蘭曉卉, 楊 琦, 鄒穎剛, 林 楊, 崔滿華

（1. 吉林大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130041；2. 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130033）

作為全球第2 位最常見的婦科腫瘤，宮頸腫瘤發(fā)病率高，時刻威脅著女性健康［1］。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）感染是宮頸最主要的致病因素，HPV 檢測可盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變，降低侵襲性癌的發(fā)生率和死亡率。因不同基因型HPV 感染者的腫瘤進展風險不同，美國食品藥品監(jiān)督管理局建議所有HPV16/18 型陽性女性直接轉(zhuǎn)診至陰道鏡檢查，并聯(lián)合細胞學檢查對其余12 種HPV 分型陽性的女性進行分流［2-3］。但是，液基薄層細胞學檢查（thinprep cytologic test， TCT） 敏感性低，診斷結(jié)果受主觀因素影響大，觀察者間診斷一致性低［4-5］。采用TCT 對HPV 陽性感染者進行分流盡管提高了檢查的準確性，但仍會導致60%以上轉(zhuǎn)診至陰道鏡的患者接受不必要的陰道鏡檢查［6-7］。p16INK4a是細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK） 抑制劑，在HPV E7 蛋白致癌級聯(lián)反應的作用下過表達［8-10］。研究［11-14］已證實：p16INK4a免疫細胞化學染色診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變2 級及以上（all cervical intraepithelial neoplasia 2 or worse， CIN2+）的靈敏度和特異度高，對其深入研究有助于提高宮頸癌篩查的準確性。但目前甚少有研究探討p16INK4a免疫細胞化學染色對不同基因型HPV 感染者的分流效能。因此，本研究將宮頸癌篩查結(jié)果異常需行陰道鏡下宮頸活檢的患者作為研究對象，對宮頸脫落細胞行p16INK4a免疫細胞化學染色。跟蹤記錄HPV DNA 檢測、TCT、p16INK4a免疫細胞化學染色和宮頸活檢病理診斷的結(jié)果。與TCT 比較，分析不同分流方案對HPV 陽性者中CIN2+的診斷效能，以期提出更積極有效的分流方案，為臨床工作提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機選取2020 年7—8 月就診于吉林大學第二醫(yī)院婦產(chǎn)科、因?qū)m頸癌篩查結(jié)果異常需行陰道鏡下宮頸活檢的106 例患者作為研究對象。研究對象的年齡為22～72 歲，平均年齡（39.71±11.23）歲。納入標準：TCT（意義不明的非典型鱗狀細胞ASCUS及以上）和HPV DNA檢測（14種高危型至少1 種陽性）至少一項異常。排除標準：TCT 和HPV DNA 檢測均無異常，有宮頸手術(shù)史和有子宮切除史、有骨盆放療史和處于妊娠狀態(tài)。對研究對象的宮頸脫落細胞行p16INK4a免疫細胞化學染色，跟蹤記錄HPV DNA 檢測、細胞學檢查、p16INK4a免疫細胞化學染色和宮頸活檢病理結(jié)果。本研究經(jīng)吉林大學第二醫(yī)院倫理委員會批準（審批文號：2020070），所有參與者均被告知詳細研究細節(jié)并簽署知情同意書。為保護患者隱私，所有數(shù)據(jù)均已經(jīng)過處理。

1.2 樣本采集和保存將宮頸刷置于研究對象宮頸管內(nèi)，刷取宮頸脫落細胞，旋轉(zhuǎn)刷頭10 圈，停留15 s 后將刷頭取出，放入細胞保存液中。將樣本置于4 ℃恒溫冰箱中保存。

1.3 主要試劑和儀器p16INK4a免疫顯色試劑盒、封閉液、一抗溶液、二抗溶液、抗體稀釋液、DBA 顯色液、DBA 稀釋液、磷酸緩沖液、過氧化氫（H2O2） 溶液、蘇木素染液、酒精、二甲苯、樹膠和細胞保存液等均購自廣州江元醫(yī)療科技有限公司。JY-3200 液基薄層細胞自動制片機（廣州江元醫(yī)療科技有限公司），光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.4 p16INK4a 免疫細胞化學染色和結(jié)果判定標準采用JY-3200 液基薄層細胞自動制片機統(tǒng)一制片；磷酸緩沖液沖洗玻片3 次，每次2 min；每張玻片上滴加3 滴H2O2，室溫下孵育15 min 后用磷酸緩沖液沖洗；每張玻片上滴加60 μL 封閉液，室溫下孵育15 min；每張玻片上滴加2 滴一抗溶液，32 ℃恒溫水浴50 min 后用磷酸緩沖液沖洗；每張玻片上滴加2 滴二抗溶液，32 ℃恒溫水浴50 min 后用磷酸緩沖液沖洗；每張玻片上滴加2 滴DAB 顯色液，室溫下染色10 min 后用自來水沖洗2 次；蘇木素染液復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。在光學顯微鏡下評估染色情況，以細胞核和（或） 細胞質(zhì)染呈棕黃色為陽性細胞，計數(shù)陽性細胞數(shù)。染色陽性判斷標準：以陽性細胞數(shù)≥5 個為陽性， 陽性細胞數(shù)＜5 個為陰性。

