馬臻杰, 馬 蘭, 賈 珍

（1. 青海大學附屬醫(yī)院麻醉科,青海 西寧 810001；2. 青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心,青海 西寧 810001）

機體受到創(chuàng)傷后會產生強烈的應激反應，導致相關炎癥因子的過度釋放，進而引發(fā)炎癥反應綜合征，目前認為這是導致創(chuàng)傷后器官受損及死亡的主要原因［1-2］。腹腔神經叢是人體中最大的自主神經叢，是由內臟感覺神經、內臟交感神經和副交感神經相互交織成的網狀結構，對腹腔中各臟器功能起調節(jié)作用［3］。腹腔神經叢可抑制術后疼痛感的發(fā)生，減少細胞因子釋放，減輕機體應激反應，并使機體內炎癥因子水平降低，改善機體損傷程度［4］。研究［5］顯示：腹腔神經叢阻滯可用于治療晚期胰腺癌、晚期肝癌或上腹部晚期腫瘤由于腹腔神經叢壓迫引起的頑固性疼痛，且療效確切，但關于腹腔神經叢阻滯對肝切除術后的應激反應及免疫炎性作用的研究較少。因此，本研究觀察行腹腔神經叢阻滯肝部分切除術后大鼠的應激反應和免疫炎癥情況，并進一步探討其作用機制，為提高術后恢復及預后效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF 級健康SD雄性大鼠40 只，6～8 周齡，體質量250～300 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004。所有大鼠均自由進食和飲水，室內溫度保持為（25±1）℃，相對濕度為（55±10）%，光照條件為正常晝夜節(jié)律。利多卡因（純度≥99%，北京市永康藥業(yè)有限公司，國藥準字：H11020558，規(guī)格：2 mL，40 mg，10 支），皮質酮（corticosterone，CORT）檢測試劑盒（深圳市科潤達生物工程有限公司，貨號：RE52211），促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）檢測試劑盒（上海超研生物科技有限公司，貨號：CEA836Ca），去甲腎上腺素（noradrenaline，NE） 檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，貨 號： xy-30075）， 腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α） 檢測試劑盒、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒（上海恒遠生化試劑有限公司，貨號：000004），TRIzol 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-13433-ML），BCA 蛋白試劑盒（貨號：SK1070） 和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（貨號：DRR041A）（美國Pierce 公司），兔抗鼠糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）（貨號：Ab183127）、Toll 樣 受 體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）mRNA（一抗）（貨號：Ab13867）和辣根酶標記山羊抗兔IgG（二抗）（貨號：Ab125900）（美國Abcam 公司）。促凝管和肝素抗凝管（北京百奧萊博科技有限公司），9600 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）儀（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），SAF-680T 酶標儀（上海巴玖實業(yè)有限公司），810 型凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學儀器有限公司）。

1.2 大鼠肝部分切除術模型制備參照文獻［6］進行大鼠肝部分切除術模型復制：于大鼠腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉，將麻醉后未蘇醒大鼠固定于手術臺上，自劍突下緣取上腹正中縱行切長度約為3 cm，用剪刀切開皮膚、皮下組織及腹膜，進入腹腔后，以絲線牽拉擴大切口，使肝臟暴露，用棉簽和鑷子探查肝臟位置，用剪子剪斷肝臟左葉周圍韌帶，使肝左外葉充分游離后，用棉簽將其輕輕擠出原位，肝臟暴露良好的條件下，用絲線將左葉根部結扎后，用剪刀切除左外葉，之后以生理鹽水沖洗腹腔，絲線連續(xù)縫合腹腔。大鼠術后蘇醒且存活時間超過24 h 說明造模成功，本實驗過程中共4 只大鼠死亡，16 只造模成功。

1.3 實驗動物分組和干預措施40 只SD 大鼠隨機選取10 只作為正常組，10 只作為阻滯劑對照組，剩余20 只大鼠用于制備肝部分切除術模型，取造模成功16 只大鼠隨機分為模型組和模型+阻滯劑組，每組8 只。于術畢關腹前，模型+阻滯劑組大鼠給予腹腔神經叢雙側（隔肌頂至腎上極腹主動脈兩旁腹膜后的結締組織內） 注射0.5% 利多卡因2 mL，阻滯劑對照組大鼠給予腹腔神經叢雙側注射0.5%利多卡因2 mL，正常組和模型組大鼠給予腹腔神經叢雙側注射等量生理鹽水。給藥12 h 后進行后續(xù)實驗操作。

1.4 組織取材和外周血單個核細胞分離取干預完成后各組大鼠8 只，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉（30 mg·kg－1），經下腔靜脈取血4 mL，2 mL 置入促凝管，3 000 r·min－1離心5 min，離心半徑為10 cm，取上清，置于－70 ℃保存；剩余2 mL 放入肝素抗凝管，參照文獻［7］ 采用Ficoll 法分離收集外周血單個核細胞：外周血中加入淋巴細胞分離液，2 000 r·min－1離心20 min，離心半徑為10 cm，分層后取中間單個核細胞層，后加入5×PBS 緩沖液，1 000 r·min－1離心5 min，離心半徑為10 cm，棄上清，得到外周血單個核細胞，在無血清培養(yǎng)液中4 ℃保存。

