黃 果, 王佑權, 陳 娟

（1. 南華大學附屬第二醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，湖南 衡陽 421001；2. 南華大學附屬第二醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是導致女性惡性腫瘤死亡的主要原因［1］。隨著現(xiàn)代乳腺檢查和新輔助化療的發(fā)展，乳腺癌患者的預后得到了較大改善。然而，乳腺癌患者常出現(xiàn)化療耐藥［2］，這是造成乳腺癌化療失敗的主要原因之一。因此，詳細而全面地了解乳腺癌化療耐藥的分子機制是提高臨床化療效果的前提。微小RNAs（microRNAs，miRNAs） 是一類短的非編碼RNA 分子，通過靶向mRNA 負向調控靶基因表達。研究［3-4］表明：某些miRNAs，如miR-134miR-19a-3p 等，參與乳腺癌的化療耐藥調控，提示miRNAs 可作為乳腺癌耐藥治療的潛在靶點。有研究［5-7］顯示：miR-138-5p 可抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移，而在腫瘤耐藥方面miR-138-5p 能增強肺癌細胞對吉非替尼藥物敏感性，缺氧誘導因子1α （hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達水平與腫瘤的進展密切相關。研究［8］發(fā)現(xiàn)：HIF-1α 抑制劑PX-478 能有效增強結直腸癌對奧沙利鉑的敏感性。miR-138-5p 和HIF-1α 對腫瘤耐藥的作用均已被證實，但miR-138-5p 是否通過HIF-1α 影響腫瘤耐藥尚未見相關研究報道。因此，本研究觀察miR-138-5p 過表達對人乳腺癌MCF-7 細胞順鉑（cisplatin，DDP） 耐藥的影響，并進一步探討miR-138-5p 是否是通過靶向調控HIF-1α 表達參與人乳腺癌化療耐藥。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7 細胞和293T 細胞購自美國ATCC 公司。 DDP 購自美國Sigma 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 和RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，轉染試劑Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen 公司，BCA 蛋白質定量檢測試劑盒和蛋白裂解液均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，逆轉錄試劑盒和實時熒光定量 PCR （Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR） 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司，MTT 細胞增殖檢測試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司，miR-138-5p mimics 和陰性對照（無義序列）、HIF-1α 過表達質粒和空載質粒均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，HIF-1α、P-gp 和β-actin 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz 公 司，MRP1 抗體購自英國Abcam 公司。7500 型qRTPCR 儀購自美國ABI 公司，Accuri 流式細胞儀購自美國BD 公司，多功能酶標儀購自美國Thermo 公司，5200 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.2 耐藥細胞株MCF-7/DDP 構建采用濃度梯度遞增法誘導人乳腺癌MCF-7 細胞DDP 耐藥。采用濃度 范 圍 為0.5～25.0 μ mol·L－1DDP 間 斷 刺激MCF-7 細胞，經逐步篩選，MCF-7 細胞在25 μmol·L－1DDP 時正常增殖并生存。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/DDP 及其親本MCF-7 細胞采用含有10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代。取對數(shù)生長期MCF-7/DDP 細胞，制備成單細胞懸液，以1×105mL－1細胞濃度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，待細胞融合度達約80%時，按照Lipofectamine 3000 轉染試劑說明書，將miR-138-5p mimics 及其陰性對照（NC） 和HIF-1α 過 表 達 質 粒 及 其 空 載 質 粒（Vector）分別或同時轉染至MCF-7/DDP 細胞中，將細胞分為陰性對照組（NC 組，轉染miR-138-5p mimics 陰性對照）、miR-138-5p mimics 組（轉染miR-138-5p mimics）、miR-138-5p mimics+Vector組（共轉染miR-138-5p mimics 和空載質粒） 和miR-138-5p mimics+HIF-1α組（共轉染miR-138-5p mimics 和HIF-1α 過 表 達 質 粒），另 選 未 經 任 何轉染的MCF-7/DDP 細胞作為空白對照組。轉染48 h 后，采用qRT-PCR 法檢測細胞中miR-138-5p表達水平，Western blotting 法檢測細胞中HIF-1 α 蛋白表達水平。

1.4 qRT-PCR 法檢測各組細胞中miR-138-5p 和HIF-1α mRNA 表達水平采用TRIzol 法提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒和qRT-PCR 試劑盒說明書進行mRNA 定量分析。miR-138-5p 上游引物：5'-GCGAGCTGGTGTTGTGAATC-3'，下游引物：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'； HIF-1α上游引物：5'-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3'，下游引物：5'-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3'；U6 上 游 引 物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'； β-actin 上 游 引 物：5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3'， 下 游 引 物：5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'。熱反應程序：94 ℃預變性10 min，然后94 ℃變性15 s，60 ℃退 火40 s， 72 ℃延 伸50 s， 循 環(huán)40 次。miR-138-5p 以U6 為 內 參，HIF-1α 以β-actin 為 內參，根據(jù)2－ΔΔCt法計算miR-138-5p和HIF-1α mRNA 表達水平。