1.5 檢測指標和分流方案以宮頸活檢組織病理結(jié)果為金標準，對p16INK4a免疫細胞化學染色的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷符合率及約登指數(shù)進行分析。與TCT 比較，評估p16INK4a免疫細胞化學染色對HPV 16/18 型陽性者和其余12 種HPV 陽性者的分流價值。用4 種方案對HPV 陽性者進行分流，方案A：p16INK4a免疫細胞化學染色對所有HPV 陽性者進行分流；方案B：TCT 對所有HPV 陽性者進行分流；方案C：HPV 16/18 型陽性者直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，p16INK4a免疫細胞化學染色對其余12 種HPV 陽性者進行分流；方案D：HPV 16/18型陽性者直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，TCT 對其余12 種HPV 陽性者進行分流，評估不同方案對CIN2+的診斷效能。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷符合率和約登指數(shù)以百分率表示，率之間比較采用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.01。

2 結(jié) 果

2.1 p16INK4a免疫細胞化學染色結(jié)果與宮頸活檢病理診斷結(jié)果的關(guān)系在106 例患者中，p16INK4a免疫細胞化學染色陽性者49 例（46.22%），經(jīng)活檢證實其中有正常/炎癥4 例（11.11%），CIN1 級9 例（30.00%），CIN2 級13 例（81.25%），CIN3 級17 例（94.44%），宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma， CSCC）者6例（100.00%）。經(jīng)過趨勢性χ2檢驗后發(fā)現(xiàn)：p16INK4a免疫細胞化學染色陽性率隨著宮頸病變等級的增加而升高（χ2=48.903，P＜0.01）。結(jié)果再經(jīng)χ2檢驗兩兩比較提示：CIN2 組p16INK4a免疫細胞化學染色陽性 率 高 于CIN1 組 （χ2=10.984，P=0.001）；CIN2 組與CIN3 組p16INK4a免疫細胞化學染色陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.434，P=0.510）。將研究對象分為≤CIN1 （CIN1-） 組和≥CIN2 （CIN2+） 組，CIN1-組患者p16INK4a免疫細胞化學染色陽性率明顯低于CIN2+組（χ2=49.521，P＜0.01）。見表1。隨著宮頸病變級別增加，細胞異型性增加，細胞著色程度逐漸加深，過表達p16INK4a的宮頸細胞數(shù)目增加。見圖1。

表1 p16INK4a免疫細胞化學染色結(jié)果與宮頸活檢病理診斷結(jié)果的關(guān)系Tab. 1 Relationship between results of p16INK4a immunocytochemical staining and pathological diagnosis of cervical biopsy

圖1 不同宮頸組織的p16INK4a免疫細胞化學染色結(jié)果Fig.1 Results of p16INK4a immunocytochemical staining of different cervical tissues

2.2 p16INK4a免疫細胞化學染色對CIN2+的診斷效能以宮頸活檢組織病理結(jié)果作為金標準，106 例患者p16INK4a免疫細胞化學染色診斷CIN2+的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷符合率和約登指數(shù)分別為 90.00%、 80.30%、73.47%、92.98%、83.96%和70.30%。

2.3 p16INK4a免疫細胞化學染色對HPV 16/18 型陽性者中CIN2+的診斷效能HPV 16/18 型陽性的63 例患者，以病理活檢結(jié)果作為金標準，p16INK4a免疫細胞化學染色和TCT 診斷CIN2+的靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)：p16INK4a免疫細胞化學染色與TCT 診斷HPV 16/18 型陽性者中CIN2+的靈敏度（χ2=1.908，P=0.167）和特異度（χ2=0.277，P=0.599）比較差異均無統(tǒng)計學意義。

