樓張琪, 余起帆, 申雪知, 陳泓卿, 羅煜烽, 陳千葉, 鄭國芬, 丁悅敏, 張 雄

（1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 310058；2. 浙大城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州 310015）

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一類現(xiàn)代工業(yè)常用的增塑劑，廣泛存在于各種日用品中，如塑料容器、裝飾材料、醫(yī)療器材和食品包裝等［1］。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基） 酯［di-（2-ethylhexyl） phthalate，DEHP」常被添加到聚氯乙烯塑料中，是最常用的一種PAEs。由于PAEs 沒有與聚合物基質(zhì)形成牢固的共價結(jié)合，僅靠弱的氫鍵或范德華力結(jié)合，很容易被釋放并轉(zhuǎn)移到周圍環(huán)境中。PAEs 可以通過呼吸道、消化道或皮膚等途徑進入人體。自TESTA 等［2］報道DEHP 與兒童自閉癥相關(guān)以來，越來越多的證據(jù)［3-7］表明：孕期母體攝入的DEHP 可通過胎盤和乳汁進入子代，影響子代的神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，引起焦慮和抑郁等神經(jīng)行為改變等，但具體的機制尚未見文獻報道。

本文作者采用孕期暴露于DEHP 的小鼠為動物模型，觀察子代的神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，并檢測仔鼠前額葉皮層內(nèi)調(diào)控細胞骨架actin 的關(guān)鍵信號分子P21 蛋白激活激酶1 （P21-activated kinase 1，Pak1） 和絲切蛋白（cofilin） 的表達情況，進一步在細胞水平探討DEHP 對Neuro-2A 細胞遷移能力和突起生長情況的影響，以明確孕期DEHP 暴露對胎兒腦發(fā)育的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DEHP （美國Sigma 公司），玉米油（中國金龍魚糧油食品股份有限公司），兔抗GAPDH 多克隆抗體（中國賢至生物公司），Pak1 抗體（美國Abcam 公司），cofilin 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）。電泳裝置、轉(zhuǎn)膜儀和多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），Oddesy 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國Li-COR Biosciences 公 司），超聲波粉碎儀（瑞 士ULTRASONICS 公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），小動物行為觀察記錄分析系統(tǒng)（荷蘭Noldus 公司）。

1.2 模型制備清潔級健康ICR 成年小鼠50 只，含40 只雌鼠和10 只雄鼠，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0005。所有動物在浙大城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)和繁殖，遵照實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將40 只雌鼠隨機按3～4∶1 與雄鼠合籠，合籠之后于次日清晨觀察陰道栓，標(biāo)記懷孕雌鼠并分別記錄懷胎時間。將孕鼠隨機分為玉米油對照組、低劑量（10 mg·kg－1） DEHP 暴露組、中 劑 量（50 mg·kg－1）DEHP暴露組和高劑量（250 mg·kg－1）DEHP 暴露組［8］，每日灌胃0.5 mL。給藥自孕第3 天起至孕17 d 止，共15 d。

1.3 新生仔鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)檢測從仔鼠出生后每日檢測神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)［9］，指標(biāo)達標(biāo)后終止檢測。①平面翻正：將仔鼠至于桌面上，四肢朝上扶持2 s，仔鼠在2 s 內(nèi)四肢著地翻正，連續(xù)3 次者為達標(biāo)，平面翻正指數(shù)為達標(biāo)仔鼠數(shù)與仔鼠總數(shù)的比值；②前肢抓握：用金屬細柄輕觸仔鼠前爪，自然抓握3 次者為達標(biāo)，前肢抓握指數(shù)為達標(biāo)仔鼠數(shù)與仔鼠總數(shù)的比值；③耳廓分離日齡：記錄每只仔鼠出現(xiàn)雙側(cè)耳廓均分離的日齡；④睜眼日齡：記錄每只仔鼠雙側(cè)眼睛均睜開的日齡。

1.4 Y 迷宮實驗檢測仔鼠探索新環(huán)境的能力在Y 迷宮中心處放入一只7 周齡的仔鼠讓其自由探索8 min，攝像記錄仔鼠進入迷宮臂的順序，若仔鼠相鄰3 次分別進入不同的迷宮臂就記錄為正確的一組，正確的組數(shù)除以總組數(shù)即為仔鼠Y 迷宮實驗的自發(fā)交替率［10］，以此反映小鼠對新環(huán)境的探索能力。每完成一只仔鼠的測試均需使用75%酒精擦拭迷宮來消除氣味。

