王朋林，陳凱麗，鄭 玲，劉林科，王榮軍，張龍現(xiàn)，寧長申，菅復(fù)春 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬囊孢球蟲(Cystoisosporasuis)原名豬等孢球蟲(Isosporasuis)，歸類于真球蟲目(Eucoccidiorida)、肉孢子球蟲科(Sarcosporidae)、囊等孢球蟲屬(Cystoisospora)。豬囊孢球蟲可感染不同品種和不同年齡階段的豬，尤其對哺乳仔豬的危害最為嚴重，臨床癥狀可表現(xiàn)為非出血性腹瀉[1]，治療不當會導(dǎo)致僵豬或死亡，嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)是一種可感染人和多種動物胃腸道的人獸共患病原。1985年首次在艾滋病(HIV)患者中發(fā)現(xiàn)[2]。一般情況下，感染此病原后免疫功能正常的機體無明顯的臨床癥狀，但對HIV患者和免疫功能低下的兒童會造成持續(xù)性腹瀉并伴有發(fā)熱、食欲下降和體質(zhì)量減輕等癥狀[3]。此外，畢氏腸微孢子蟲感染宿主廣泛，如非人靈長類動物(NHP)、反芻動物、哺乳動物、嚙齒動物等，并對它們的胃腸道造成嚴重損傷，因此引起世界各國研究者的高度關(guān)注[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，具有簡便、快速、準確等優(yōu)點的PCR檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種腸道原蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查[5-7]。目前尚無關(guān)于豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的雙重nest-PCR方法，本研究旨在建立一種快速、準確、簡便、可同時診斷豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的雙重nest-PCR方法，以期能快速鑒定兩種病原，為豬腸道原蟲病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病原豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲均由本實驗室分離鑒定;大腸桿菌菌株由本院微生物學(xué)實驗室饋贈。

1.2 試劑KOD plus DNA聚合酶、TAE緩沖液、瓊脂糖、雙蒸水、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa有限公司；E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA有限公司。

1.3 引物合成使用DNAStar等工具對2對nest-PCR引物兼容性進行檢測，避免各組引物間形成二聚體。2對引物均由上海生物工程公司合成。

表1 雙重nest-PCR引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.4 DNA 模板的制備取待檢豬的陽性糞便20～50 g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本180～220 mg至1.5 mL離心管中，按E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒提取說明書提取模板DNA。

1.5 雙重nest-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化在豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲單病原檢測nest-PCR檢測方法穩(wěn)定反應(yīng)的基礎(chǔ)上，將豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的DNA等量混勻物作為模板，對雙重nest-PCR中的引物比、Buffer、dNTPs、酶、Tm值、循環(huán)數(shù)等各項反應(yīng)條件進行優(yōu)化，篩選雙重nest-PCR擴增的最佳反應(yīng)體系和條件。

1.6 特異性試驗將分別用傳統(tǒng)鏡檢及nest-PCR鑒定后確定的豬囊孢球蟲與畢氏腸微孢子蟲混合物、豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲和大腸桿菌等DNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物用于1 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 敏感性試驗使用Nano Drop 2000超微量分光光度計分別測量豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲質(zhì)粒標準品的濃度，并進行PCR擴增。豬囊孢球蟲質(zhì)粒標準品的原始質(zhì)量濃度為209 mg/L(D260/D280=1.86)，畢氏腸微孢子蟲質(zhì)粒標準品的原始質(zhì)量濃度為527 mg/L(D260/D280=1.84)，D260/D280=1.80～2.00時，證明核酸純度較好。分別將兩種病原的質(zhì)粒標準品進行10倍倍比稀釋(豬囊孢球蟲：209～209×10-8mg/L；畢氏腸微孢子蟲：527～527×10-8mg/L)后作為模板，進行豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲雙重nest-PCR方法的敏感性試驗。

1.8 重復(fù)性試驗使用建立的雙重nest-PCR方法隨機選擇3個混合感染豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲DNA樣品進行重復(fù)性檢測，以保證該方法對豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲檢測的穩(wěn)定性與可行性。

1.9 臨床樣品的檢測用本試驗建立的雙重nest-PCR方法對采自河南信陽的48份豬糞便DNA樣品進行PCR檢測，并與豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的單病原nest-PCR方法進行比較。檢測結(jié)果通過雙向測序，對基因序列進行比對分析以排除假陽性。

2 結(jié)果

2.1 雙重nest-PCR引物比優(yōu)化結(jié)果將畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲引物比分別按照1.00∶0.25、1.00∶0.50、1.00∶0.75、1.00∶1.00進行擴增。結(jié)果顯示畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲的引物量的比為1.0∶0.25時有穩(wěn)定雙條帶出現(xiàn)。圖1為3個不同的畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲DNA混合物在兩者引物量比為1.00∶0.25時的擴增結(jié)果。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.畢氏腸微孢子蟲和豬囊孢球蟲DNA混合物；4.陰性對照