2.4 p16INK4a 免疫細胞化學染色對其余12 種HPV分型陽性者中CIN2+的診斷效能其余12 種HPV分型陽性的36 例患者，以病理活檢結(jié)果作為金標準，p16INK4a免疫細胞化學染色和TCT 診斷CIN2+的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)：p16INK4a免疫細胞化學染色與TCT 診斷其余12 種HPV 分型陽性者中CIN2+的靈敏度比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＜0.01，P=1.000）；其特異度高于TCT，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=23.625，P＜0.01）。p16INK4a免疫細胞化學染色診斷其余12 種HPV 分型陽性者中CIN2+的診斷符合率和約登指數(shù)分別為88.89%和76.79%，明顯高于TCT。

表2 TCT 和p16INK4a免疫細胞化學染色診斷HPV 16/18 型陽性者中CIN2+的效能Tab. 2 Efficiencies of TCT and p16INK4a immunocytochemical staining in diagnosis of CIN2+ in HPV16/18 positive women(n=63，η/%）

表3 TCT 和p16INK4a免疫細胞化學染色診斷其余12 種HPV 分型陽性者中CIN2+的效能Tab. 3 Efficiencies of TCT and p16INK4a immunocytochemical staining in diagnosis of CIN2+ in women positive for 12 other HPV genotypes (n=36，η/%）

2.5 4 種不同的分流方案對HPV 分型陽性者中CIN2+的診斷效能99 例患者的HPV DNA 檢測陽性，用4 種方案對HPV 陽性者進行分流，評估不同方案對CIN2+的診斷效能。4 種方案診斷HPV 陽性者中CIN2+的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)：方案A 與方案B 診斷HPV 陽性者中CIN2+的靈敏度比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.308，P=0.129），方案A 的特異度高于方案B（χ2=14.101，P＜0.01）；方案C 與方案D 診斷HPV 陽性者中CIN2+的靈敏度比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＜0.01，P=1.000），方案C 的特異度高于方案D（χ2=13.807，P＜0.01）；方案A與方案C診斷HPV 陽性者中CIN2+的靈敏度比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.855，P=0.355），方案A 的特異度高于方案C（χ2=16.806，P＜0.01）。方案A 診 斷HPV 陽性者中CIN2+的診斷符合率和約登指數(shù)分別為82.83%和68.07%，均高于方案B、C 和D。

表4 4 種分流方案診斷HPV 陽性者中CIN2+的效能Tab.4 Efficiencies of 4 kinds of triage schemes in diagnosis of CIN2+ in HPV positive women （n=99）

3 討 論

作為全球第2 位最常見的婦科腫瘤，宮頸癌發(fā)病率高，時刻威脅著女性健康［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)，宮頸癌年新發(fā)病例約52.8 萬，年死亡病例約26.6 萬，其中發(fā)展中國家占85%［15］。國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：我國每年新增宮頸癌病例約9.89 萬，年死亡病例約3.05 萬［16］。大數(shù)據(jù)顯示：宮頸癌的發(fā)病率呈年輕化趨勢［17］。早期發(fā)現(xiàn)和治療宮頸癌前病變可有效中斷腫瘤進展，降低侵襲性癌的發(fā)生率和死亡率。

目前，宮頸癌篩查的主要方法是HPV 檢測和宮頸細胞學檢查。HPV 是宮頸惡性腫瘤最主要的致病因素。據(jù)統(tǒng)計，80%的婦女在生命的某個階段會感染HPV，但這些感染大多是短暫的，90%的HPV 感染可以在2 年內(nèi)被人體免疫清除。部分HPV 感染會發(fā)展為持續(xù)性病毒感染，HPV 將病毒基因整合到宿主基因組中，逐步進展為宮頸惡性腫瘤［18-19］。HPV基因分型有200多種，14 種 基 因 型被歸類為高致癌風險的HPV （HR-HPV），其中HPV 16/18 型的致癌風險最高，其余12 種HPV 基因分型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68 型）次之［20-21］。HPV檢測對高級別CIN 的靈敏度高，但特異度低，不能確定HPV 的感染階段，這一缺陷使得HPV 檢測單獨應用于宮頸癌篩查的價值有限［6］。美國食品藥品監(jiān)督管理局建議所有HPV16/18 型陽性女性直接轉(zhuǎn)診至陰道鏡檢查，并聯(lián)合TCT 對其余12 種HPV 分型陽性的女性進行分流［2-3］。但TCT 是根據(jù)宮頸脫落細胞的形態(tài)學改變進行診斷，在腫瘤轉(zhuǎn)化的早期階段，閱片者很難將病變細胞與化生、衰老和萎縮等與腫瘤轉(zhuǎn)化無關(guān)的細胞區(qū)分開來，常出現(xiàn)不明意義的非典型鱗狀上皮細胞 （atypical squamous cell of undetermined significance， ASCUS） 等不明確的診斷，觀察者間診斷一致性低，檢查結(jié)果受主觀因素的影響大［5］。研 究［6-7］顯示：將HPV檢測與細胞學聯(lián)合進行宮頸癌篩查，會導致60%～80%轉(zhuǎn)診至陰道鏡的患者接受無意義的創(chuàng)傷性檢查?？梢?，對HPV 陽性患者進行精準分流，降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，提高宮頸癌篩查準確性是目前亟待解決的問題。