1.5 Western blotting 法檢測仔鼠前額葉皮層組織中Pak1 和cofilin 蛋白表達水平組織蛋白提取：取9 周齡仔鼠經(jīng)心臟灌流后取腦，在冰上分離出前額葉，分別加適量蛋白裂解液RIPA（1 g?L－1），冰水浴超聲波勻漿，12 000 r·min－1離心30 min，取上清液。細胞蛋白提取：細胞經(jīng)PBS 緩沖液清洗3 次后，加適量蛋白裂解液RIPA 和PMSF，震搖10 min 后用刮刀將細胞刮下，收集液體，放入低溫離心機12 000 r·min－1離心30 min，取上清液。按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白定量和測定。聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBS-T 封閉2 h，加一抗Pak1 或cofilin，4 ℃搖床過夜，TBS-T 清洗3 次，每次10 min，加入二抗室溫搖床孵育2 h，TBS-T 洗膜3 次，每次10 min，用Oddesy 熒光掃描成像儀掃膜顯影。采用Image J 軟件對條帶進行測量，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達水平。

1.6 細胞培養(yǎng)和給藥Neuro-2A 細胞購自中科院上海細胞所。將Neuro-2A 細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）和5%F12 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中。視細胞生長情況隔天換液1 次。給藥前，先將培養(yǎng)液吸去，PBS 緩沖液清洗3 次，加入新的培養(yǎng)液后再分別按照1 nmol?L－1、10 nmol?L－1和1 μmol?L－1的終濃度加入DEHP，作為DEHP組；對照組則加入二甲基亞砜（DMSO）。

1.7 細胞劃痕實驗檢測體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞Neuro-2A 的遷移能力將細胞傳代至培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿中加入約7×105個細胞進行貼壁培養(yǎng)。待細胞生長至約90%時，吸干培養(yǎng)液，用滅菌槍頭在皿底十字交叉劃線，PBS 緩沖液清洗細胞3 次，加入新鮮培養(yǎng)液后再分別按照1 nmol?L－1、 10 nmol?L－1和1 μmol?L－1的濃度加入DEHP孵育［11］， 作為DEHP 組；DMSO 對照組加入DMSO。培養(yǎng)0、6、12 和24 h 后分別拍照觀察。采用Image J 軟件測量各時間點劃痕間的距離，每個皿隨機選取4 個部位測量，計算平均遷移距離和平均每小時遷移速率。細胞遷移速率（μm?h－1）=（A 時劃痕間距－B 時劃痕間距）/（B 時－A 時）。

1.8 觀察體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞Neuro-2A 突起生長的情況將細胞傳代至培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿中加入約7×104個細胞進行貼壁培養(yǎng)。待細胞生長至約30%時，加入新細胞培養(yǎng)液后再分別按照1 nmol?L－1、10 nmol?L－1和1 μmol?L－1的濃 度加入DEHP 孵育，作為DEHP 組；DMSO 對照組加入DMSO。培養(yǎng)0、6、12、24 和48 h 后分別拍照觀察。神經(jīng)細胞突起長度用Image J 軟件測量，每個皿隨機測量5 個視野中的細胞，長度大于一倍胞體者認定為有效突起并測量其長度，計算平均突起長度；計數(shù)有突起細胞和所有細胞總數(shù)，計算有突起細胞百分比。有突起細胞百分比=有突起細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)、Y 迷宮自發(fā)交替率、前額葉皮層組織中Pak1 和cofilin 蛋白表達水平、細胞遷移速率、有突起細胞百分比和細胞突起長度符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生仔鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)母鼠在孕期連續(xù)暴露于DEHP 15 d，在仔鼠出生后進行神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)的檢測。中劑量DEHP 暴露組仔鼠在出生后第1 天的平面翻正指數(shù)較玉米油對照組降低，其余各組仔鼠在各個檢測時間點的平面翻正指數(shù)和前肢抓握指數(shù)與玉米油對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組仔鼠在各個檢測時間點睜眼日齡和耳廓分離日齡比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 孕鼠DEHP 暴露后新生仔鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)Fig.1 Neurodevelopmental indicators of newborn mice after DEHP exposure in pregnant mice