1.5 各組大鼠血清中CORT、ACTH、NE、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平檢測取－70 ℃保存的血清，酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測大鼠血清中CORT、ACTH、NE、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，具體步驟參照試劑盒說明書，檢測波長450 nm 處的吸光度（A）值，計算血清中各因子水平。細胞因子水平=（待測樣品A 值/標準物A 值）×標準物濃度×稀釋倍數，單位為ng·L－1。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 mRNA 表達水平取4 ℃保存的外周血單個核細胞，細胞中總RNA 提取利用TRIzol試劑盒，經逆轉錄獲取cDNA 模版。之后按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書設定反應體系，并利用qPCR 法進行擴增反應，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，設置循環(huán)35 次。以β-actin 作為內參基因，以2－△△Ct法計算各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 mRNA 相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 蛋白表達水平取4 ℃保存的外周血單個核細胞，加入100 μL 細胞裂解液置于冰上裂解，4 ℃，12 000 r·min－1離心10 min，離心半徑為10 cm，之后取上清，采用BCA 蛋白試劑盒測定蛋白濃度，測定完成后蛋白至沸水中10 min使其變性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉法進行轉膜，轉膜完成后將膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h，TBST 緩沖液清洗3 次，之后加入1∶1 000的一抗稀釋液，4 ℃過夜，TBST緩沖液清洗3 次，后加入1∶3 000 的二抗稀釋液，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液清洗3 次，顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄，以β-actin 作為內參條帶，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠血清中CORT、ACTH、NE、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，外周血單個核細胞中GR 和TLR4 mRNA 及蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中CORT、ACTH 和NE 水平與正常組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠血 清 中CORT、 ACTH和NE水平升高（P＜0.05）；與阻滯劑對照組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠血清中CORT、ACTH 和NE 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠血清中CORT、 ACTH 和NE水平降低（P＜0.05）；正常組和阻滯劑對照組大鼠血清中CORT、ACTH 和NE 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中CORT、ACTH 和NE 水平Tab.2 Levels of serum CORT, ACTH and NE of rats in various groups [±s,ρB/(ng·L-1)]

表2 各組大鼠血清中CORT、ACTH 和NE 水平Tab.2 Levels of serum CORT, ACTH and NE of rats in various groups [±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with blocker control group；#P＜0.05 compared with model group.

Group Normal Blocker control Model Model+blocker n 10 10 8 8 FP NE 215.32±30.25 205.14±29.32 316.78±31.25*△259.36±26.98*△#21.545＜0.01 CORT 81.56±9.15 80.49±8.95 115.68±11.65*△98.31±10.25*△#24.330＜0.01 ACTH 69.14±7.45 68.95±7.11 102.44±12.33*△81.69±11.25*△#23.623＜0.01

2.2 各組大鼠血清 中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水 平

與正常組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平升高（P＜0.05）；與阻滯劑對照組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低（P＜0.05）；正常組和阻滯劑對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 mRNA 表達水平與正常組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR mRNA表達水平降低（P＜0.05），TLR4 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與阻滯劑對照組比較，模型組和模型+ 阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR mRNA表達水平降低（P＜0.05），TLR4 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR mRNA 表達水平升高（P＜0.05），TLR4 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；正常組和阻滯劑對照組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 mRNA 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.3 Levels of serum TNF-α, IL-1β, and IL-6 of rats in various groups [±s,ρB/(ng·L-1)]

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.3 Levels of serum TNF-α, IL-1β, and IL-6 of rats in various groups [±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with blocker control group；#P＜0.05 compared with model group.

Group Normal Blocker control Model Model+blocker n 10 10 8 8 FP IL-6 19.55±2.66 21.98±3.65 59.45±7.12*△34.66±4.56*△#134.603＜0.01 TNF-α 64.01±7.12 66.03±7.09 94.25±10.12*△79.32±9.68*△#23.951＜0.01 IL-1β 16.32±2.31 18.12±2.58 55.33±6.65*△32.25±4.21*△#165.885＜0.01

表4 各組大鼠外周血單個核細胞GR 和TLR4 mRNA 表達水平Tab. 4 Expression levels of GR and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of rats in various groups (±s）

表4 各組大鼠外周血單個核細胞GR 和TLR4 mRNA 表達水平Tab. 4 Expression levels of GR and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of rats in various groups (±s）

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with blocker control group；#P＜0.05 compared with model group.

