張 旭, 劉乃萌, 馬嬌艷, 林 楠, 孫珉丹

（1. 長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)部婦兒教研室，吉林 長春 130031；2. 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春130021；3. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科，吉林 長春 130021；4. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林 長春 130021）

免疫球蛋白A 腎?。↖gA nephropathy， IgAN）是IgA 在腎小球系膜中彌漫性沉積致使腎小球系膜增生最終導(dǎo)致腎小球腎炎［1］。IgAN 是全世界范圍內(nèi)最常見的腎小球疾病，患病率根據(jù)地理位置的不同有所差異，在撒哈拉以南的非洲地區(qū)IgAN 只占腎小球疾病的不足1%，而在亞太地區(qū)卻高達(dá)30%～50%［2-3］。約25% IgAN 患 者 在 確 診 后 的20 年內(nèi)將發(fā)展為終末期腎病，另外20%的患者腎功能將逐漸下降［4］。目前，IgAN 的診斷主要依據(jù)腎臟的組織學(xué)檢查，以明確腎小球系膜中IgA 沉積作為疾病診斷的依據(jù)［5］。雖然臨床上可以通過病理學(xué)明確診斷IgAN，但是IgAN 的致病機(jī)制仍不明確，有待于進(jìn)一步探索。

腎臟作為機(jī)體血流最豐富的器官之一，對血液的濾過和重吸收在機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，因而腎臟的工作伴隨著能量的大量消耗［6］。線粒體作為細(xì)胞能量工廠，為細(xì)胞的基本生命活動提供能量，也是腎臟實(shí)現(xiàn)其功能的基本保障［7］。研究［8-10］表明：線粒體功能的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和腎損傷等。但線粒體功能異常與IgAN 發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究報道較少。線粒體分裂融合的動態(tài)平衡是線粒體維持自身功能的重要方式。線粒體分裂能夠?qū)⒐δ墚惓５牟糠謩冸x，而融合能將線粒體基因組突變率降低，分裂融合的平衡是線粒體維持自身功能的關(guān)鍵。但是，線粒體分裂融合蛋白之間的失衡與IgAN 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步的闡釋。因此，本研究通過IgAN 動物模型探討線粒體分裂融合蛋白表達(dá)失衡與IgAN 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物、主要試劑和儀器SPF 級雄性BALB/C 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。血清肌酐檢測試劑盒和血清尿素氮檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）和白 細(xì) 胞 介 素 6（interleukin-6， IL-6），酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 檢測試劑盒購自美國Legend 公司，蛋白marker 購自美國Thermo Fisher 公司，組織蛋白提取試劑盒購自美國Invent 公司，組織RNA 提取試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) （reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RT-PCR） 試劑盒和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，動力相關(guān)蛋白1（dynamic-related protein 1， Drp1）、線粒體融合蛋白1（mitofusin 1， Mfn1）和線粒體融合蛋 白2 （mitofusin 2， Mfn2） 一 抗 以 及 對 應(yīng) 的HRP-山羊抗兔IgG 二抗購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，RIPA 裂解液、PMSF 和5×Loading buffer 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，免疫熒光用IgA 抗體和熒光二抗購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司。全波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek 公司，RT-qPCR 儀和Western blotting 電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Red 公司，光學(xué)顯微鏡和攝像系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，熒光顯微鏡購自德國ZEISS 公司，萬分之一電子天平購自德國Sartorius 公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱和離心機(jī)購自美國Thermo Fisher 公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海Tanon 公司。

1.2 構(gòu)建小鼠IgAN 模型20 只雄性BALB/C 小鼠，體質(zhì)量18～20 g，隨機(jī)分為對照組和模型組，每組10 只。模型組采用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和四 氯 化 碳（carbon tetrachloride， CCl4）聯(lián)合給藥構(gòu)建小鼠IgAN模型，即BSA 560 mg·kg－1灌胃給藥，隔日給藥，持續(xù)6 周；于給藥6 和8 周時尾靜脈注射0.07 mg LPS； 蓖麻油0.7 mL+CCl40.14 mL皮下注射，每周1次，持續(xù)給藥9 周［9］。對照組小鼠給予等量生理鹽水。