1.5 MTT 法檢測各組細胞增殖活性取對數(shù)生長期的耐藥細胞MCF-7/DDP 及其親本MCF-7 細胞或轉染后的各組細胞，以每孔5×103個細胞的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，再用不同終濃度（0、10、20、40、80 和100 μmol·L－1）DDP在37 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h。每孔加20 μL MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。加入150 μL 二甲基亞砜振蕩培養(yǎng)10 min 后采用多功能酶標儀在490 nm處檢測吸光度（A）值，計算細胞增殖活性。細胞增殖活性=（實驗組A 值—空白組A 值）/（對照組A 值—空白組A 值）×100%。根據(jù)細胞增殖活性，計算各組細胞半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）或耐藥指數(shù)（resistance index，RI），RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.6 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率取對數(shù)生長期的各組細胞，以每孔2×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞達到70% 融合度時，分別采用0 和20 μmol·L－1DDP 處理24 h。采用胰酶消化并收集細胞，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入195 μL AnnexinⅤ-FITC 結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL PI 染 色，室 溫 避 光 孵 育15 min，采用BD Accuri 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。細胞凋亡率（%）=早期凋亡率（B4 象限）+晚期凋亡率（B2 象限）。

1.7 Western blotting 法檢測各組細胞中HIF-1α、MDR1 和P-gp 蛋白表達水平收集耐藥細胞MCF-7/DDP 及其親本MCF-7 細胞或轉染后的各組細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解細胞，于4 ℃、12 000 r·min－1條件下離心5 min，收集細胞上清液，采用BCA 法進行蛋白質定量。沸水浴變性后，利用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉至硝酸纖維素膜（PVDF）后，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗HIF-1α（1∶2 000 稀釋）、P-gp （1∶500 稀 釋）、MRP1（1∶2 000 稀釋）和β-actin（1∶1 000稀釋）于4 ℃孵育過夜，利用Tris-HCl緩沖鹽和Tween 20（TBST）溶液清洗PVDF 膜上多余抗體，再加入二抗室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光法，經顯影、曝光后，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-138-5p 與HIF-1α 的靶向關系采用TargetScan（http：//www.targetscan. org） 生物信息軟件預測miR-138-5p與HIF-1α 3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）堿基互補配對序列。設計合成含miR-138-5p 結合位點的HIF-1α 野生型（WT） 或突變型（MUT） 3'-UTR 結合序列，再將其克隆至pGL3 熒光素酶載體中，生成pGL3-HIF-1α-WT （HIF-1α-WT） 或pGL3-HIF-1α-MUT（HIF-1α-MUT）報告載體。取對數(shù)生長期293T 細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種在96 孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞達到80% 匯合。 利用Lipofectamine 3000試劑將miR-138-5p mimics及其陰性對照（NC） 分別 與HIF-1α-WT 和HIF-1α-MUT 質粒共轉染至293T 細胞中。轉染48 h 后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明書檢測各組熒光素酶活性。相對熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶活性與腎素熒光素酶活性的比值表示。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞增殖活性，細胞miR-138-5p和HIF-1α mRNA 表達水平，細胞凋亡率，細胞中HIF-1α、P-gp 和MRP1 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MCF-7 和MCF-7/DDP 細胞的增殖活性不同濃度DDP 處理24 h 時，MCF-7/DDP 細胞增殖活性明顯高于其親本MCF-7 細胞（P＜0.01）。MCF-7/DDP 細胞IC50［（90.32±4.62）μmol·L－1］明顯高于MCF-7 細胞［（15.78±0.56）μmol·L－1］（P＜0.01），RI 值為5.72。見圖1。

圖1 MCF-7 和MCF-7/DDP 細胞的增殖活性Fig.1 Proliferation activities of MCF-7 and MCF-7/DDP cells

2.2 MCF-7/DDP 細 胞 中miR-138-5p 和HIF-1α mRNA蛋白表達水平與MCF-7細胞比較，MCF-7/DDP 細胞中miR-138-5p 表達水平明顯降低（P＜0.01）（圖2A），而MCF-7/DDP 細 胞 中HIF-1α mRNA（圖2B）和蛋白（圖2C和2D）表達水平明顯升高（P＜0.01）。

圖2 MCF-7/DDP 細胞中miR-138-5p 和HIF-1α 表達水平Fig.2 Expression levels of miR-138-5p and HIF-1α in MCF-7/DDP cells

