任 海，張文香，李佩國，華智杰，梅 靜，李杜文 (河北科技師范學院 動物科技學院，

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)是原產(chǎn)歐洲的名貴魚種，是世界公認的優(yōu)質比目魚之一，在中國稱“多寶魚”或“瘤棘鲆”，是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類[1-2]。近幾年，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加，弧菌病常給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，其中以鰻弧菌的危害作用最大，它的致病性與自身的毒力因子有關，其中胞外蛋白酶(金屬蛋白酶)具有很強的致病性，該結果已經(jīng)在INAMURA等[1]、陳吉祥等[2]和LEE等[3]的研究中被證實。陳吉祥等[2]從花鱸體內分離獲得的鰻弧菌，純化后的金屬蛋白酶能夠引起鱸魚組織損傷和死亡。池政豪[4]研究證實鰻弧菌胞外金屬蛋白酶對牙鲆鰓細胞具有明顯的毒性作用，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鰓細胞內出現(xiàn)凋亡小體并出現(xiàn)崩解現(xiàn)象。GPxs是一個多酶家族的統(tǒng)稱，目前在動物體內發(fā)現(xiàn)存在8種GPx，其中GPx1是第1個被發(fā)現(xiàn)的硒蛋白[5]，它是以GSH為催化底物，通過催化氧化態(tài)的GSH生成還原態(tài)的GSH來阻斷活性氧自由基(ROS)對生物體造成的進一步損傷，是體內重要的ROS清除劑[6]。目前，關于GPx1的基因克隆和表達相關研究在魚類中已有報道，如藍旗金槍魚[7]、大黃魚[8]、羅非魚[9]和淇河鯽[10]等，然而大菱鲆GPx1基因的克隆及相關研究未見報道，因此深入了解大菱鲆GPx1基因的功能，探討大菱鲆GPx對病原菌毒力因子的響應具有重要的理論和實踐意義。

為了研究大菱鲆GPx在抵御鰻弧菌毒力因子中的作用，本研究首次利用cDNA末端快速擴增(RACE)技術克隆獲得了大菱鲆GPx1全長cDNA序列，分析其生物學功能，通過qRT-PCR技術和酶活測定技術研究了GPx1基因在大菱鲆各組織中的表達以及經(jīng)金屬蛋白酶脅迫下GPx1基因以及GPx蛋白變化，同時檢測脂質過氧化產(chǎn)物MDA在金屬蛋白酶脅迫后的變化，為進一步闡明大菱鲆抗氧化防御系統(tǒng)對病原菌毒力因子的響應提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑試驗所用大菱鲆購自河北秦皇島昌黎縣某養(yǎng)殖場，挑選健康活潑的大菱鲆暫養(yǎng)在80 cm×40 cm×50 cm的玻璃缸中，每天投喂前吸取殘餌糞便，每3 d換水1 次，每次換水量為總水量的1/2，養(yǎng)殖過程中鹽度為19，溫度為(16±1)℃，試驗前暫養(yǎng)1周。

試驗試劑：TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、反轉錄酶(M-MLV)、TaKaRa LA Taq?、pMD19-T Vector、感受態(tài)細胞DH5a、DNA膠回收試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購自寶生物工程(大連)有限公司；SMARTTMRACE Amplification Kit和Advantage 2PCR Kit購自Clontech公司;本試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA提取和cDNA合成取健康大菱鲆肝組織經(jīng)過液氮研磨后轉入盛有1 mL TRIzol的1.5 mL無RNA酶離心管中，按照試劑盒說明書提取大菱鲆肝臟組織總RNA，核酸定量測定儀(Thermo,NANO DROP-2000)檢測RNA濃度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。以總RNA為模板，采用PrimerScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒去除基因組DNA后，經(jīng)過37℃ 15 min延伸和85℃ 5 s逆轉錄反應獲得cDNA第1鏈。按照Clontech公司生產(chǎn)的SMARTTMRACE Amplification Kit的說明書合成5′和3′RACE cDNA，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大菱鲆GPx1基因cDNA片段的克隆從GenBank數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索牙鲆(EU095498.1)、塞內加爾鰨(HM068301.1)、條石鯛(AY734530.1)和大黃魚(KY689025.1)的GPx1基因，利用DNAMAN軟件進行同源性比對，在保守區(qū)域設計兼并引物(GPx-F2，GPx-R1)(表1)，以大菱鲆肝臟組織cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增體系10 μL，反應條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min 10 s，33個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增片段正確性，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，與pMD19-T載體連接4 h以上后轉到DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR鑒定選取陽性克隆送北京三博遠志生物技術有限責任公司進行雙向測序。

