張淑榮, 張琦穎

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院眼科，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

煙曲霉菌性角膜炎（Aspergillus fumigatuskeratitis， AFK） 是 由 煙 曲 霉 菌 （Aspergillus fumigatus，AF）感染引起的致盲性眼病，多與角膜外傷和潰瘍有關(guān)，近年來調(diào)查研究［1］表明：AFK 發(fā)生率日趨升高。AFK 治療比較困難，若早期未及時(shí)有效治療，病情常呈進(jìn)行性發(fā)展，部分患者可能出現(xiàn)角膜穿孔、眼內(nèi)炎甚至致盲，給患者身心造成嚴(yán)重傷害。AFK 主要病理特點(diǎn)為角膜組織大量炎性細(xì)胞浸潤及較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，因此早期抗炎治療是抑制病情進(jìn)展的關(guān)鍵［2］。木犀草素屬于天然黃酮類化合物，存在于多種中藥、蔬菜和水果中，具有多種生物學(xué)活性［3-4］。體外實(shí)驗(yàn)研究［5］證實(shí)：木犀草素對小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞炎癥模型具有良好的抗炎作用，且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。木犀草素具有良好的抗炎效果，關(guān)節(jié)局部注射可抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)［6］，局部應(yīng)用其凝膠制劑可抑制特應(yīng)性皮炎皮膚組織炎癥等［7］，說明木犀草素局部用藥抗炎作用確切，但目前關(guān)于其對AFK 的作用效果少有報(bào)道，且木犀草素在角膜組織中的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究構(gòu)建AFK 大鼠模型，通過評(píng)估大鼠角膜炎癥情況、檢測角膜組織中炎癥因子水平，探討木犀草素抑制AFK 炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制，為木犀草素相關(guān)藥物的研發(fā)及AFK 的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、標(biāo)準(zhǔn)菌株、主要試劑和儀器SPF級(jí)雄性SD 大鼠100 只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0001，實(shí)驗(yàn)前裂隙燈檢查排除眼前結(jié)疾病。AF 菌種購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心，于Sabouroud 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 周（25 ℃），采用雙蒸水（double distilled water，ddH2O） 制成混懸液，真菌孢子濃度調(diào)整為1×108CFU·mL－1，4 ℃保存?zhèn)溆?。木犀草素（濃度?8%，武漢博士德生物工程有限公司），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor- α， TNF- α）、白 細(xì) 胞 介 素 12（interleukin-12， IL-12）和酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（美國R&D 公司），BCA 蛋白定量分析試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），兔抗大鼠Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB） 多抗和人抗兔TLR4、MyD88 及NF-κB 單抗（美國Abcam 公司）。軟性角膜接觸鏡（直徑14 mm，丹陽海昌隱形眼鏡有限公司），微量移液器（德國Eppendorf 公司），RM2235 徠卡切片機(jī)（德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司），電泳儀和CheniDoc XRS 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 AFK 大鼠模型建立參照文獻(xiàn)［8］ 建立AFK 大鼠模型：建模第1～3 天應(yīng)用0.5%左氧氟沙星滴眼液滴注雙眼，每天滴注4 次，連續(xù)3 d；第4 天腹腔注射10%水合氯醛麻醉，1%鹽酸丁卡因滴注雙眼，術(shù)野常規(guī)消毒，采用直徑為4 mm 的環(huán)形鉆定位左眼角膜中央部位，清除角膜上皮，采用直徑為6 mm 的環(huán)形鉆將14 mm 的軟性角膜接觸鏡切割為直徑6 mm，然后覆蓋角膜清除部位，將濃度為1×108CFU·mL－1的AF 孢子混懸液注入鏡片與角膜層之間，應(yīng)用氧氟沙星眼膏涂布結(jié)膜囊，以5-0 絲線縫合上下眼瞼。術(shù)畢將大鼠放置保溫箱恢復(fù)，術(shù)后9 h 拆線，移除軟性角膜接觸鏡。AF 孢子混懸液注入2 d 后，激光共焦顯微鏡檢查大鼠角膜組織形態(tài)表現(xiàn)，同時(shí)刀片刮取潰瘍區(qū)角膜組織，接種Sabouroud 瓊脂培養(yǎng)基，確認(rèn)為真菌感染，則建模成功。