2.2 雙重nest-PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果結(jié)果顯示，雙重nest-PCR在50～60℃范圍內(nèi)擴增效率變化不大，由于豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲單重nest-PCR 2次擴增的退火溫度分別為57和55℃，因此本試驗選擇將第1輪、第2輪退火溫度分別確定為57、55℃(圖2、3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.分別為60.0、59.2、58.0、57.0、56.1、53.8、51.9、50.7、50.0℃；10.陰性對照

2.3 雙重nest-PCR特異性試驗結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲混合物、豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲均擴增出相應(yīng)的特異性條帶，而安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲、大腸桿菌均未擴增出特征性條帶，證明本試驗特異性良好(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.微孢子蟲+豬囊孢球蟲、豬囊孢球蟲、微孢子蟲、安氏隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲、芽囊原蟲、E.coli;8.陰性對照

2.4 雙重nest-PCR敏感性試驗結(jié)果按照已優(yōu)化的反應(yīng)條件及體系進行雙重nest-PCR敏感性試驗，DNA模板與豬囊孢球蟲、畢氏腸微孢子蟲單病原nest-PCR試驗相同。結(jié)果顯示，豬囊孢球蟲的最低檢測限為209×10-5mg/L，畢氏腸微孢子蟲的最低檢測限為527×10-7mg/L(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分別為2種病原質(zhì)粒10倍倍比稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；10.陰性對照；6.209×10-5 μg/L;8.527×10-7 μg/L

2.5 雙重nest-PCR重復(fù)性試驗結(jié)果用建立的雙重nest-PCR方法隨機選擇3個豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的陽性DNA樣品進行重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示，雙重nest-PCR方法檢測豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.樣品；4.陰性對照

2.6 雙重nest-PCR臨床樣品檢測用本試驗建立的豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲雙重nest-PCR方法對采自信陽的48份豬糞便DNA樣品進行PCR擴增，單病原nest-PCR擴增豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲感染陽性率分別為12.50%(6/48)和22.92%(11/48)，混合感染陽性率為4.17%(2/48)；雙重nest-PCR豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲感染陽性率分別為20.83%(10/48)和8.33%(4/48)，混合感染陽性率為4.17%(2/48)；單重nest-PCR和雙重nest-PCR檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明建立的雙重nest-PCR可用于臨床檢測。

表2 單重nest-PCR和雙重nest-PCR對豬臨床糞便樣品檢測結(jié)果比較

3 討論

多重nest-PCR反應(yīng)是在同一反應(yīng)體系中，同時加入多個特異性引物進行擴增，但多對引物之間的配比、相互競爭及抑制等均會影響多重nest-PCR的擴增結(jié)果[8]，因此，篩選合適的引物并調(diào)整最佳引物配比，是保證試驗順利進行的基本要素。此外，合適的多重nest-PCR引物不但要求能特異和敏感地擴增出目的條帶，各引物間還要有相近的退火溫度和循環(huán)數(shù)。本試驗所選擇的2對引物，其GC%含量和Tm值相近，為豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲均能得到良好的擴增以及雙重nest-PCR方法的建立奠定了基礎(chǔ)。本試驗初期進行雙重nest-PCR反應(yīng)時，將豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲引物按等量加入，同時擴增兩個特異性基因時，豬囊孢球蟲的擴增效率高于畢氏腸微孢子蟲的擴增效率。因此，可通過調(diào)整加入的引物量比來實現(xiàn)使各引物的擴增效率相近的產(chǎn)物[9]。

豬囊孢球蟲單病原nest-PCR的敏感度為209×10-6mg/L，敏感性比雙重nest-PCR高10倍；畢氏腸微孢子蟲單病原nest-PCR最低檢測限限為527×10-9mg/L，與雙重nest-PCR敏感性相比高100倍，這與彭武麗等[10]報道的單PCR敏感性高于多重PCR敏感性一致，但處于可接受水平。造成此敏感性差異的原因眾多，比如引物之間的互作和反應(yīng)參數(shù)的差異等。本研究同時使用單nest-PCR方法和建立的雙重nest-PCR方法對采自信陽的48份糞便DNA樣品進行檢測。結(jié)果表明，單nest-PCR的檢出率略高于雙重nest-PCR，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，單nest-PCR和雙重nest-PCR檢測結(jié)果差異并不顯著(P>0.05)。這一結(jié)論與MORIO等[11]對首個商業(yè)化檢測糞樣中的隱孢子蟲、腸畢氏微孢子蟲和腸腦炎微孢子蟲多重PCR試劑盒的評估結(jié)果相一致。究其原因可能是因為雙重nest-PCR中同時加入了兩種腸道病原引物，增加了干擾因素，在一定程度上降低了目的基因片段的擴增效率，但誤差仍處于可接受范圍內(nèi)。雙重nest-PCR方法與單重nest-PCR方法相比，只做1次nest-PCR擴增就可同時檢測出2種病原，大大節(jié)省試驗時間、精力和試劑消耗，顯著提高檢測效率。綜上所述，本研究所構(gòu)建的雙重nest-PCR方法具有良好的敏感性、特異性，可用于臨床樣品的檢測。