賈榮軍, 馬麗曼, 李麗華

（1. 錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，遼寧 錦州 121000；2. 臺州學院醫(yī)學院實驗中心，浙江 臺州 318000）

肝纖維化與病毒性損傷、過度飲酒、自身免疫性疾病或膽汁淤積性疾病等引起的慢性肝損傷有密切關聯［1］。持續(xù)性的慢性肝損傷會形成進行性纖維化、肝硬化，甚至肝癌。肝纖維化患者具有較高的病死率［2］，研究［3］表明：肝纖維化可通過誘因的去除發(fā)生逆轉，由此引發(fā)研究熱潮。肝纖維化的典型特征是膠原蛋白和細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 大量沉積，ECM 主要來源于激活的 肝 星 狀 細 胞（hepatic stellate cells， HSCs），HSCs 激活后向肌成纖維細胞轉化，導致ECM 的積累［4-6］。骨化三醇是維生素D 的活性形式，同時也是維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）的有效激動劑，通過與VDR 特異性結合，發(fā)揮其抗炎、抗腫瘤和保護肝臟的作用［7-10］。研究［11］表明：骨化三醇可降低HSCs 中α-平滑肌蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 的表達，緩解四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4） 誘導的肝纖維化。骨化三醇還可通過激活VDR 減少ECM 沉積，進而減輕博來霉素誘導的肝纖維化［12］。但骨化三醇對膽總管結扎（bile duct ligation，BDL）所致的肝纖維化的作用機制尚不清楚。一種有絲分裂原激活的細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase，ERK） 可調控HSCs 的激活，改善鵝去氧膽酸誘導的肝纖維化［13］。此外，研究［14］表明：骨化三醇通過抑制轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/ERK 信號通路，能有效減少HSCs 的激活，緩解硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化。本研究通過BDL 建立肝纖維化小鼠模型，探討骨化三醇通過ERK 蛋白對BDL 誘導的肝纖維化的影響，為肝纖維化的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級C57BL/6小鼠45 只，8～10 周齡，體質量為（25±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。骨化三醇（大連美侖生物公司），異氟烷（深圳瑞沃德公司），HE 染色和天狼猩紅試劑盒（北京索萊寶公司），丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素 （total bilirubin， TBIL）和羥 脯 氨 酸（hydroxyproline，Hyp）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），VDR 抗體、TGF-β1 抗體、ERK 抗體、磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal regulated protein kinase，p-ERK）抗體、Ⅰ型膠原蛋白（type Ⅰcollagen，Col Ⅰ）抗體、 甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體、肌動蛋白β（beta actin，β-actin）抗體、結蛋白（Desmin）抗體、α-SMA 抗體、HRP 標記羊抗兔二抗和HRP標記羊抗鼠二抗（美國Proteintech 公司）。Olympus BX-53 型顯微鏡（日本Olympus 公司），ECL 顯影液和成像系統（美國Bio-Rad 公司），Thermo multisan mk3 酶標儀（美國Thermo 公司）。

1.2 實驗動物分組和模型制備將45 只8～10 周雄性C57BL/6 小鼠隨機分為假手術組、肝纖維化模型組（模型組） 和骨化三醇治療組（治療組），每組15 只。動物飼養(yǎng)及使用嚴格按照錦州醫(yī)科大學動物倫理委員會要求。各組小鼠實驗前禁食不禁水過夜（＞12 h），使用2%異氟烷麻醉小鼠，并固定于手術臺上，手術過程中保持體溫37 ℃，醫(yī)用酒精消毒，備皮。肝纖維化模型組小鼠經腹白線開腹，暴露肝門，鑷子鈍性游離膽總管，在近肝門處使用6/0 手術線雙重結扎膽總管，剪斷中間的膽總管，縫合腹腔。假手術組小鼠只游離膽總管，繞膽總管穿過手術線，但不結扎。治療組小鼠膽總管結扎后腹腔注射2.5 μg·kg－1骨 化 三 醇［15］，每 周3 次，于術后第28 天眼眶取血，斷髓，取肝臟。