p16INK4a是CDK抑制劑，可減緩細胞從DNA 合成前期（G1期）到細胞分裂期（S 期）的進程，在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子E2F 可與未磷酸化的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein， pRB）結(jié)合。細胞周期蛋白D 依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK 4/6）復合物可使pRB 磷酸化，與E2F分離。游離的E2F 進入細胞核使靶向基因轉(zhuǎn)錄，加速細胞從G1期向S 期轉(zhuǎn)化，促進細胞DNA 合成。 p16INK4a可滅活CDK 4/6，抑制pRB 磷酸化，E2F 與未磷酸化的pRB 相結(jié)合，游離E2F 減少，致使細胞周期停滯。HPV 持續(xù)感染會使病毒基因整合到宿主基因組中，產(chǎn)生的致癌蛋白E7 會與E2F 競爭結(jié)合未磷酸化的pRB，導致游離E2F 增多，從而激活細胞周期。功能失活的pRB 通過負反饋調(diào)節(jié)機制，使p16INK4a出現(xiàn)過表達。在同一細胞中，E7 蛋白使pRB 介導的細胞周期調(diào)控功能失活，盡管p16INK4a出現(xiàn)過表達，表達E7 蛋白的細胞仍會繼續(xù)增殖。隨著時間推移，大量p16INK4a積聚在細胞核與細胞質(zhì)中，可通過免疫染色檢測出來［8-10］。從HPV 導致腫瘤轉(zhuǎn)化的分子機制層面來看，p16INK4a是一項可靠的腫瘤生物監(jiān)測標志物，在宮頸癌篩查方面發(fā)展前景廣闊，p16INK4a免疫細胞化學染色的應用有望改善宮頸癌篩查現(xiàn)狀。CAROZZI 等［11］研究表明：宮頸病變的惡性程度與p16INK4a的過度表達密切相關(guān)，正常情況下宮頸組織不表達p16INK4a，隨著病變惡性程度的增加，p16INK4a的表達量增加。NASIOUTZIKI等［12］研究指出：與HPV 檢測比較，p16INK4a免疫細胞化學染色對高級別CIN 的特異度更高，而兩者的敏感度相似。WU 等［13］研究顯示：p16INK4a免疫細胞化學染色比宮頸TCT 更為客觀，診斷效能更高。PEETERS 等［14］推薦將p16INK4a免疫細胞化學染色應用于HPV 陽性患者的分流。

本研究中p16INK4a免疫細胞化學染色的陽性率隨著宮頸病變程度的增加而增加，CIN-組患者p16INK4a免疫細胞化學染色陽性率明顯低于CIN2+組，表明宮頸脫落細胞中p16INK4a的表達量與宮頸組織病變程度密切相關(guān)，與CAROZZI 等［11］的研究結(jié)果一致。隨著宮頸病變級別的增加，細胞異型性增加，細胞著色程度逐漸加深，過表達p16INK4a的宮頸細胞數(shù)目也在增加。在TCT 結(jié)果為ASCUS 和低度鱗狀上皮內(nèi)病變 （low-grade squamous intraepithelial lesion， LSIL）的患者中，p16INK4a免疫細胞化學染色的陽性比例為45.28%，不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells－cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H） 的染色陽性比例為75.00%，高度鱗狀上皮內(nèi)病變（highgrade squamous intraepithelial lesion， HSIL） 的 染色陽性比例為100%，TSOUMPOU 等［22］的研究也得出了相似的結(jié)果。

