徐保振, 武美娟, 胡秀紅, 王 濤, 高玉偉

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)一科，河北 石家莊 050001；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是指由多種原因引起的腎功能下降和腎實(shí)質(zhì)損害的一類(lèi)腎臟疾病，其病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為是腎小球和腎小管間質(zhì)發(fā)生炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎臟纖維化［1］。血管內(nèi)皮損傷是參與腎間質(zhì)纖維化形成的主要因素之一，研究［2-3］表明：血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素-1（endothelin-1， ET-1）、 一 氧 化 氮（nitric oxide，NO） 和血管緊張素Ⅱ（angiotensin，Ang Ⅱ）對(duì)CKD 的發(fā)生發(fā)展起重要影響。 雷公藤多苷（multiglycoside of tripterygium wilfordii， GTW）是中藥雷公藤的有效成分，具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［4-5］。研究［6］表明：GTW能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)腎損傷修復(fù)，改善腎功能，臨床上廣泛應(yīng)用于腎臟疾病治療。目前有研究［7］發(fā)現(xiàn)：GTW 可明顯改善早期糖尿病腎病患者的血管內(nèi)皮功能，并調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群平衡，但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)GTW 改善CKD 血管內(nèi)皮功能和抗炎作用的機(jī)制研究。本研究采用腺嘌呤誘導(dǎo)CKD大鼠模型，觀察GTW 對(duì)CKD 大鼠血管內(nèi)皮指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步探討GTW 對(duì)CKD 血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)雄性SD大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （冀） 2015-0064，飼養(yǎng)室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)1 周。雷公藤多苷片由浙江得恩德制藥股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020422；腺嘌呤購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司；ET-1、NO 和Ang Ⅱ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究 所；腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化 生 長(zhǎng) 因 子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。AU2700 型全自動(dòng)生化分析儀和CKX31 倒置式生物顯微鏡（日本Olympus 公司），YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），RM2255 全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型建立60 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組和低、中及高劑量GWT 組，每組12 只。采用參考文獻(xiàn)［8］ 方法建立CKD 大鼠模型，除對(duì)照組外其余各組大鼠灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg·kg－1），連續(xù)給藥4 周，對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。第5 周開(kāi)始隔天灌胃給予2.5%腺嘌呤混懸液（200 mg·kg－1） 維持病程進(jìn)展，同時(shí)低、中和高劑量GTW 組大鼠給予3、6 和9 mg·kg－1GTW，給藥劑量按照成人給藥劑量根據(jù)人和動(dòng)物表面積換算法計(jì)算，連續(xù)給藥4 周。

1.3 各組大鼠血清中尿素氮（blood usea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，Scr）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3 000 r·min－1離 心10 min 后 取 上 清，取50 μL 上樣，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中BUN 和Scr 水平，記錄檢測(cè)結(jié)果，BUN 單位為mmol·L－1，Scr 單位為μmol·L－1。

1.4 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠血清中ET-1、NO、Ang Ⅱ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平取上述大鼠血清，采用ELISA 法測(cè)定ET-1、NO、Ang Ⅱ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行：試劑盒使用前室溫平衡20 min，加入樣本稀釋液100 μL，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和血清100 μL，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，37 ℃孵育2 h，棄去液體，洗滌3 次，加入底物溶液200 μL，室溫避光孵育20 min，加入終止液50 μL，混勻，靜置2 min，采用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A 值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本A 值在該曲線上計(jì)算出相應(yīng)ET-1、NO、AngⅡ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平。

1.5 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)觀察大鼠采血結(jié)束后，摘取大鼠雙側(cè)腎臟，采用4%多聚甲醛固定24 h，采用不同濃度梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），分別進(jìn)行HE 和Masson 染色。HE 染色觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)變化。Masson 染色后隨機(jī)選取6 個(gè)200 倍視野，通 過(guò)Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算膠原纖維占整體視野面積的比例，以此表示腎臟纖維化程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠血清BUN、Scr、ET-1、NO、Ang Ⅱ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水 平 以 及腎組織纖維化程度均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中BUN 和Scr 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中BUN 和Scr 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量GTW 組大鼠血清中BUN 和Scr 水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量GTW 組比較，中和高劑量GTW 組大鼠血清中BUN 和Scr 水平明顯升高（P＜0.05）；與中劑量GTW 組比較，高劑量GTW 組大鼠血清中BUN 和Scr 水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中BUN 和Scr 水平Tab. 1 Levels of BUN and Scr in serum of rats in various groups (n=12,±s)

表1 各組大鼠血清中BUN 和Scr 水平Tab. 1 Levels of BUN and Scr in serum of rats in various groups (n=12,±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of GTW group；○P＜0.05 compared with medium dose of GTW group.