1.3 各組小鼠血清ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平測定各組小鼠眼眶取血，靜置1 h 后，3 000 r·min－1，4 ℃離心20 min，取血清測定各組小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平。按照試劑盒說明書測定ALT 和AST 活性，由酶標儀測得吸光度（A）值，通過標準曲線換算出相應的活性；按照試劑盒說明書測定TBA、TBIL 和Hyp 水平，根據酶標儀測得A 值，計 算 公 式 如 下：TBA （μmol·L－1） = （ΔA測定/ΔA標準） × 校 準 品 濃 度 （μmol·L－1）； TBIL（μmol·L－1） =887.211× （ΔA測定－ ΔA空白） +0.5492；Hyp（mg·L－1）=［（ΔA測定－ΔA空白）/（ΔA標準－ΔA空白）］×標準品含量（5 mg·L－1）×［解液總體積（mL）/取樣量（mL）］。

1.4 小鼠肝組織病理形態(tài)表現4%多聚甲醛固定各組小鼠肝組織，石蠟包埋后切片，切片脫蠟后進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察并比較各組小鼠肝臟組織的病理形態(tài)表現，即觀察各組小鼠肝組織壞死區(qū)域變化以及匯管區(qū)炎性細胞浸潤程度，計算肝組織壞死面積百分率。

1.5 天狼猩紅染色觀察各組小鼠肝組織纖維化4%多聚甲醛固定小鼠肝組織，蔗糖脫水，8 μm 冰凍切片。將切片恢復至室溫，PBS 緩沖液清洗5～10 min，天狼猩紅染液染35 min。經無水乙醇脫水，二甲苯透明后封片。顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織纖維化程度。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠肝組織中VDR、ERK、p-ERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平取0.02 g 小鼠肝組織置于1.5 mL 離心管，加入0.2 mL 蛋白裂解液，冰上超聲破碎，靜置，離心取上清。蛋白定量采用BCA法，取約35 μg 蛋白行SDS-PAGE 電泳，后90 V濕轉90 min 至PVDF 膜，10% BSA 封閉2 h。一抗搖床4 ℃孵育16～18 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 顯影曝光，采用Image J 軟件進行灰度分析，將目的蛋白（VDR、ERK、pERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin）條帶灰度值與內參照條帶灰度值比值作為目的蛋白表達水平。

1.7 免疫組織化學法檢測各組小鼠肝組織中α-SMA和TGF-β1 蛋白表達情況嚴格按照試劑盒說明書操作，對肝組織中α-SMA 和TGF-β1 蛋白按照二步法染色，光學顯微鏡下觀察，黃褐色或黃棕色顆粒即為α-SMA 和TGF-β1 蛋白陽性表達。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。對各組小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平以及肝組織中ERK、pERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝組織中VDR 蛋白表達量Western blotting 法檢測結果顯示：與模型組比較，治療組VDR 蛋白表達量明顯增加（P＜0.05）。表明骨化三醇有效激活了VDR。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織中VDR 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of VDR in liver tissue of mice in various groups

2.2 各組小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平模型組和治療組小鼠血清ALT和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平均高于假手術組（P＜0.05），表明肝臟損傷增加，膠原沉積增加；與模型組比較，治療組小鼠血清中ALT和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平明顯降低（P＜0.05），肝損傷及纖維化有所改善。見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平Tab.1 Activities of serum ALT and AST and levels of TBA, TBIL and Hyp of mice in various groups (n=15，±s）

表1 各組小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA、TBIL 和Hyp 水平Tab.1 Activities of serum ALT and AST and levels of TBA, TBIL and Hyp of mice in various groups (n=15，±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Sham operation Model Treatment Hyp [ρB/ (mg·L－1)]1.73±0.16 3.22±0.18*2.05±0.26*△ALT[λB/(U·L－1)]50.22±4.72 187.43±27.30*122.56±7.38*△AST[λB/ (U·L－1)]26.53±2.34 146.94±16.58*66.68±5.96*△TBA[cB/ (μmol·L－1)]4.21±1.02 12.26±1.43*5.38±1.20*△TBIL[cB/ (μmol·L－1)]36.02±4.28 266.22±39.05*135.78±12.44*△