1.3 動(dòng)物分組和干預(yù)方法100 只大鼠隨機(jī)選取15 只為假手術(shù)組（未注入AF 孢子混懸液，操作與其他各組相同）；其余85 只建立AFK 模型，共建模成功72 只（其中11 只死亡，2 只未出現(xiàn)病癥），隨機(jī)分為5 組：模型組14 只、低劑量木犀草素組14 只、中劑量木犀草素組14 只、高劑量木犀草素組15 只和LPS+木犀草素組15 只。建模成功1 h后，低、中和高劑量木犀草素組大鼠給予濃度為5、10 和20 g·L－1木犀草素溶液（用1% DMSO 溶液稀釋）局部滴眼50 μL，假手術(shù)組和模型組大鼠給予1% DMSO 溶液局部滴眼50 μL，LPS+木犀草素組大鼠在給予20 g·L－1木犀草素溶液50 μL 后另給予LPS 溶液1.0 μg 局部滴眼，均連續(xù)滴眼7 d。

1.4 大鼠角膜炎癥指數(shù)評(píng)估末次滴眼2 h 后，于裂隙燈下觀察并評(píng)估大鼠角膜炎癥指數(shù)，以病灶大小、病變深度為具體標(biāo)準(zhǔn)［9］。①病灶大小評(píng)分：病灶面積占角膜總面積比例為1%～25%，計(jì)1 分；25%＜病灶面積占角膜總面積比例≤50%，計(jì)2分；50%＜病灶面積占角膜總面積比例≤75%，計(jì)3 分；75%＜病灶面積占角膜總面積比例≤100%，計(jì)4 分。②病變深度。角膜輕度混濁，瞳孔及虹膜清晰，計(jì)1 分；角膜淺層灰白色混濁，透過病灶可見瞳孔及虹膜，計(jì)2 分；角膜全層不均勻混濁，計(jì)3 分；角膜全層均勻致密混濁，計(jì)4 分。角膜炎癥指數(shù)評(píng)分=病灶大小評(píng)分+病變深度評(píng)分。

1.5 大鼠角膜病理形態(tài)表現(xiàn)觀察末次滴眼2 h后，各組隨機(jī)取4 只大鼠處死，無菌取角膜組織，放置于10 %中性甲醛固定48 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋后，制作厚度為4 μm 的連續(xù)切片，隨后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察角膜病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 大鼠角膜組織中炎癥因子水平檢測末次滴眼2 h 后，各組隨機(jī)取5 只大鼠處死，無菌取角膜組織稱質(zhì)量，按照質(zhì)量比1∶9 加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）進(jìn)行勻漿，勻漿液 置 于8 000 r·min-1離 心10 min （離 心 半 徑 為10 cm），取上清液，采用ELISA 法進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，于酶標(biāo)儀上測定570 nm 波長處吸光度（A）值，以A 值為橫坐標(biāo)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算縱坐標(biāo)IL-1β、TNF-α 和IL-12 水平。

1.7 Western blotting 法檢測大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平末次滴眼2 h 后，各組隨機(jī)取5 只大鼠處死，無菌取角膜組織，液氮中研磨后轉(zhuǎn)至離心管，細(xì)胞裂解液置于冰上孵育30 min，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取20 μg 樣本與等量上樣緩沖液混勻后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，100 V 電轉(zhuǎn)30 min，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，然后采用10%牛奶封閉2 h（室溫），加入稀釋一抗，置于搖床孵育過夜（4 ℃），次日TBST 緩沖液洗膜3 次×10 min，加入稀釋二抗搖床孵育1 h（室溫），再次TBST 緩沖液洗膜3 次×10 min，于暗室中進(jìn)行曝光、顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白TLR4、MyD88 和NF-κB 條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠炎癥指數(shù)、角膜組織中IL-1β、TNF-α 和IL-12 水 平 及TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AFK 模型大鼠角膜組織形態(tài)表現(xiàn)共焦激光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：AFK 模型大鼠角膜組織出現(xiàn)短、直、平行或交錯(cuò)排列，呈高反光線型生長的菌絲（圖1A）；角膜組織刮片檢查出線型真菌菌絲和橢圓形孢子（圖1B），說明大鼠AFK模型成功建立。

2.2 各組大鼠角膜大體形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠角膜組織結(jié)構(gòu)均正常；模型組和LPS+木犀草素組大鼠角膜呈現(xiàn)白色致密潰瘍灶，水腫且表面無光澤，虹膜不可見，且LPS+木犀草素組潰瘍灶面積更大；低、中和高劑量木犀草素組大鼠角膜潰瘍灶面積逐漸變小，水腫逐漸吸收減輕，角膜變薄，有新生血管滲入角膜緣。見圖2。