Group Control Model GTW Low dose Medium dose High dose BUN[cB/(mmol·L－1)]5.42±0.84 42.30±11.23*Scr[cB/(μmol·L－1)]14.25±3.82 32.39±4.33*27.20±1.98△24.01±2.70△#17.21±2.19△#○34.52±5.20△29.61±4.88△#22.31±5.07△#○

2.2 各組大鼠血清中ET-1、NO 和Ang Ⅱ水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ET-1 和Ang Ⅱ明顯升高（P＜0.05），NO 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量GTW 組大鼠血清中ET-1 和Ang Ⅱ水平明顯降低（P＜0.05），NO 水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量GTW 組比較，中和高劑量GTW 組大鼠血清中ET-1 和Ang Ⅱ水平明顯降低（P＜0.05），NO水平明顯升高（P＜0.05）；中和高劑量GTW 組大鼠血清中ET-1、NO 和Ang Ⅱ水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中ET-1、NO 和Ang Ⅱ水平Tab.2 Levels of ET-1, NO and Ang Ⅱin serum of rats in various groups [n=12,±s,cB/（μmol·L－1)]

表2 各組大鼠血清中ET-1、NO 和Ang Ⅱ水平Tab.2 Levels of ET-1, NO and Ang Ⅱin serum of rats in various groups [n=12,±s,cB/（μmol·L－1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of GTW group.

Group Control Model GTW Low dose Medium dose High dose ET-1 35.26±7.51 60.34±8.99*NO 38.50±6.02 57.61±7.59*Ang Ⅱ155.25±20.50 354.21±82.47*274.56±42.39△215.79±33.51△#193.44±26.81△#53.80±7.22△45.21±8.03△#42.60±5.24△#50.91±6.31△45.02±6.56△#43.87±6.06△#

2.3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量GTW 組大鼠血清中TNF-α、 IL-6 和TGF-β1 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05）；與低劑量GTW 組比較，中和高劑量GTW組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平明顯降低（P＜0.05）；與中劑量GTW 組比較，高劑量GTW 組 大 鼠 血 清TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水 平 明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平Tab.3 Levels of TNF-α, IL-6 and TGF-β1 in serum of rats in various groups (n=12,±s)

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平Tab.3 Levels of TNF-α, IL-6 and TGF-β1 in serum of rats in various groups (n=12,±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of GTW group；○P＜0.05 compared with medium dose of GTW group.

Group Control Model GTW Low dose Medium dose High dose TNF-α[ρB/ (ng·L－1)]45.26±5.01 165.31±12.89*IL-6[ρB/ (μg·L－1)]90.50±10.51 173.44±20.20*TGF-β1[ρB/ (μg·L－1)]2.47±0.22 3.38±0.36*2.91±0.25△2.77±0.24△#2.60±0.20△#○107.83±11.37△78.96±10.51△#62.50±8.26△#○158.99±16.89△124.31±15.31△#105.26±12.26△#○

2.4 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠腎組織中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯病理?yè)p傷。模型組大鼠腎組織腎小球和腎小管出現(xiàn)水腫，球囊粘連，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。低、中和高劑量GTW 組大鼠腎組織均有不同程度水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度較模型組輕。見(jiàn)圖1。

2.5 各組大鼠腎組織纖維化程度Masson 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠腎組織中腎小球和腎小管毛細(xì)血管周?chē)猩倭克{(lán)色膠原染色；模型組大鼠腎組織可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維增生；隨著GTW 劑量增加，低、中和高劑量GTW 組大鼠腎組織中藍(lán)色膠原染色逐漸減少。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織纖維化程度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量GTW 組大鼠腎組織纖維化程度明顯減輕（P＜0.05）；與低劑量GTW 組比較，中和高劑量GTW 組大鼠腎組織纖維化程度明顯減輕（P＜0.05）；與中劑量GTW 組比較，高劑量GTW 組大鼠腎組織纖維化程度明顯減輕（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表4。