2.3 miR-138-5p 過表達MCF-7/DDP 細胞的增殖活性和凋亡率與空白對照組和NC 組比較，miR-138-5p mimics 組細胞中miR-138-5p 表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖3A。不同濃度DDP 處理后，3 組細胞增殖活性比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3B。miR-138-5p mimics 組細胞IC50［（30.25±1.37）μmol·L－1］明顯低于空白對照組［（89.83±4.56）μmol·L－1］和NC組［（85.64±5.95）μmol·L－1］（P＜0.01）。0 μmol·L－1DDP 處 理時，與空白對照組和NC 組比較， miR-138-5p mimics 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；采用20 μmol·L－1DDP 處理時，與空白對照組和NC 組比較，miR-138-5p mimics 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見圖4。

2.4 miR-138-5p 過表達293T 細胞的熒光素酶活性生物信息學分析結果顯示：miR-138-5p 與HIF-1α 的3'-UTR 具有靶向結合位點。見圖5A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與NC 組比較，miR-138-5p mimics 組野生型HIF-1α 細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而突變型HIF-1α細胞中熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5B。Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對照組和NC 組比較，miR-138-5p mimics 組MCF-7/DDP 細 胞 中HIF-1α蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖6。

2.5 miR-138-5p 過表達或HIF-1α 過表達MCF-7/DDP 細胞的增殖活性、細胞凋亡率和耐藥相關蛋白表達水平MTT法檢測結果顯示：與NC組［（83.64±5.95） μ mol·L－1］ 比 較，miR-138-5p mimics 組［ （30.25±1.37） μmol·L－1］ 組和miR-138-5p mimics+Vector 組［（29.28±3.94） μmol·L－1］ 細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05），IC50明顯降低（P＜0.01）；與miR-138-5p mimics+ Vector 組 比較，miR-138-5p mimics+HIF-1α組細胞增殖活性明顯升高（P＜0.05），IC50明顯升高［（29.28±3.94） μmol·L－1vs（45.49±8.79） μmol·L－1］（P＜0.01）。見圖7。流式細胞術檢測結果顯示：與NC 組比較，miR-138-5p mimics 組和miR-138-5p mimics+Vector 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）； 與miR-138-5p mimics+Vector 組 比 較，miR-138-5p mimics+HIF-1α組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。見圖8。Western blotting 法檢測結果顯示：與NC 組比較，miR-138-5p mimics 組和miR-138-5p mimics+ Vector 組細胞中HIF-1α 蛋白以及下游耐藥相關蛋白P-gp 和MRP1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與miR-138-5p mimics+Vector 組比較，miR-138-5p mimics+HIF-1α 組 細胞中HIF-1α 蛋白以及下游耐藥相關蛋白P-gp 和MRP1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖9。

圖3 各組細胞中miR-138-5p 表達水平（A）和細胞增殖活性（B）Fig.3 Expression levels of miR-138-5p (A) in cells and proliferation activities (B) of cells in various groups

圖4 各組細胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of cells in various groups

圖5 miR-138-5p 和HIF-1α 的靶向關系（A）和2 組細胞中熒光素酶活性（B）Fig. 5 Targeting relationship between miR-138-5p and HIF-1α (A) and luciferase activities (B) in cells in two groups

圖6 各組細胞中HIF-1α 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of HIF-1α protein in cells in various groups

3 討 論

圖7 共轉染miR-138-5p mimics 和HIF-1α 過表達質粒后各組細胞增殖活性Fig. 7 Proliferation activities of cells in various groups after co-transfection of miR-138-5p mimics and HIF-1α overexpression plasmids

乳腺癌是現(xiàn)階段對女性健康具有重要危害的疾病之一。隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，乳腺癌的治療進展較快，其中化療仍是治療乳腺癌的最有效方法。但臨床上經常發(fā)生的腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR） 是提高乳腺癌化療療效和臨床療效的巨大障礙。MDR 是指腫瘤細胞對一種藥物產生抗性的同時，對其他作用靶點和機制不同的多種抗腫瘤藥物也產生交叉抗性。腫瘤組織缺氧是MDR 的產生機制之一，是腫瘤患者的預后標志物，且耐缺氧的癌細胞對放療和化療具有強抵抗力［9］。另外，HIF-1 信號通路活性在化療耐藥過程中具有重要作用［10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)：晚期肝細胞癌患者中過 表 達 的HIF-1α 和HIF-2α是預后不良的可靠標志?；虔煼ㄅcHIF 的抑制劑結合已被證明是在體外和體內克服索拉非尼耐藥性的有效方法。本研究結果顯示：人乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/DDP 中HIF-1α mRNA 和蛋白表達水平明顯高于MCF-7 細胞。這與上述的研究結果一致，說明HIF-1α 高表達與人乳腺癌細胞產生DDP 耐藥性密切相關。因此，通過靶向調控HIF-1 信號通路，改變缺氧腫瘤環(huán)境，篩選有效的潛在靶點對選擇高效的化療藥物具有重要意義。