1.3 腎臟指數(shù)分析最后一次給藥1 周后，處死小鼠，小鼠處死前稱量體質(zhì)量，處死后剝離兩側(cè)腎臟，生理鹽水清洗3 次，濾紙吸干腎臟表面生理鹽水，對兩側(cè)腎臟分別稱質(zhì)量。腎臟指數(shù)=（單個腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。

1.4 酶活性法檢測血清肌酐和尿素氮水平小鼠摘眼球取血后，室溫條件下，3 000 r·min－1離心15 min，分離獲得血清。按肌酐和尿素氮檢測試劑盒說明書操作。肌酐檢測：在血清樣品中先后加入酶溶液1 和酶溶液2 分別在37 ℃條件下孵育10 min，于540 nm 波長處測定吸光度（A）值，分別 為A1和A2，肌酐計算公式：肌酐（μmol·L－1）=［（測定A2－K×測定A1）－（空白A2－K×空白A1）］/［（標(biāo)準(zhǔn)A2－K×標(biāo)準(zhǔn)A1）－（空白A2－K×空白A1）］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（442 μmol·L－1），稀釋因子K= （加樣量+酶溶液1 體積）/（加樣量+酶溶液1 體積+酶溶液2 體積）=186/246。尿素氮檢測：在血清樣品中加入緩沖液后37 ℃孵育10 min，然后加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉后37 ℃孵育10 min，于640 nm 波長處測定A 值，尿素氮計算公式：尿素氮（mmol·L－1）=［（測定A值－空白A 值）/（標(biāo)準(zhǔn)A 值－空白A 值）］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 mmol·L－1）×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.5 免疫熒光法檢測腎小球IgA 沉積取腎組織于4%多聚甲醛固定；經(jīng)石蠟包埋后切片；經(jīng)二甲苯進(jìn)行脫蠟處理；梯度乙醇溶液清洗（100%乙醇-95%乙醇、80%乙醇和75%乙醇），然后經(jīng)蒸餾水水洗；經(jīng)梯度乙醇（95%乙醇-95%乙醇-100%乙醇-100%乙醇）、石碳酸二甲苯和二甲苯進(jìn)行脫水處理；抗原修復(fù)完成后采用IgA 一抗37 ℃條件下孵育1 min，PBST 緩沖液清洗3 次，孵育熒光標(biāo)記二抗，最后經(jīng)中性樹脂封片，利用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 HE 染色觀察小鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)表現(xiàn)取腎組織于4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后切片，經(jīng)二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，梯度乙醇溶液清洗（無水乙醇-無水乙醇-95%乙醇-90%乙醇-80%乙醇-75%乙醇），然后經(jīng)蒸餾水水洗，蘇木精染色后采用鹽酸乙醇進(jìn)行分化，自來水浸泡后進(jìn)行伊紅染色，伊紅染色后經(jīng)梯度酒精（80%乙醇-90%乙醇-95%乙醇-無水乙醇-無水乙醇）、二甲苯進(jìn)行脫水處理，最后經(jīng)中性樹脂封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.7 ELISA法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平小鼠摘眼球取血后，室溫條件下、3 000 r·min－1離 心15 min，分 離 獲 得 血 清。按ELISA 試劑盒說明書操作，具體步驟：在96 孔板中，每孔加入50 μL 稀釋液，再加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，室溫孵育2 h；清洗5 次后加入100 μL 連接劑，室溫孵育2 h；清洗5 次后加入100 μL 底物反應(yīng)液，室溫孵育30 min；加入100 μL終止液，于450 nm 波長處測定A 值。