1.4 大菱鲆GPx1基因全長克隆經(jīng)NCBI比對證實測序結果為大菱鲆GPx1基因片段后，利用Primer Primer 5.0設計GPx1基因5′和3′RACE特異性引物(GPx1-5-3和GPx1-3-2)(表1)。按照SMARTTMRACE Amplification Kit說明書進行該基因的5′-RACE和3′-RACE PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所擴增的片段大小，將擴增正確的PCR產(chǎn)物進行純化和測序等，具體方法同1.3。

表1 本試驗所用的引物序列

1.5 生物信息學分析利用DNAMAN進行全序列拼接，DNAStar軟件預測開放閱讀框(ORF)并翻譯成氨基酸；ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam)和(http://www.expasy.org/too/protparam.html)分析蛋白質基本物理化學參數(shù)；利用(http://cn.expasy.org/prosite)對蛋白質序列功能位點進行預測；通過在線軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預測蛋白質跨膜結構；通過在線軟件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預測蛋白質信號肽；利用在線軟件NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析蛋白質糖基化位點；利用DNAMAN軟件對大菱鲆及其他物種的GPx1氨基酸序列進行比對，然后利用MEGA 4.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 GPx1基因在不同組織中的轉錄水平根據(jù)GPx1基因和內參基因β-actin全長序列，利用Primer Primer 5.0軟件設計熒光定量特異性引物GPx1-F、GPx1-R、Actin-F 和Actin-R(表1)，按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明書進行PCR擴增，利用Bio-rad CF X96 熒光定量PCR儀檢測GPx1基因在大菱鲆各組織(肝臟、腎臟、心臟、胃、肌肉、腸和鰓)中的表達情況，每個樣品平行測定3次，采用Real-time PCR(SYBR Green)2-△△Ct相對定量法計算GPx1基因mRNA的相對表達量。

1.7 金屬蛋白酶脅迫試驗試驗分為對照組(0.00 g/L)和金屬蛋白酶組(0.15 g/L)，金屬蛋白酶來自本實驗室，該蛋白酶制備方法參考文獻[1]，具體方法略作修改。將大菱鲆隨機分為2組，每組3個平行，試驗組注射100 μL的金屬蛋白酶，對照組注射等體積無菌PBS。于注射后3、6、12、24、48和72 h 分別取肝臟和腎臟，每個時間點取3尾大菱鲆，提取總RNA反轉錄為cDNA。GPx1基因mRNA的相對表達量具體操作同1.3。同時，將上述時間點肝臟和頭腎經(jīng)液氮研磨成細粉后取50 mg 加入450 μL 生理鹽水，配成1∶10的溶液，用于后續(xù)酶活測定。

1.8 肝臟和頭腎組織GPx活力和MDA含量測定按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測定GPx 活力和MDA 含量。

2 結果

2.1 大菱鲆GPx1基因全長cDNA的序列分析大菱鲆GPx1基因cDNA序列全長為975 bp，5′非編碼區(qū)為200 bp，3′非編碼區(qū)為346 bp，該基因ORF長度429 bp，編碼1個由142個氨基酸殘基組成的蛋白質，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，加尾信號AATAAA(圖1)。預測該基因相對分子質量為16.30 kDa，理論等電點為7.20。軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因包括GPx家族標簽序列LGVPCNQF和WNFEKF，Se 結合活性位點(Q、W和 N)和PGNG結構域，另外在3′端非編碼區(qū)還包括硒代半胱氨酸插入序列。

起始密碼子ATG、終止密碼子TGA和PolyA加尾信號分別用黑色陰影標出；GPx家族標簽序列LGVPCNQF和WNFEKF用下劃線標出；Se 結合活性位點(Q、W和 N)用方框標出；PGNG結構域用虛線標出；3′端非編碼區(qū)硒代半胱氨酸插入序列用雙下劃線標出

2.2 大菱鲆GPx1基因的同源性和系統(tǒng)進化分析通過BLASTP對大菱鲆GPx1基因進行同源性分析，結果顯示大菱鲆GPx1與棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)和墨西哥麗脂鯉(Astyanaxmexicanus)同源性最高，分別為85.2%和84.5%；與鱇魚(Anabariliusgrahami)、白斑狗魚(Esoxlucius)；虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和北極紅點鮭(Salvelinusalpinus)同源性分別為82.4%、83.8%、80.9%和80.1%；與黃牛(Bostaurus)、家鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的同源性最低，分別為69.7%、68.3%和69.0%(圖2)。通過MEGA 4.0的Neighbor-Joining進行系統(tǒng)進化分析，所有動物的GPx1分為低等脊椎動物魚類和陸生脊椎動物兩支，其中，大菱鲆的GPx1與低等脊椎動物魚類中底鳉和攀鱸聚為一支，與黃牛、家鼠、馬和人等哺乳動物聚為另一支，說明大菱鲆與魚類親緣關系最近，與陸生哺乳動物親緣關系最遠(圖3)。

