韋 偉, 軒 妍, 黃曉燕

（1. 海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科，海南 ?？?570000；2. 海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心兒科，海南 ?？?570000）

支氣管肺發(fā)育不良 （bronchopulmonary dysplasia，BPD）常見于長(zhǎng)期氧療和機(jī)械通氣的早產(chǎn)兒，嚴(yán)重影響患兒預(yù)后及長(zhǎng)期生存質(zhì)量［1］。研究［2］表明：在胎齡＜32 周早產(chǎn)兒中，BPD 發(fā)生率為12%～32%，胎齡越小，BPD 發(fā)生率越高。而高氧可通過(guò)多種途徑引起肺損傷，導(dǎo)致肺泡及微血管發(fā)育不良，促進(jìn)BPD 發(fā)生。西地那非是一種選擇性的磷酸二酯酶5 （phosphodiesterase 5，PDE-5）抑制劑，能通過(guò)增加肺血管中環(huán)磷酸鳥苷（cyclicguanosine monophosphate， cGMP） 的濃度使內(nèi)源性的一氧化氮（nitric oxide，NO）增多，從而起到擴(kuò)張血管的作用［3］。有研究［4］顯示：西地那非能促進(jìn)肺泡生長(zhǎng)和改善大鼠BPD 相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓，還有研究［5］表明：西地那非能通過(guò)增強(qiáng)新生血管介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1） 改善BPD 癥狀。目前有關(guān)西地那非對(duì)BPD 作用的研究主要集中在肺動(dòng)脈高壓方面，而對(duì)肺組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α/2α（hypoxia-inducible factor-1α/2α，HIF-1α/2α） -VEGF通路影響的研究尚未見報(bào)道。因此本研究制備大鼠BPD 模型，并給予西地那非治療，觀察西地那非是否對(duì)BPD 動(dòng)物模型的肺發(fā)育有改善效果以及對(duì)HIF-1α/2α -VEGF 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討西地那非對(duì)BPD 的作用方式和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器出生12 h 內(nèi)的Sprague-Dawley （SD）大鼠60 只，雌雄不限，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （湘） 2015-0016。西地那非（批號(hào)：Y002476，輝瑞制藥有限公司） ，免疫組織化學(xué)SABC、DAB 辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒、RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑試劑（北京中杉生物公司），兔抗鼠HIF-1/2α、VEGF 和CD31 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。電泳儀（北京六一生物科技有限公司），熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 大鼠BPD 模型建立在孕鼠羊膜內(nèi)注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（0.5 mg） 后2.0～2.5 d，大鼠自然分娩，將60 只幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（注射生理鹽水，室內(nèi)空氣暴露）、模型組（腹腔注射LPS，85%氧暴露）和治療組（注射LPS，85%氧暴露，每日腹腔注射100 μg·g－1西地那非），每組20 只。分別在高氧暴露7 和14 d 時(shí)處死幼鼠。對(duì)照組幼鼠在室內(nèi)空氣中持續(xù)飼養(yǎng)。本研究方案經(jīng)本中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 HE 染色觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)取右肺下葉，采用4%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋，制成厚度約5 μm 的切片，行HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)石蠟組織切片常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶10 min；微波修復(fù)抗原，然后封閉；加入CD31 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP 耦聯(lián)的二抗（1∶200），37 ℃孵化30 min，PBS 緩 沖 液 洗 滌，DAB 顯 色［6］，在 每 張 免 疫 組 織化學(xué)切片中隨機(jī)抽取3 個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)呈棕黃色的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠肺組織中HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)情況石蠟組織切片，標(biāo)本脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5～10 min，PBS緩沖液浸泡，抗原修復(fù)，封閉，室溫孵育10 min，一抗4 ℃過(guò)夜，熒光二抗37 ℃孵育30 min，DAPI 核染，顯色劑顯色15 min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察［7］。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)取大鼠右側(cè)肺組織50 mg，加入RIPA 裂解液中制備組織勻漿，4 ℃離心取上清（蛋白提取液），分裝后－20 ℃保存。BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，樣品分裝、貯存于－80 ℃中備用。每孔加入50 μg 蛋白質(zhì)樣品，10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，封閉后加入1∶2 000 稀釋的二抗，室溫孵育1 h，漂洗后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，顯影［8］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠肺泡大小均勻，肺間隔較薄，結(jié)構(gòu)規(guī)則，微血管發(fā)育好；模型組大鼠肺泡毛細(xì)血管以及肺泡數(shù)量明顯減少，形成肺大泡，微血管發(fā)育差，形態(tài)異常，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，部分萎陷，符合BPD 的病理改變；治療組大鼠肺泡發(fā)育好轉(zhuǎn)，肺泡間隔變厚不明顯，肺泡毛細(xì)血管豐富，未見明顯擴(kuò)張及融合。見圖1。

2.2 各組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組大鼠肺組織中CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05）。見圖2 和3。

2.3 各組大鼠肺組織中HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)情況高氧暴露第1 和2 周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)量降低；與模型組比較，治療組大鼠肺組織中HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)量升高。見圖4。

2.4 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)情況高氧暴露第1 周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)量降低。與模型組比較，治療組大鼠肺組織中VEGF和CD31蛋白表達(dá)量升高，HIF-1α 和HIF-2α 蛋 白表達(dá)量變化不明顯。

高氧暴露第2 周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)量降低；與模型組比較，治療組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α蛋白表達(dá)量升高。見圖5。