1.8 RT-qPCR 法檢測小鼠腎組織中Drp1、Mfn1和Mfn2 mRNA 表達(dá)水平采用上海翊圣生物科技有限公司的組織RNA 提取試劑盒提取小鼠腎組織RNA，經(jīng)RT-qPCR 試劑盒對提取的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。RT-qPCR 體系：2×SYBR GREEN MIX 5 μL，上下游引物（10 μmol·L－1）各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共設(shè)置40 個循環(huán)。采用2－△△Ct法計算小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 mRNA 表達(dá)水平。具體引物信息見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.9 Western blotting 法檢測小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 蛋白表達(dá)水平采用美國Invent 公司蛋白提取試劑盒提取腎組織總蛋白。取腎組織20 mg 置于離心管柱上，塑料研磨棒研磨60 次，使組織破碎，加入200 μL 裂解液，再次研磨60 次，室溫孵育2 min，14 000 g 離心2 min，管底液體即為腎組織總蛋白。根據(jù)獲得蛋白的體積加入5×Loading buffer，沸水煮10 min。每組樣品上樣量為10 μg，SDS-PAGE 層積膠80 V、15 min，分離膠120 V、40 min，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，PBS緩沖液清洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次后顯影。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Graphpad 8.0 軟件進(jìn)行繪圖，采用Image J 軟件分析Western blotting 法檢測結(jié)果的灰度值。對各組小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，均為正態(tài)分布和方差齊，以±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用Student’st檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎小球IgA 沉積和腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)IgAN 作為免疫性腎病，其主要發(fā)病機(jī)制是IgA 在腎小球系膜區(qū)沉積，導(dǎo)致腎小球功能障礙。目前，主要的診斷方法是通過免疫熒光檢測IgA 在腎小球系膜區(qū)沉積。本研究結(jié)果表明：與對照組比較，模型組小鼠腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)IgA 沉積，而對照組基本上看不到IgA 的沉積。見圖1。

在光鏡下觀察，對照組腎組織中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見腫脹壞死細(xì)胞。與對照組比較，模型組腎組織病理損傷比較明顯，腎小球明顯萎縮，腎小球囊腔空隙明顯增大，彌漫性腎小球系膜增生，腎小球和腎小管細(xì)胞淡染，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，伴隨著腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死，表明IgAN 模型構(gòu)建成功。見圖2。

2.2 各組小鼠腎臟指數(shù)和血清學(xué)指標(biāo)與對照組比較，模型組小鼠腎臟稍有增大，小鼠腎臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。見圖3。與對照組比較，模型組小鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯升高（P＜0.05）。見表2。以上結(jié)果表明：模型組小鼠腎臟發(fā)生了明顯的病變導(dǎo)致腎臟指數(shù)升高，對血清肌酐和尿素氮的清除效率降低。

2.3 各組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平與對照組比較，模型組小鼠經(jīng)誘導(dǎo)刺激后，血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖4。

2.4 各組小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 mRNA 表達(dá)水平采用RT-qPCR 法檢測各組小鼠腎組織內(nèi)分裂融合相關(guān)蛋白的mRNA 表達(dá)水平。與對照組比較，模型組小鼠腎組織中Drp1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Mfn1 和Mfn2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖1 各組小鼠腎小球IgA 沉積（免疫熒光法，×200）Fig.1 IgA deposition in glumerulus of mice in various groups (Immunofluorescence,×200)

圖2 各組小鼠腎臟組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.2 Pathomorphology of kidney tissue of mice in various groups (HE,×200)

圖3 各組小鼠腎臟指數(shù)Fig.3 Kidney indexes of mice in various groups

表2 各組小鼠血清肌酐和尿素氮水平Tab. 2 Levels of serum creatinine and urea nitrogen of mice in various groups (n=10，±s）

表2 各組小鼠血清肌酐和尿素氮水平Tab. 2 Levels of serum creatinine and urea nitrogen of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 compared with control group.

Group Control Model Urea nitrogen[cB/(mmol·L－1）]7.4±1.4 21.6±2.1*Creatinine[cB/（μmol·L－1）]40.7±2.6 75.3±5.8*

2.5 各組小鼠腎組織中Drp1、Mfn1和Mfn2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步采用Western blotting法檢測小鼠腎組織中Drp1、Mfn1和Mfn2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果與mRNA表達(dá)水平一致。與對照組比較，模型組小鼠腎組織中Drp1的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。Mfn1 和Mfn2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Fig. 4 Levels of TNF-α,IL-1β, and IL-6 in serum of mice in various groups

圖5 各組小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 mRNA表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of Drp1, Mfn1, and Mfn2 mRNA in kidney tissue of mice in various groups