TLR4 mRNA 0.31±0.04 0.34±0.05 0.88±0.11*△0.59±0.07*△#125.559＜0.01 Group Normal Blocker control Model Model+blocker n 10 10 8 8 FP GR mRNA 0.98±0.11 0.97±0.13 0.48±0.06*△0.71±0.09*△#46.526＜0.01

2.4 各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 蛋白表達水平與正常組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與阻滯劑對照組比較，模型組和模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR 蛋白表達水平升高（P＜0.05），TLR4 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；正常組和阻滯劑對照組大鼠外周血單個核細胞中GR和TLR4 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1 和表5。

圖1 各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 蛋白表達電泳圖Fig. 1 Electrophoregram of expressions of GR and TLR4 proteins in peripheral blood mononuclear cells of rats in various groups

3 討 論

外科手術和麻醉均可使機體產生應激反應，導致應激性激素釋放，嚴重影響患者的術后恢復效果及預后，尋找有效的措施抑制術后應激反應和免疫炎性反應尤為重要［7-8］。腹腔神經叢阻滯技術可阻斷交感神經與機體感覺的傳導，起到減輕術后機體損傷的作用，探討腹腔神經叢阻滯在術后應激反應及免疫炎性的作用，對預后及術后恢復有重要意義［4，9-10］。

術后過度應激反應主要表現為交感神經-腎上腺髓質興奮和下丘腦-垂體-腎上腺軸激活，交感神經-腎上腺髓質興奮可引起機體NE 分泌增加，下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活可促進CORT 和ACTH 分泌的增加，因此，CORT、ACTH 和NE 水平可反映機體術后應激程度［11］。孫小琳等［12］研究發(fā)現：麻醉后大鼠血清中CORT 和ACTH 水平升高，降低血清中CORT 及ACTH 水平可有效減輕大鼠麻醉中應激反應。耿艷霞等［13］研究發(fā)現：電針治療能夠降低血清中CORT 和ACTH 水平，緩解胃腸外科術后應激反應。機體受到損傷可啟動內部防御系統(tǒng)，產生應激反應的同時釋放大量炎癥因子。研究［14］顯示：腹腔神經叢阻滯可降低手術創(chuàng)傷后TNF-α 和IL-1β 的釋放，進而減輕應激反應程度。馬耀宏［15］研究發(fā)現：腹腔神經叢阻滯聯(lián)合烏司他丁可在一定程度上減輕大鼠肝部分切除術后的炎癥反應，降低TNF-ɑ 和IL-1β 水平。本研究結果顯示：與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠血清中CORT、ACTH、NE、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低，提示腹腔神經叢阻滯能夠緩解肝部分切除術后應激反應，減輕炎癥反應。

表5 各組大鼠外周血單個核細胞中GR 和TLR4 蛋白表達水平Tab. 5 Expression levels of GR and TLR4 proteins in peripheral blood mononuclear cells of rats in various groups(±s）

*P＜0.05 compared with normal group；△P＜0.05 compared with blocker control group；#P＜0.05 compared with model group.

TLR4 0.31±0.04 0.34±0.05 0.75±0.11*△0.58±0.07*△#79.702＜0.01 Group Normal Blocker control Model Model+blocker n 10 10 8 8 FP GR 0.98±0.11 0.96±0.13 0.60±0.10*△0.76±0.11*△#23.904＜0.01

糖皮質激素（glucocorticoid，GC） 效應是調節(jié)機體應激反應的關鍵因素，GR 是發(fā)揮GC 效應的主要蛋白，可間接反映機體應激反應程度［16］。研究［17］顯示：機體遭遇嚴重創(chuàng)傷后，發(fā)生應激反應導致GR 蛋白表達水平降低，促進GR 蛋白表達可減輕應激反應。GR 除參與機體的應激反應外，還能直接或間接地抑制多種細胞因子及炎癥因子的釋放和生成。研究［18］顯示：GC 和GR 復合物是體內主要的抗炎因子，對細胞內炎癥介質起關鍵的阻斷作用。TLR4 是一種跨膜蛋白免疫模式識別受體，可識別入侵病原體，進而誘導炎癥因子的產生［19］。LV 等［20］研究發(fā)現：可通過抑制TLR4 通路降低肝部分切除術后的炎癥反應程度，而降低炎癥反應程度有助于肝臟的再生與功能恢復。有研究［21-23］顯示：在肺損傷大鼠中TLR4 蛋白表達升高，導致炎癥因子水平升高。本研究結果顯示：與模型組比較，模型+阻滯劑組大鼠外周血單個核細胞中GR mRNA 和蛋白表達水平升高，TLR4 mRNA 及蛋白表達水平降低，提示腹腔神經叢阻滯減輕大鼠肝部分切除術后應激反應及炎性反應，可能是通過上調GR 表達，抑制TLR4 通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，神經叢阻滯可減輕大鼠肝部分切除術后應激反應及免疫炎性反應，其可能是通過上調GR 表達、下調TLR4 表達發(fā)揮作用。本研究結果可為臨床上降低術后應激反應及炎癥反應提供理論依據。