圖2 大菱鲆GPx1序列與其他物種GPx1氨基酸序列比對

圖3 大菱鲆GPx1與其他脊椎動物GPx1核苷酸序列的NJ進化樹分析

2.3 大菱鲆GPx1基因的組織轉錄水平RT-qPCR結果顯示，GPx1基因在大菱鲆不同組織中均有表達，其中在肝臟內相對表達水平最高，其次是心、腸、胃、鰓、頭腎組織，而在肌肉中的表達量最低(圖4)。

圖4 大菱鲆GPx1基因在不同組織中的表達分布

Real-time PCR檢測大菱鲆在注射金屬蛋白酶后不同時間肝臟中GPx1基因的表達情況(圖5)。結果顯示，與對照組相比，大菱鲆肝臟中GPx1基因在6～48 h均顯著低于對照組(P<0.05)，其中在24 h表達量最低(P<0.05)，但是隨著時間的推移，金屬蛋白酶組GPx1表達逐漸增加，于72 h恢復到初始水平。

*表示同一時間點金屬蛋白酶組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。下同

大菱鲆在注射金屬蛋白酶后頭腎中GPx1基因的表達情況結果表明，與對照組相比，在金屬蛋白酶脅迫后GPx1基因表達在3和48 h均顯著高于對照組(P<0.05)，其中在3 h時達到最大值，在12～24 h 顯著低于對照組(P<0.05)，于72 h達到對照組水平。金屬蛋白酶組在整個脅迫過程中均呈現(xiàn)先升高后下降再升高的波浪式變化趨勢(圖6)。

圖6 注射金屬蛋白酶后大菱鲆頭腎GPx1基因的表達情況

2.4 金屬蛋白酶對大菱鲆肝臟和頭腎組織GPx活力的影響大菱鲆注射金屬蛋白酶后，肝臟組織中GPx活力在6 h顯著高于對照組(P<0.05)，之后逐漸下降，在12～72 h均顯著低于對照組(P<0.05)(圖7)。

圖7 金屬蛋白酶對大菱鲆肝臟GPx活力的影響

在整個試驗過程中，金屬蛋白酶注射組頭腎組織中GPx活力在3 h顯著高于對照組(P<0.05)，而在12～72 h均顯著低于對照組(P<0.05)(圖8)。

2.5 金屬蛋白酶對大菱鲆肝臟和頭腎組織MDA含量的影響注射金屬蛋白酶后大菱鲆肝臟組織中MDA含量整體呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，除3 h 金屬蛋白酶處理組與對照組無顯著性差異外，其他時間點均顯著高于對照組(P<0.05)，且在48 h 達到最大值(圖9)；而頭腎組織中MDA含量出現(xiàn)先升高后下降再升高的波浪式變化趨勢，在整個試驗過程中，金屬蛋白酶處理組在3～6 h與對照組無顯著性差異，而在12～72 h均顯著高于對照組(P<0.05)(圖10)。

圖9 金屬蛋白酶對大菱鲆肝臟MDA含量的影響

圖10 金屬蛋白酶對大菱鲆腎臟MDA含量的影響

3 討論

本試驗利用RACE技術首次克隆了大菱鲆GPx1基因序列，該基因全長975 bp，包含429 bp的開放閱讀框，編碼1個由142個氨基酸殘基組成的蛋白質。序列分析發(fā)現(xiàn)，與其他魚類的GPx1一樣，大菱鲆GPx1基因編碼的氨基酸序列包括GPx家族標簽序列(LGVPCNQF和WNFEKF)以及PGNG結構域，另外在3′端非編碼區(qū)還包括硒代半胱氨酸插入序列[11-12]。與其他動物氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)，大菱鲆GPx1序列與其他魚類GPx1的同源性較高，均大于80%。系統(tǒng)進化分析表明大菱鲆GPx1與其他魚類聚為一支，其中與底鳉和攀鱸親緣關系最近，以上結果表明該序列為大菱鲆GPx1基因。

大菱鲆GPx1 mRNA的表達具有組織特異性，RT-qPCR結果顯示，大菱鲆GPx1基因在胃、心臟、腸、肝臟、鰓、腎臟和肌肉中均有表達(圖4)，其中，在肝臟和腸中表達量最高。有研究認為在肝臟中相對表達量最高可能是由于肝臟是生物體內的脂質代謝主要場所，該結果與淇河鯽GPx1基因表達結果相似[13]。而在腸中表達量高可能與大菱鲆是肉食性魚類容易造成氧化應激有關[14]，具體機制還需要進一步探討。