3 討 論

IgAN 是最常見的原發(fā)性腎小球疾病，其主要特點(diǎn)是IgA 單獨(dú)或者協(xié)同IgG 和IgM 在腎小球系膜中沉積導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多［10］。IgAN在不同患者之間或者同一患者的單個活檢樣本中腎小球病變均存在著很大的差異。研究［11-12］顯示：在滿足IgAN 定義的腎臟活檢標(biāo)本中能夠觀察到的組織學(xué)變化范圍很廣，可見從接近正常到嚴(yán)重的增生性腎小球腎炎伴細(xì)胞新月體，或類似于原發(fā)局灶節(jié)段性腎小球硬化的形態(tài)。本研究以傳統(tǒng)經(jīng)典的建模方法為基礎(chǔ)構(gòu)建小鼠IgAN 模型，免疫熒光法檢測結(jié)果顯示腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)了明顯的IgA 沉積，表明模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步分析小鼠腎損傷程度，模型組腎臟指數(shù)明顯升高，伴隨著血清肌酐和尿素氮水平升高。腎小球受損導(dǎo)致其濾過功能的降低，肌酐和尿素氮作為反映腎臟濾過功能的重要指標(biāo)能夠直觀地反映出腎臟功能的受損程度［13-14］。本研究中模型組小鼠血清中肌酐和尿素氮水平明顯升高，表明腎小球發(fā)生了明顯的病變導(dǎo)致其功能異常，致使肌酐和尿素氮停留在血液中不能排出體外。IgAN 的主要組織病理學(xué)變化是腎小球系膜增生，本研究進(jìn)一步采用組織病理學(xué)觀察確認(rèn)腎小球的病變，結(jié)果顯示：腎小球明顯萎縮，腎小球囊腔空隙明顯增大，彌漫性腎小球系膜增生，腎小球和腎小管細(xì)胞淡染，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，伴隨著腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死。

圖6 各組小鼠腎組織中Drp1、Mfn1 和Mfn2 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 6 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Drp1, Mfn1, and Mfn2 proteins in kidney tissue of mice in various groups

研究［15-18］顯示：IgAN 的發(fā)病與扁桃體感染、腸道黏膜感染以及食物抗原所激活的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，主要是B 細(xì)胞活化后分泌的低糖基化的IgA。感染所介導(dǎo)的機(jī)體異常炎癥反應(yīng)是誘發(fā)IgAN 的基礎(chǔ)。研究［19-21］表明：TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥因子能夠促進(jìn)B 細(xì)胞分泌低糖基化的IgA，進(jìn)一步將機(jī)體的炎癥反應(yīng)放大，加速IgA 沉積導(dǎo)致的腎損傷。本研究中模型組小鼠血清中炎癥因 子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水 平 明 顯 高 于 對 照 組，表明模型組小鼠炎癥反應(yīng)明顯強(qiáng)于對照組。

線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，為細(xì)胞的基本生存提供能量，包括蛋白質(zhì)的合成、清除和分泌等［22-23］。研究［8-10］表明：線粒體功能異常與多種腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括腎炎、急性腎損傷和慢性腎損傷等。YU 等［24］研究發(fā)現(xiàn)：IgAN 患者尿液中線粒體DNA 的含量隨著病情的加重而升高，表明線粒體損傷在IgAN 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞線粒體處在分裂融合的平衡狀態(tài)，進(jìn)而保障線粒體正常功能［25］。但I(xiàn)gAN 的發(fā)生發(fā)展與線粒體分裂融合之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步深入探索。本研究結(jié)果表明：IgAN 模型組小鼠腎組織中線粒體分裂蛋白Drp1 表達(dá)水平明顯升高，而線粒體融合蛋白Mfn1 和Mfn2 表達(dá)水平降低，線粒體分裂融合蛋白的表達(dá)平衡被打破，線粒體不能通過分裂融合來對抗外界的刺激，進(jìn)而誘發(fā)線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致IgAN 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，線粒體分裂融合蛋白表達(dá)平衡紊亂所致線粒體功能障礙可能是誘導(dǎo)IgAN 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，本研究為靶向線粒體治療IgAN 提供了一定的實(shí)驗數(shù)據(jù)。