在本研究中，HPV DNA 檢測在各級別宮頸病變中均表現(xiàn)出很高的陽性率，不能準確反映宮頸的病變程度，與MEYER 等[23]得出的結(jié)論相似。63 例患者的宮頸活檢組織為CIN1 級及以下,TCT 的假陽性率高達56.06%（37/63），其中36.5%（23/63）的患者檢查結(jié)果為ASCUS，19.7%（13/63）的患者檢查 結(jié) 果 為LSIL，1 例CIN1 患 者 的TCT 結(jié) 果 為HSIL。TCT 檢查結(jié)果受檢查者主觀因素的影響，假陽性率高，TCT 對HPV 陽性患者的分流價值有限，與WRIGHT 等[5]得出的結(jié)論相似。與HPV 檢測比較，p16INK4a免疫細胞化學染色的陽性率隨著宮頸病變程度的增加而升高，可準確反映宮頸病變嚴重程度。與依賴形態(tài)學進行診斷的TCT 比較，p16INK4a免疫細胞化學染色僅依靠染色結(jié)果即可得出診斷結(jié)果。p16INK4a免疫細胞化學染色對高級別CIN 的靈敏度和特異度分別為90.00%和80.30%。綜上所述，p16INK4a免疫細胞化學染色對高級別CIN的 診 斷 效 能 高。NASIOUTZIKI 等[12]和WU 等[13]的研究成果也得出了相似的結(jié)論。

本研究探討了p16INK4a免疫細胞化學染色對不同分型HPV 陽性患者的分流價值。在99 例HPV陽性患者中，方案D 會導致58.89% （53/90） 的轉(zhuǎn)診至陰道鏡的患者接受無意義的創(chuàng)傷性檢查，方案C 可使這一比例降至47.95%（35/73），方案A可使這一比例降至8.33%（4/48）。與現(xiàn)有細胞學分流HPV 陽性患者比較，不論HPV 16/18 型陽性者是否直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，采用p16INK4a免疫細胞化學染色分流HPV 陽性感染者可降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，提高宮頸癌篩查的準確性，與CAROZZI 等［11］的研究成果相似。在統(tǒng)計學上，方案A雖優(yōu)于方案C，但本研究并未進行長期跟蹤隨訪，HPV 16/18 型陽性但p16INK4a免疫細胞化學染色陰性患者的CIN2+累積發(fā)病風險不明確。董麗［24］研究表明：在14 種高危型HPV 感染人群中，HPV 16 型感染者的發(fā)病風險最高，5 年CIN2+累積發(fā)病率高達43.1%?？紤]到HPV 16 型感染者的疾病進展風險高，與方案A 比較，方案C 可能對HPV 陽性感染者的分流價值更大。CUZICK 等［25］研究結(jié)果顯示：HPV 陽性且p16INK4a免疫細胞化學染色、TCT 結(jié)果均為陰性的患者進展為CIN2+和CIN3+的發(fā)病率極低，分別為0.2%和0.3%，3年后的發(fā)病率分別為2.9%和0.9%。但該項研究并未對不同分型HPV 陽性者的疾病進展風險進行分析。要明確HPV 16/18 型陽性且p16INK4a免疫細胞化學染色陰性者的臨床處理方案，仍需大樣本分析及長期跟蹤隨訪。

本研究將HPV 陽性者分為HPV 16/18 型陽性和其余12 種HPV 分型陽性2 組患者進行了探討，王悅等［26］研究指出：對HPV31 型和58 型陽性者進行分層管理也可能具有一定的價值。近年來有研究［27］顯示：p16INK4a的表達量與HPV 負荷量呈正相關(guān)關(guān)系，病毒負荷量越大，p16INK4a表達量增加，病變級別越高。將病毒負荷量與p16INK4a細胞學免疫染色相結(jié)合用于宮頸癌篩查也是今后值得探討的研究思路［28-29］。將p16INK4a與其他腫瘤生物監(jiān)測標志物聯(lián)合應用于宮頸細胞免疫化學染色，也是當前研究的主要趨勢。p16INK4a與Ki-67 聯(lián)合檢測應用于高 級 別CIN 篩查是近幾年的研究熱點［30-31］。BERGERON 等［32］研究表明：與單獨應用p16INK4a免疫細胞染色比較，p16INK4a/Ki-67雙染在宮頸癌篩查中有著更高的臨床應用價值。但從經(jīng)濟普適的角度考慮，p16INK4a單染仍是目前改善宮頸癌篩查現(xiàn)狀的主流趨勢。

綜上所述，p16INK4a免疫細胞化學染色對高級別CIN 有著很高的靈敏度和特異度，對HPV 陽性患者的分流效能高，可作為宮頸癌篩查的重要檢測手段。與現(xiàn)有細胞學分流方法比較，采用p16INK4a免疫細胞化學染色對HPV 陽性感染者進行分流有助于降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，提高宮頸癌篩查準確性。p16INK4a免疫細胞化學染色在HPV 分流及宮頸癌篩查方面的應用前景廣闊。