2.2 各組仔鼠探索新環(huán)境的能力Y 迷宮實驗結(jié)果顯示：中劑量DEHP 暴露組雌性仔鼠自發(fā)交替率較同性別玉米油對照組明顯降低（P＜0.01）；雖然中劑量DEHP 暴露組雄性仔鼠自發(fā)交替率降低，但與玉米油對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 各組仔鼠前額葉皮層組織中Pak1 和cofilin 蛋白表達水平與玉米油對照組比較，中和高劑量DEHP 組仔鼠前額葉皮層組織中cofilin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），但Pak1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 各組體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞Neuro-2A 的遷移能力與DMSO 對照組比較，孵育6 h 后10 nmol?L－1和1 μ mol?L－1DEHP組細胞遷移速率明顯降低（P＜0.05）。與DMSO 對照組比較，孵育12 h 后，不同劑量DEHP 組細胞遷移速率均明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組神經(jīng)細胞Neuro-2A 突起生長情況與DMSO 對照組比較，DEHP 組從孵育6 h 開始，Neuro-2A 細胞突起平均長度明顯縮短（P＜0.05），當(dāng)孵育時長達到48 h 時，Neuro-2A 細胞有突起細胞百分比明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖2 各組仔鼠自發(fā)交替率Fig.2 Spontaneous alternation rates of offsprings in various groups

3 討 論

圍生期是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，也是對環(huán)境毒素最敏感的時期。在此期間，將發(fā)育的腦暴露于含有毒素、藥物和重金屬等環(huán)境中很可能會干擾腦的正常發(fā)育［12］。在出生前，人和哺乳類動物的血腦屏障尚未發(fā)育完全，脂溶性藥物較水溶性藥物更容易進入腦組織中，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育造成影響［13-15］。DEHP 的脂溶性較高，較易通過血腦屏障作用于胎兒腦組織。

研究［3-6，16］證明：產(chǎn)前暴露于PAEs 會導(dǎo)致嬰兒的一系列神經(jīng)發(fā)育障礙，但這些結(jié)果僅限于人體流行病學(xué)研究，尚缺乏實驗動物研究及機制探討。本研究建立圍生期DEHP 染毒小鼠，探討DEHP對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響及其機制，結(jié)果顯示：孕期50 mg?kg－1以上劑量的DEHP 暴露會使子代小鼠產(chǎn)生神經(jīng)行為學(xué)異常，表現(xiàn)為雌性仔鼠對新環(huán)境探索能力的減弱，該結(jié)果與人體流行病學(xué)結(jié)果相符。

為進一步解釋DEHP 引起神經(jīng)行為異常的機制，本研究檢測了仔鼠大腦前額葉皮層組織中Rho-GTPase 信號通路的變化。腦發(fā)育期間，無論神經(jīng)元的遷移還是突起的延伸都離不開細胞骨架［17］。Rho-GTPase 信號通路是調(diào)控細胞骨架actin聚合和解聚的重要信號通路，其通過關(guān)鍵信號分子Pak1 調(diào)控了聚合關(guān)鍵蛋白cofilin 的活性［18-19］，從而改變actin 的聚合狀態(tài)。本文作者前期研究［20］發(fā)現(xiàn)：鄰苯二甲酸二正丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）能通過調(diào)控Rho-GTPase 信號通路改變神經(jīng)元的遷移能力，但DEHP 的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：DEHP 暴露雖未使Pak1 蛋白的表達發(fā)生變化，但使cofilin 的表達水平明顯降低。cofilin作為將肌動蛋白長鏈切割為球形肌動蛋白單體的關(guān)鍵分子［21］，其表達水平降低將嚴重影響2 種肌動蛋白的動態(tài)平衡，很可能使細胞產(chǎn)生一系列形態(tài)學(xué)和運動方面的改變［22］。

圖3 各組仔鼠前額葉皮層組織中Pak1 和cofilin 蛋白表達情況Fig.3 Expressions of Pak1 and cofilin in prefrontal cortex tissue of offsprings in various groups

圖4 各組Neuro-2A 細胞遷移情況Fig.4 Migration of Neuro-2A cells in various groups

圖5 各組Neuro-2A 細胞突起生長情況Fig.5 Neurite outgrowth of Neuro-2A cells in various groups

為探討DEHP 是否使神經(jīng)細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和運動能力改變，本研究進一步將體外培養(yǎng)的Neuro-2A細胞給予不同濃度的DEHP 孵育并進行劃痕實驗，結(jié)果顯示：DEHP 抑制了細胞的遷移和突起生長能力，與本文作者前期研究［20］報道的DBP 效應(yīng)一致。由于細胞的遷移活動和突起生長依賴于細胞骨架蛋白actin 的活動，結(jié)合DEHP 抑制actin 上游調(diào)控蛋白cofilin 的表達，說明DEHP 可能通過抑制cofilin 導(dǎo)致細胞骨架蛋白actin 的聚合異常，從而干擾了神經(jīng)元遷移和突起的生長。

綜上所述，孕期暴露于較高濃度的DEHP 可以導(dǎo)致仔鼠的神經(jīng)行為學(xué)異常，其機制可能與DEHP抑制大腦發(fā)育期細胞骨架調(diào)控蛋白cofilin 的表達、影響神經(jīng)元的遷移和突起生長有關(guān)。