2.3 各組大鼠角膜炎癥指數(shù)假手術(shù)組，模型組，低、中和高劑量木犀草素組及LPS+木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)分別為（3.10±0.61）分、（6.42±0.89） 分、（5.54±0.83） 分、（4.63±0.54） 分、（4.11±0.42） 分和（7.30±0.42） 分；與假手術(shù)組比較，模型組和低、中及高劑量木犀草素組以及LPS+木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)均明顯升高（P＜0.05）；與模型組和LPS+木犀草素組比較，低、中和高劑量木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)均降低（P＜0.05）；與低劑量木犀草素組比較，中和高劑量木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)均降低（P＜0.05），且高劑量木犀草素組低于中劑量組（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠角膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠角膜組織上皮完整、無炎性細(xì)胞浸潤；模型組和LPS+木犀草素組大鼠均可見角膜膠原纖維腫脹、排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，且LPS+木犀草素組大鼠角膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤程度較模型組更為明顯；與模型組比較，低、中和高劑量木犀草素組大鼠角膜組織上述變化均減輕，炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，其中高劑量木犀草素組大鼠減輕最為明顯，但膠原纖維仍輕微腫脹，可見少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖3。

表1 各組大鼠角膜組織中IL-1β、TNF-α 和IL-12 水平Tab. 1 Levels of IL-1β, TNF-α, and IL-12 in cornea tissue of rats in various of groups [n=5,x±s,ρB/(μg·L-1)]

2.5 各組大鼠角膜組織中IL-1β、TNF-α 和IL-12水平ELISA 法檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組和低、中及高劑量木犀草素組以及LPS+木犀草素組大鼠角膜組織中IL-1β、TNF-α 和IL-12水平均升高（P＜0.05）；與模型組和LPS+木犀草素組比較，低、中和高劑量木犀草素組大鼠角膜組 織 中IL-1β、TNF-α 和IL-12 水 平 均 降 低（P＜0.05）；與低劑量木犀草素組比較，中和高劑量木犀草素組大鼠角膜組織中IL-1β、TNF-α 和IL-12水平均降低（P＜0.05），且高劑量木犀草素組低于中劑量木犀草素組（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+木犀草素組大鼠角膜組織中IL-1β、TNF-α和IL-12 水平均升高（P＜0.05）。見表1。

2.6 各組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組比較，模型組和低、中及高劑量木犀草素組以及LPS+木犀草素組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中和高劑量木犀草素組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；與低劑量木犀草素組比較，中和高劑量木犀草素組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），且高劑量木犀草素組低于中劑量木犀草素組（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+木犀草素組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。見表2和圖4。

3 討 論

角膜完整解剖結(jié)構(gòu)和淚膜正常生理活動(dòng)是維持角膜屏障的前題，并且具有阻止外源性真菌侵襲的作用［10-11］。當(dāng)真菌病原體附著并結(jié)合在角膜上時(shí)，通過不斷釋放代謝毒素、誘導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而募集多種炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，激發(fā)過度免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致角膜組織病理損害［12］。因此，過度炎癥反應(yīng)在真菌性角膜炎疾病進(jìn)展中起重要作用，尋找有效抑制角膜炎癥反應(yīng)的藥物對該疾病的臨床治療有重要意義。已有研究［13］證實(shí)木犀草素具有較強(qiáng)抗炎效果，故本研究選取我國臨床中常見致病菌種AF，建立AFK 大鼠模型，重點(diǎn)觀察木犀草素對AFK 大鼠的抗角膜炎癥反應(yīng)作用，并探討其抗炎機(jī)制。

表2 各組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of TLR4, MyD88 and NF-κB proteins in cornea tissue of rats in various groups (n=5,±s)

表2 各組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of TLR4, MyD88 and NF-κB proteins in cornea tissue of rats in various groups (n=5,±s)

*P＜0.05 compared with sham operation group； △P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of luteolin group；○P＜0.05 compared with medium dose of luteolin group；▲P＜0.05 compared with LPS+luteolin group.

