xì)胞的增殖水平［24-25］，在正常組織中均可以被檢測到，但在腫瘤組織中表達(dá)水平更高。因此，若這2 個基因能夠應(yīng)用于宮頸鱗癌的篩查，通過刮取宮頸組織樣本，檢測其表達(dá)水平，從而區(qū)分腫瘤組織與正常組織，手法簡單，有推廣意義。也有研究［26］表明：MCM2 具有核定位功能，MCM2形成的多聚體可通過該功能準(zhǔn)確進(jìn)入細(xì)胞核，從而參與DNA 的復(fù)制。此外，若MCM2 多聚體未進(jìn)入細(xì)胞核而存在于胞漿之中，可與gp70 結(jié)合形成gp70-MCM2 復(fù)合物，從而阻斷MCM2 與DNA 依賴蛋白酶的相互作用，使得P53 凋亡通路被激活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。由此可見，MCM2 作為抑癌或者促癌基因可能取決于其在細(xì)胞核和胞漿中含量。本研究結(jié)果顯示：MCM2 在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)MCM2 的宮頸鱗癌患者預(yù)后更佳，其機(jī)制可能為MCM2 在宮頸鱗癌細(xì)胞的胞漿中含量較高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖［27］。目前有關(guān)MCMs 家族蛋白與宮頸鱗癌關(guān)系的研究較少。本研究通過分析大數(shù)據(jù)并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MCM2、MCM5 和MCM6 基因在宮頸鱗癌中高表達(dá)，且高表達(dá)上述幾種基因的宮頸鱗癌患者有較高的生存率，此結(jié)論與學(xué)者在其他癌癥中的研究相反，本文作者推測在宮頸鱗癌細(xì)胞中上調(diào)的MCMs 基因，除了在細(xì)胞復(fù)制中起啟動作用，還可以修復(fù)損壞DNA 堿基序列，也可以作用于不同通路發(fā)揮不同的作用，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而提高患者的生存率［28］。同時可以從TPHA 數(shù)據(jù)庫尋找相應(yīng)蛋白的免疫組織化學(xué)結(jié)果，證實MCMs蛋白在腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)。由此從mRNA 水平和蛋白水平分別證實了MCM2、MCM5 和MCM6 在腫瘤組織中高表達(dá)。

圖5 宮頸鱗癌患者生存相關(guān)4 個樞紐基因的生存曲線Fig. 5 Survival curves of 4 hub genes associated with survival of patients with cervical squamous cell carcinoma

圖6 篩選的與預(yù)后相關(guān)基因在正常組織和宮頸鱗癌組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×40)Fig.6 Results of immunohistochemistry staining of hub genes related to survival in normal and cervical squamous cell carcinoma tissues(×40)

作為染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白家族（structural maintenance of chromosomes， SMCs） 的 成 員 之一， SMC4 主要參與染色體的聚合與分離。ZHANG 等［29］在 肺 癌 研 究 中 發(fā) 現(xiàn)：SMC4 在 肺 癌組織中高表達(dá)，敲除該基因后可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。ZHOU 等［30］在研究SMC4 在肝癌中作用時發(fā)現(xiàn)該基因在腫瘤組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)與腫瘤大小和分化程度等明顯相關(guān)，抑制該基因的表達(dá)也可降低肝癌細(xì)胞的增殖。本文作者通過整合數(shù)據(jù)庫資料發(fā)現(xiàn)：SMC4 在宮頸鱗癌組織中高表達(dá)，并且高表達(dá)SMC4 患者的預(yù)后較低表達(dá)患者的預(yù)后差。目前對于SMC4 基因的功能和作用途徑的研究較少，尤其是在宮頸癌中表達(dá)未見相關(guān)報道。

綜上所述，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫，結(jié)合THPA 數(shù)據(jù)庫的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，對宮頸鱗癌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MCM2、MCM5、MCM6 和SMC4 可以作為宮頸鱗癌的分子標(biāo)志物，其與患者的預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果為今后宮頸鱗癌的研究提供了新的靶點和方向。