3 討 論

BPD 是由于早產(chǎn)兒肺發(fā)育不成熟等多種因素共同作用下產(chǎn)生的肺泡和肺內(nèi)血管發(fā)育受阻，對(duì)早產(chǎn)兒的存活率及生存質(zhì)量產(chǎn)生影響，其嚴(yán)重程度與患兒長(zhǎng)期的肺功能及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)［9-10］。當(dāng)患有BPD 的嬰兒出現(xiàn)呼吸窘迫時(shí)，需要通過(guò)機(jī)械通氣提供氧氣來(lái)緩解缺氧癥狀，但圍產(chǎn)期的氧療會(huì)增加BPD 的風(fēng)險(xiǎn)并加重其癥狀［11］。

圖2 各組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（免疫組織化學(xué)，×100）Fig.2 Number of CD31 positive cells in lung tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry,×100）

圖3 各組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Fig. 3 Number of CD31 positive cells in lung tissue of rats in various groups

西地那非是一種高選擇性磷酸二酯酶抑制藥，通過(guò)增強(qiáng) 一氧化氮-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸鳥苷 （NO-sGC-cGMP） 信號(hào)通路，發(fā)揮其治療作用。研究［12］表明：西地那非具有擴(kuò)張心血管系統(tǒng)、降低肺動(dòng)脈高壓、治療繼發(fā)于慢性腎衰竭的勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED） 以及其他繼發(fā)性ED 等作用。但目前有關(guān)西地那非對(duì)BPD 治療作用的研究較少，因此本文作者在孕鼠羊膜腔注射LPS 和全身暴露于高氧狀態(tài)的基礎(chǔ)上建立BPD大鼠模型，利用該模型研究西地那非對(duì)BPD 的影響。

HE 染色觀察結(jié)果顯示：模型組大鼠肺泡數(shù)量明顯減少，形成肺大泡，呈現(xiàn)過(guò)度充氣表現(xiàn)，肺泡毛細(xì)血管明顯減少，符合BPD 的病理改變，表明建模成功，提示高氧治療可能導(dǎo)致新生大鼠肺泡和毛細(xì)血管數(shù)量減少、肺泡發(fā)育受阻，這些因素可能在BPD 發(fā)病機(jī)制中起重要作用；經(jīng)西地那非治療后新生大鼠肺泡發(fā)育好轉(zhuǎn)，肺泡毛細(xì)血管豐富，證實(shí)西地那非可能通過(guò)促進(jìn)肺泡毛細(xì)血管的發(fā)育，對(duì)抗高氧對(duì)新生大鼠肺組織生長(zhǎng)發(fā)育的干擾作用。

圖4 不同時(shí)間各組大鼠肺組織中HIF-1α 和HIF-2α 表達(dá)情況（免疫熒光，×400）Fig. 4 Expressions of HIF-1 α and HIF-2 α proteins in lung tissue of rats in various groups at different time（Immunofluorescence,×400）

圖5 各組大鼠肺組織中VEGF、CD31、HIF-1α 和HIF-2α蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of VEGF,CD31, HIF-1α and HIF-2α proteins in lung tissue of rats in various groups

CD31 又稱為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子1（platelet endothelial cell adhension molecule-1，PECAM-1），參與血管新生過(guò)程，其表達(dá)水平升高，代表血管新生活躍［13］。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，而與模型組比較，治療組大鼠肺組織中CD31 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，這說(shuō)明西地那非能增加BPD 肺組織中新生血管數(shù)，調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)肺微血管發(fā)育。

作為低氧誘導(dǎo)因子 （hypoxia inducible factors， HIFs）家族成員，HIF-1 和HIF-2 均為氧敏感的轉(zhuǎn)錄激活因子，在缺氧誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是參與缺氧反應(yīng)的主要因子［14-15］。HIF 由α 亞基和β 亞基組成，α 亞基是調(diào)節(jié)HIF-1 和HIF-2 活性的功能亞單位［16］。肺臟為機(jī)體的主要供氧器官，對(duì)氧濃度的變化極為敏感，本研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組新生小鼠肺組織中已有HIF-1α/2α 的表達(dá)，這說(shuō)明HIF-1α 和HIF-2α 可能調(diào)控肺的發(fā)育。HIFs為VEGF 誘導(dǎo)因子，與低氧反應(yīng)元件（hypxiaresponsive element，HRE）結(jié)合，能激活VEGF基因轉(zhuǎn)錄［17-18］。VEGF 是血管生成促進(jìn)因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，維持血管正常狀態(tài)和完整性、增加血管通透性的作用［19-20］。免疫熒光染色和Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果均表明：高氧暴露第1 周或第2 周時(shí)，模型組大鼠肺組織中VEGF、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低，這提示高氧對(duì)新生大鼠肺組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起到干擾作用，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α/2α-VEGF 信號(hào)通路有關(guān)。而經(jīng)西地那非治療后新生大鼠肺組織中HIF-1α、HIF-12α 和VEGF 蛋白表達(dá)量較模型組升高，說(shuō)明西地那非能上調(diào)HIF-1α/2α-VEGF 信號(hào)通路，從而促進(jìn)肺微血管及肺泡發(fā)育、改善肺泡通氣。這也可能是西地那非通過(guò)抑制磷酸二酯酶，通過(guò)特異性抑制PDE-5 活性，增加肺血管中cGMP濃度，擴(kuò)張肺血管，使肺泡發(fā)育得到改善的原因。

綜上所述，西地那非可改善高氧所致的肺泡發(fā)育受阻，上調(diào)VEGF、HIF-1α 和HIF-2α 蛋白表達(dá)，對(duì)新生大鼠BPD 有一定治療作用，本研究結(jié)果為臨床治療BPD 提供了新的分子靶點(diǎn)和思路。