Group Sham operation Model Luteolin Low dose Medium dose High dose LPS+luteolin TLR4 0.20±0.02 1.12±0.10*MyD88 0.19±0.02 1.07±0.09*NF-κB 0.17±0.02 1.13±0.08*0.93±0.08*△▲0.80±0.07*△#▲0.47±0.05*△#○▲1.60±0.13*△0.91±0.07*△▲0.81±0.07*△#▲0.53±0.06*△#○▲1.59±0.14*△0.94±0.07*△▲0.76±0.06*△#▲0.40±0.05*△#○▲1.26±0.12*△

圖4 各組大鼠角膜組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 4 Electrophoregram of expressions of TLR4,MyD88 and NF-κB proteins in cornea tissue of rats in various groups

真菌孢子黏附于角膜基底膜是真菌性角膜炎感染的首要步驟［14］。本研究應(yīng)用曲霉菌屬真菌AF 模擬臨床感染模式建立AFK 大鼠模型，建模成功率為84.71%，建模成功率高。AF 孢子黏附于破損角膜上皮后，角膜上皮細(xì)胞隨即啟動(dòng)免疫防御機(jī)制，大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞進(jìn)入角膜組織，啟動(dòng)炎癥免疫反應(yīng)［15］。本研究病理學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各劑量木犀草素組AFK 大鼠角膜炎癥病變情況均減輕，其中高劑量組減輕最為明顯，各劑量木犀草素組大鼠角膜炎癥指數(shù)均低于模型組，且具有劑量依賴性，提示木犀草素可有效抑制AFK 大鼠角膜炎癥反應(yīng)。木犀草素屬于天然黃酮類小分子化合物，近年來，黃酮類化合物在多種疾病中抗炎、清除自由基等作用得到證實(shí)。張雨點(diǎn)等［16］研究表明： 木犀草素可激活A(yù)MP 依賴的蛋白激酶（AMPK），而AMPK 介導(dǎo)的TLR4 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。另有研究［17］顯示：木犀草素可通過降低慢性阻塞性肺疾病患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及白細(xì)胞介素等炎癥介質(zhì)，從而發(fā)揮抗炎作用。由此可知，木犀草素可能通過調(diào)節(jié)AFK 大鼠角膜炎癥免疫反應(yīng)發(fā)揮積極的抗炎作用。

TLR4 在角膜基質(zhì)細(xì)胞識(shí)別AF 侵襲過程中發(fā)揮重要作用。TLR4 主要通過MyD88 依賴和非依賴兩種途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，MyD88 依賴途徑中，TLR4 與其相應(yīng)配體結(jié)合后，活化MyD88 蛋白、促使NF-κB 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而激活下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程，激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等合成及釋放炎 癥 介 質(zhì)，如IL-1β、TNF-α和IL-12等［18-19］。AF 等真菌包括LPS 和酵母聚糖等多種成分，既往研究［20］證實(shí)：TLR4 在固有免疫應(yīng)答中可通過識(shí)別酵母聚糖發(fā)揮作用。LIU 等［21］研究發(fā)現(xiàn)：AFK 大鼠TLR4/MyD88 信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，且抑制該信號(hào)通路可有效抑制角膜炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)果相符。本研究應(yīng)用不同劑量木犀草素干預(yù)后，AFK 大 鼠 角 膜 組 織 中IL-1β、TNF-α 和IL-12 水 平及TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均降低，且具有劑量依賴性，提示木犀草素可能通過抑制TLR4/MyD88 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及其下游炎癥因子進(jìn)而抑制AFK 大鼠角膜炎癥反應(yīng)。本研究應(yīng)用TLR4 激動(dòng)劑LPS 和高劑量木犀草素滴眼后，大鼠角膜炎癥指數(shù)及角膜組織IL-1β、TNF-α 和IL-12 水 平 以 及TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋 白 表 達(dá)水平均較模型組升高，提示木犀草素的角膜炎癥抑制作用被TLR4 激動(dòng)劑抵消，進(jìn)一步明確木犀草素可能通過抑制TLR4 信號(hào)通路發(fā)揮抑制角膜炎癥反應(yīng)作用。

綜上所述，木犀草素對AFK 大鼠具有治療作用，可有效抑制大鼠角膜炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能通過抑制TLR4/MyD88 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及其下游炎癥因子發(fā)揮調(diào)控作用，本研究為臨床木犀草素相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于AFK 的臨床治療提供了理論支持。作為中藥提取物，木犀草素抗真菌治療過程稍長，可推薦作為輔助藥物用于感染較重、多發(fā)和難治性眼科疾病的治療。在進(jìn)一步的研究中，本課題組將繼續(xù)探討木犀草素對其他類型角膜炎炎癥因子的調(diào)控作用，為木犀草素的臨床應(yīng)用提供更充足依據(jù)。