miRNA 是一類內源性非編碼小RNA 分子，與目標基因的3'-UTR 結合，導致mRNA 降解或轉錄抑 制［12］。研究［13］顯示：miRNA的失調參與了癌癥的各種生物學過程，包括細胞增殖、分化和凋亡。此外，miRNA 可以調節(jié)癌細胞獲得的耐藥性［14-15］。例如，miR-139可通過靶向ATP7A 和ATP7B 使卵巢癌細胞對DDP 敏感［16］。miR-138-5p沉默增強了SGC7901 細胞的DDP 耐藥性，而miR-138-5p 過表達則部分逆轉了SGC7901/DDP 細胞的DDP 耐藥性［17］。研究［18］顯示：miR-138-5p 高表達能減弱非小細胞肺癌DDP 耐藥性。miR-138 通過靶向下調CREPT 癌基因的表達在體內體外抑制乳腺癌的增殖和侵襲［19］。然而，miR-138 與乳腺癌的DDP 耐藥性之間的關系尚未得到闡明。本研究結果顯示：miR-138-5p 在人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/DDP 中的表達水平明顯低于親本細胞MCF-7，且miR-138-5p 過表達能明顯抑制耐藥細胞增殖，促進細胞凋亡。與上述研究結果一致，說明miR-138-5p高表達能抑制人乳腺癌DDP 耐藥性。因此，可以推測miR-138-5p 參與人乳腺癌細胞耐藥，為miR-138-5p 調節(jié)乳腺癌化學耐藥性提供新思路。

圖8 共轉染miR-138-5p mimics 和HIF-1α 過表達質粒后MCF-7/DDP 細胞凋亡率Fig.8 Apoptotic rates of MCF-7/DDP cells after co-transfection of miR-138-5p mimics and HIF-1α overexpression plasmids

圖9 共轉染miR-138-5p mimics 和HIF-1α 過表達質粒后MCF-7/DDP 細胞中HIF-1α、P-gp 和MRP1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 9 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of HIF-1α, P-gp and MRP1 proteins in MCF-7/DDP cells after co-transfection of miR-138-5p mimics and HIF-1α overexpression plasmids

雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證結果顯示：miR-138-5p 與HIF-1α靶向結合，并且miR-138-5p過表達明顯下調HIF-1α 蛋白表達水平。說明miR-138-5p 靶向負調控HIF-1α。結合之前的研究結果，可以推測：miR-138-5p 通過靶向調控HIF-1α 影響人乳腺癌細胞MCF-7 耐藥。耐藥相關蛋白P-gp 是由MDR1 基因編碼，將細胞內的化療藥物跨膜泵出胞外的ABC 轉運蛋白家族成員。在化療過程中，P-gp 結合化療藥物分子，將藥物泵出，減少胞內藥物濃度，導致腫瘤細胞產生耐藥性。MDR1 是多藥耐藥相關蛋白，與P-gp 類似，同屬于ABC 轉運蛋白家族。研究［20］顯示：通過下調HIF-1α、P-gp 和MRP1 蛋白表達水平可明顯提高人乳腺癌細胞株的化療敏感性和放射敏感性。HIF-1α 基因敲除通過影響耐藥相關蛋白P-gp 和MRP1 的表達促進三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231 化療敏感性［21］。本研究結果顯示：miR-138-5p 過表達通過靶向調控HIF-1α 的表達，下調P-gp 和MRP1 蛋白表達水平。HIF-1α 挽救實驗從反面佐證了miR-138-5p 過表達對乳腺癌細胞耐藥的抑制效應。這與上述研究結果一致，說明miR-138-5p 過表達和抑制HIF-1α 表達均能抑制腫瘤細胞耐藥性，且本研究結果顯示：miR-138-5p 靶向負調控HIF-1α 表達，提高人乳腺癌細胞對DDP 的耐藥性。

綜上所述， miR-138-5p 通過靶向負調控HIF-1α 抑制人乳腺癌細胞增殖，促進細胞凋亡，并且抑制下游耐藥相關蛋白表達水平進而增強乳腺癌對DDP 的敏感性，本研究結果為miR-138-5p 與乳腺癌對DDP 耐藥之間的關聯(lián)提供了分子水平的理論依據(jù)。