GPx是體內普遍存在的一種過氧化物分解酶，該酶具有保護細胞膜的結構、功能以及防止過氧化物的損害作用[15]。目前關于GPx1基因在病原菌侵染魚類的影響中已有相關報道[11,13]，但是關于GPx1在病原菌毒力因子脅迫下的影響未見相關報道。本試驗首次研究鰻弧菌金屬蛋白酶對大菱鲆肝臟和頭腎組織抗氧化酶和MDA含量的影響。結果顯示，注射金屬蛋白酶后大菱鲆肝臟和頭腎中GPx1的表達量均有明顯的時間差異性，大菱鲆肝臟中GPx1基因在3 h出現(xiàn)短暫上調后，在6～48 h顯著下調，分析原因可能是由于肝臟作為生物體內主要的解毒器官，該基因表達量的降低可能是為其他相關基因的表達提供能量[16]。腎臟作為魚類免疫器官，在魚類的免疫應答過程中起主要作用[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)大菱鲆在注射金屬蛋白酶后頭腎中GPx1基因首先在脅迫3 h表達量顯著升高即達到最大值，分析原因可能是由于金屬蛋白酶的毒性誘導大菱鲆體內活性氧增加，通過機體免疫系統(tǒng)短暫反饋性增強抗氧化酶相關基因的表達以清除體內多余的ROS，STEBBING等[17]稱該效應為“毒物的興奮效應”。之后GPx1基因表達逐漸下降，在脅迫12～24 h 顯著降低，呂昆倫等[10]認為頭腎中GPx1 mRNA表達出現(xiàn)下調的原因可能是機體要控制ROS穩(wěn)定在一個適度的水平。而在48 h GPx1 mRNA表達再一次顯著上調，有研究指出頭腎是魚類的主要造血器官，其抗氧化酶的表達上調有助于在造血過程中消除過量ROS帶來的損傷[18]。

近年來，采用GPx作為脅迫或免疫反應生物標記的研究報道屢見不鮮，主要通過測定其酶活性變化或mRNA轉錄水平來評估動物的抗氧化或健康狀態(tài)[19-20]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，中、高濃度組金屬蛋白酶均能夠引起大菱鲆GPx活性發(fā)生變化[21]。本試驗結果也顯示，注射金屬蛋白酶后頭腎和肝臟組織中GPx活性分別于3 和6 h達到最大值，且顯著高于對照組，推測可能是由于機體通過短暫提高GPx活性來抑制機體產(chǎn)生過多的ROS[22]。但隨著時間的推移，兩種組織均在12～72 h 顯著低于對照組，分析可能是因為體內的ROS產(chǎn)生較多，故在該時間段內GPx一直處于被抑制的結果。有研究認為魚類在長時間受到氧化脅迫，一些組織器官由于氧化應激產(chǎn)生的自由基會持續(xù)聚集，輕則引起細胞生物膜脂質過氧化、酶失活和DNA 損傷，重則引起機體組織病變[23]。本試驗還發(fā)現(xiàn)注射金屬蛋白酶后大菱鲆頭腎組織GPx1基因/酶活力比肝臟先上調，推測可能是由于頭腎組織作為機體免疫器官對毒物刺激較肝臟更敏感。王卓等[2]研究認為主要與腎臟和肝臟組織器官的生理功能不同有關。本試驗還發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶脅迫下大菱鲆同一組織對GPx基因轉錄以及酶活性影響的變化趨勢不同，這一現(xiàn)象與重金屬對淇河鯽魚GPx的影響類似[24]，導致這種現(xiàn)象的原因可能是由于組織中檢測到的酶活性為不同同工酶的總酶活性，但mRNA的轉錄水平僅限于編碼單一同工酶的特定抗氧化基因亞型[25]。

超量ROS能夠導致機體脂質過氧化程度加劇，脂質過氧化產(chǎn)物增加，作為機體脂質過氧化產(chǎn)物的MDA，其含量可以間接反映機體細胞受損傷程度[26]。本試驗結果顯示，肝臟和頭腎組織中MDA 均有不同程度的升高，分別在6～72 h和12～72 h顯著高于對照組(P<0.05)。推測可能是由于高濃度金屬蛋白酶隨著脅迫時間的延長引起了機體氧化損傷，產(chǎn)生大量ROS，最終導致大菱鲆不同組織中脂質過氧化產(chǎn)物MDA增加。蘇秀梅[27]研究也發(fā)現(xiàn)魚源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外蛋白酶對小鼠和斑點叉尾鮰均能致死，病理組織檢測證實該蛋白酶對小鼠和斑點叉尾鮰多器官都造成明顯的損傷。進一步推測鰻弧菌金屬蛋白酶脅迫下MDA的積累引起的氧化損傷可能是該蛋白酶對大菱鲆產(chǎn)生毒害作用的主要原因。另外，本試驗還發(fā)現(xiàn)肝臟中MDA含量升高較頭腎組織早，分析可能與肝臟是機體主要的解毒代謝器官有關。