3 討 論

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of kidney tissue of CKD rats in various groups(HE,×200)

圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)（Masson，×200）Fig.2 Pathomorphology of kidney tissue of rats in various groups (Masson，×200)

近年來(lái)CKD 在我國(guó)患病率高達(dá)10%，且呈不斷上升趨勢(shì)，但針對(duì)該疾病的有效治療率普遍較低［9］。目前對(duì)CKD 確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確，既往認(rèn)為其發(fā)病主要與腎臟纖維化有關(guān)［10］。因此，抑制腎間質(zhì)纖維化，阻斷腎組織纖維化進(jìn)展，對(duì)臨床治療CKD 有重要的意義。研究［11-12］表明：血管內(nèi)皮損傷與間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，血管內(nèi)皮活性物質(zhì)ET-1 和NO 水平變化能夠反映血管內(nèi)皮損傷程度。ET-1 是由內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的生物活性肽，具有血管收縮作用，并且能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。當(dāng)腎臟功能受損時(shí)，腎間質(zhì)中ET-1 水平升高，引起強(qiáng)烈的血管收縮，降低血流量［13］。叢玉璽等［14］發(fā)現(xiàn)：CKD 患者血清中ET-1 水平明顯高于正常水平。王玉潔等［15］發(fā)現(xiàn)：ET-1 能反映患者血管內(nèi)皮損傷的程度，其血清水平與腎臟疾病惡化程度有相關(guān)性。AngⅡ的釋放可通過(guò)刺激ET-1 形成，使血管收縮作用進(jìn)一步加強(qiáng)［16］。NO 由左旋精氨酸經(jīng)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS） 代謝產(chǎn)生，是常見(jiàn)的調(diào)控血管平滑肌收縮的因子，具有明顯的舒張血管作用，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）存在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，維持血管基本的NO 生成，改善腎臟血液循環(huán)［17］。NO 通過(guò)擴(kuò)張腎血管，維持正常腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率，抑制血小板聚集而改善微循環(huán)，此外，NO 能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制系膜細(xì)胞增生的方式，有效改善腎間質(zhì)纖維化，從而起到保護(hù)腎臟的作用［18］。王勇等［19］發(fā)現(xiàn)：CKD患者血清NO 水平明顯降低。TNF-α、IL-6 和TGF-β1 是纖維化主要調(diào)節(jié)因子，主要通過(guò)激活成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞纖維化［20-22］。

表4 各組大鼠腎組織纖維化程度Tab.4 Degrees of renal fibrosis of rats in various groups(n=12，±s,η/%)

表4 各組大鼠腎組織纖維化程度Tab.4 Degrees of renal fibrosis of rats in various groups(n=12，±s,η/%)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of GTW group；○P＜0.05 compared with medium dose of GTW group.

Group Control Model GTW Low dose Medium dose High dose Degree of renal fibrosis 3.07±0.24 39.20±6.53*30.89±5.26△25.71±5.33△#12.40±4.57△#○

GTW 是從生藥衛(wèi)矛科植物雷公藤的根莖中減毒純化提取的一類(lèi)脂溶性混合物，在臨床上廣泛應(yīng)用，具有明顯的抗炎作用，能夠減少患者尿蛋白、延緩CKD 進(jìn)展，對(duì)多種腎臟疾病具有顯著療效［23］。本研究結(jié)果顯示：低、中和高劑量GTW 均能夠升高CKD 模型大鼠血清中BUN 和Scr 水平，與HONG 等［24］研究結(jié)果一致。本研究中HE 和Masson 染色結(jié)果顯示：不同劑量GTW 均能夠減輕腎組織損傷程度和減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕腎組織纖維化程度。低、中和高劑量GTW 組大鼠血清中ET-1 和AngⅡ水平明顯低于模型組，NO 水平明顯高于模型組，說(shuō)明GTW 對(duì)內(nèi)皮功能損傷具有顯著的保護(hù)作用；低、中和高劑量GTW 組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和TGF-β1 水平均明顯降低，說(shuō)明GTW 能夠抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并呈劑量依賴性。

綜上所述，GTW 通過(guò)下調(diào)ET-1 和AngⅡ水平，上調(diào)NO 水平，改善內(nèi)皮功能，并降低TNF-α、IL-6 和TGF-β1 等炎性因子水平，對(duì)CKD 引起的血管內(nèi)皮損傷起到改善作用。