2.3 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現HE 染色顯示：假手術組小鼠肝組織結構較為完整，未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝組織匯管區(qū)出現炎性細胞浸潤，壞死灶較為明顯；與模型組比較，治療組小鼠壞死灶區(qū)域減小，匯管區(qū)炎性細胞浸潤有所改善。與假手術組比較，模型組小鼠肝組織壞死面積百分率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組小鼠肝組織壞死面積百分率明顯降低（P＜0.01）。見圖2 和3。

圖2 各組小鼠肝組織病理形態(tài)表現（HE,×100）Fig.2 Pathomorphology of liver tissue of mice in various groups (HE,×100)

圖3 各組小鼠肝組織壞死面積百分率Fig. 3 Percentages of necrotic areas of liver tissue of mice in various groups

2.4 各組小鼠肝組織纖維化程度天狼猩紅染色結果顯示：假手術組小鼠肝組織僅有少量紅色膠原纖維出現；與假手術組比較，模型組小鼠肝組織中央靜脈及匯管區(qū)出現較多紅色膠原物質，表明纖維化程度加重；與模型組比較，治療組小鼠肝組織中紅色膠原沉積明顯減少，小鼠纖維化有明顯改善。見圖4。

2.5 各組小鼠肝組織中ERK、p-ERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與假手術組比較，模型組小鼠肝組織中ERK 和p-ERK 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組小鼠肝組織中ERK 和p-ERK 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖5、圖6和表2。

圖4 各組小鼠肝組織纖維化情況（天狼猩紅,×100）Fig.4 Liver tissue fibrosis of mice in various groups (Sirius red,×100)

2.6 免疫組織化學法檢測各組小鼠肝組織中α-SMA和TGF-β1 蛋白表達情況免疫組織化學法檢測結果顯示：假手術組小鼠肝組織中α-SMA 和TGF-β1蛋白表達量低，黃褐色顯色較少；模型組小鼠肝組織中α-SMA 和TGF-β1 蛋白表達量高，黃褐色顯色較為明顯；與模型組比較，治療組α-SMA和TGF-β1蛋白表達量明顯降低，黃褐色著色明顯減少。見圖7。

圖5 各組小鼠肝組織ERK 和p-ERK 蛋白表達電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of ERK and pERK in liver tissue of mice in various groups

圖6 各 組 小 鼠 肝 組 織 中α-SMA、TGF-β 1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達電泳圖Fig. 6 Electrophoregram of expressions of α-SMA,TGF-β 1, Col Ⅰ,and Desmin proteins in liver tissue of mice in various groups

3 討 論

肝纖維化是由多種因素引起的一種慢性肝損傷疾病，持續(xù)進行性發(fā)展會形成肝硬化，甚至肝癌［16］。BDL 是目前最常用的梗阻性膽汁淤積性損傷模型［17］，小鼠膽管結扎后膽汁流動受阻導致膽汁酸積聚，引起肝細胞損傷和慢性炎癥，肝臟異常炎癥會誘導HSCs 活化，進而促進肝纖維化進展［18-19］。骨化三醇具有抗炎和抗纖維化作用。MARADANA 等［20］研究表明：向飲食誘導的非酒精性脂肪型肝炎小鼠注射脂質體姜黃素或骨化三醇可減少肝臟的炎癥反應和肝纖維化。GUO 等［21］研究顯示：骨化三醇可通過上調免疫細胞中p27（kip1）的表達，減少炎癥細胞因子的產生，抑制肝細胞癌的發(fā)展。本研究結果顯示：骨化三醇治療后，小鼠血清中ALT 和AST 活性及TBA 和TBIL水平明顯降低，表明肝損傷減輕。Hyp 可以衡量肝臟膠原蛋白表達水平，其水平降低表明膠原沉積減少。本研究中HE 染色和天狼星紅染色結果顯示：治療組炎性細胞浸潤和膠原沉積相比模型組明顯減少，纖維化程度降低。提示骨化三醇可激活VDR以減輕BDL 誘導的肝損傷和肝纖維化。然而，骨化三醇調控BDL 所致肝纖維化的機制尚不清楚。

骨化三醇的生物學作用主要由核激素受體超家族成員VDR 介導。VDR 與骨化三醇結合后，與維甲 酸X 受 體（retinoid X receptor，RXR） 相 互 作用，形成異二聚體復合物入核，與VDR 反應元件（vitamin D receptor element，VDRE） 結合發(fā)揮生物學效應［22］。本研究結果顯示：給予骨化三醇治療后，VDR 的表達量增加，但骨化三醇激活VDR后如何緩解BDL 導致的肝纖維化尚不清楚。在肝臟非實質細胞中可檢測到VDR 的表達，包括HSCs、膽管上皮細胞和枯否細胞［23］。肝臟受到外界刺激時，HSCs 激活釋放大量ECM，ECM 沉積導致肝纖維化［6，24］。HSCs 可被內皮細胞、肝細胞和枯否細胞等產生的TGF-β 和TGF-β1 激活。TGF-β1 可促進HSCs 向肌成纖維細胞轉化，抑制和 刺 激ECM 的 降 解和合 成［25］。RAMIREZ 等［26］研究顯示：給予骨化三醇后可抑制TGF-β1 誘導的小鼠肺成纖維細胞增殖和α-SMA 的表達，并減少纖維連接蛋白和膠原蛋白的表達。本研究結果顯示：BDL 小鼠給予骨化三醇治療后，通過激活VDR 減少了TGF-β1 和α-SMA 的陽性表達。另外，Desmin 作為HSCs 激活的標志蛋白，HSCs 激活后會大量表達［27］。本研究結果顯示：與模型組比較，治療組Desmin 蛋白表達量明顯降低。以上結果表明：骨化三醇治療后可通過激活VDR 減少TGF-β1和Desmin 的表達，抑制HSCs 的激活以緩解BDL誘導的肝纖維化。但骨化三醇激活VDR 后通過何種途徑調控TGF-β1 尚不清楚。

表2 各組小鼠肝組織中ERK、p-ERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of ERK,p-ERK,α-SMA,TGF-β1,Col Ⅰand Desmin proteins in liver tissue of mice in various groups（n=15，±s）

表2 各組小鼠肝組織中ERK、p-ERK、α-SMA、TGF-β1、Col Ⅰ和Desmin 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of ERK,p-ERK,α-SMA,TGF-β1,Col Ⅰand Desmin proteins in liver tissue of mice in various groups（n=15，±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Sham operation Model Treatment Desmin 0.49±0.11 0.83±0.02*0.61±0.06△ERK 0.58±0.02 1.15±0.04*0.61±0.02△p-ERK 0.63±0.01 1.27±0.03*0.66±0.05△α-SMA 0.14±0.02 0.40±0.03*0.27±0.09△TGF-β1 0.22±0.04 0.49±0.07*0.26±0.01△Col Ⅰ0.30±0.02 1.66±0.03*0.55±0.01△

圖7 各組小鼠肝組織中α-SMA 和TGF-β1 蛋白表達情況（免疫組織化學，×100）Fig. 7 Expressions of α-SMA and TGF-β1 proteins in liver tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry,×100)

ERK 是一種有絲分裂原激活的蛋白激酶，通過磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基來調控多種底物蛋白，參與多種細胞進程，包括細胞增殖、分化和黏附等［29］。研 究［14］表 明：抑 制TGF-β1/ERK 信 號 通路能減少HSCs 的激活，緩解硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化。骨化三醇可以通過阻斷ERK 和p38介導的促凋亡信號，減輕腎小球纖維化［28］。另有研究［30］發(fā)現：抑制Smad 和ERK 信號通路，可減少肝星狀細胞的激活，有效緩解CCl4誘導的肝纖維化，提示ERK 與TGF-β1 有密切關聯。本研究中，BDL 導致小鼠肝組織中ERK 和pERK 蛋白表達增多；骨化三醇治療后，激活的VDR 下調了ERK 和pERK 蛋白的表達，同時TGF-β1 表達量明顯下降，表明骨化三醇對BDL 誘導的肝臟纖維化的保護作用是通過下調ERK 和pERK 蛋白表達、降低TGF-β1 表達、抑制HSCs 激活實現的。

綜上所述，骨化三醇激活VDR，通過下調ERK 蛋白表達，減少TGF-β1 表達，進而抑制HSCs 的激活，緩解BDL 誘導的小鼠肝纖維化。本研究結果為肝纖維化的治療提供了新的理論依據。