范 晴，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思 (廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001)

牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea disease virus,BVDV)是2種常見(jiàn)牛腹瀉病毒，癥狀相似，難以區(qū)分。BVDV臨床上常出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、黏膜損傷和趾部損傷，但大多數(shù)感染BVDV的牛為持續(xù)性感染且不表現(xiàn)臨床癥狀，一旦再次接觸相似性抗原便會(huì)繼發(fā)為黏膜病，病死率100%。持續(xù)感染的?？赏ㄟ^(guò)血液、排泄物等多種途徑水平傳播病毒，還可通過(guò)生殖道垂直傳播，且終身帶毒，持續(xù)排毒，成為牛場(chǎng)腹瀉癥的重要傳染源，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)存在潛在危害。BRV主要感染1～30日齡初生犢牛，可引起犢牛腹瀉、脫水、嘔吐和酸堿平衡[1-4]。2種病毒經(jīng)常混合感染，感染后病程加重，我國(guó)每年因腹瀉病引起的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，因此急需建立這2種病的快速檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)BRV和BVDV的防控提供技術(shù)支持。

目前常用的診斷方法主要有血清學(xué)方法、病原分離和分子生物學(xué)方法(RT-PCR和熒光RT-PCR)[5-8]。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種基于PCR發(fā)展起來(lái)的新興核酸擴(kuò)增技術(shù)，它解決了PCR多溫度擴(kuò)增的技術(shù)難點(diǎn)，采用恒溫?cái)U(kuò)增，6條引物(針對(duì)8個(gè)區(qū)域)同時(shí)擴(kuò)增效率增加、敏感性高、特異性好，經(jīng)常應(yīng)用于疾病診斷及基因篩選[9-12]。多重LAMP是一種高效的LAMP形式，一次LAMP反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)、鑒別多種病原體。但目前國(guó)內(nèi)的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能準(zhǔn)確地檢測(cè)是哪一種病原引起的陽(yáng)性結(jié)果，都沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正意義上的鑒別診斷。本研究建立的BRV和BVDV二重RT-LAMP方法，在LAMP引物中標(biāo)記熒光基團(tuán)，反應(yīng)后通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色讀取反應(yīng)結(jié)果，可準(zhǔn)確鑒別診斷BVDV和BRV兩種病毒。

1 材料與方法

1.1 毒株及試劑14株BVDV廣西分離株、8株BRV廣西分離株、3株牛支原體(MB)和3株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)由廣西獸醫(yī)研究所分離保存；3株BVDV、1株牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)和2株BRV購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；水泡性口炎病毒(VSV)(新澤西NJ型和印第安IND型)、藍(lán)舌病病毒(BTV)(4型、8型、9型、15型、17型、18型)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)(O型、A型、AsiaⅠ型)由昆明海關(guān)惠贈(zèng)。本研究所使用的病毒毒株和菌株來(lái)源如表1所示。RNA病毒使用RNA抽提試劑盒(全世金，北京)抽提毒株的RNA，-70℃保存；IBRV和ETEC使用全世金DNA抽提試劑盒(全世金，北京)提取DNA，-20℃保存，備用。

表1 毒株和菌株來(lái)源

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中BVDV的5′端非編碼區(qū)(5′UTR)和BRV的VP6基因保守序列，利用DNAStar MegAlign進(jìn)行分析比對(duì)，用Primer Explore V4設(shè)計(jì)2套LAMP引物。每套引物包括4條引物(針對(duì)6個(gè)位點(diǎn))：外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，在每條內(nèi)引物FIP的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)：BVDV標(biāo)記FITC熒光，520 nm波長(zhǎng)下呈黃綠色，BRV標(biāo)記CY5.5熒光，694 nm波長(zhǎng)下呈大紅色(圖1)。引物均由大連寶生物公司合成。

圖1 二重?zé)晒釸T-LAMP引物示意圖

1.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化25 μL反應(yīng)體系包括如下成份：10×LAMP buffer 2.5 μL、200 mmol/L Tris-HCl、80 mmol/L MgSO4、100 mmol/L KCl、100 mmol/L(NH4)2SO4、8 mol/L甜菜堿、1% 吐溫20、14 mmol/L dNTPs(Sigma，東京，日本)、Bst DNA聚合酶3.0(New England Biolabs,MA,USA)15 U、內(nèi)引物各40 pmol(BVDV-FIP、BVDV-BIP、BRV-FIP和BRV-BIP)、外引物各5 pmol(BVDV-F3、BVDV-B3、BRV-B3和BRV-F3)、RNA模板1 μL。各組份混合均勻，恒溫儀或水浴中 63℃(或60～67℃范圍內(nèi)均可反應(yīng))反應(yīng)90 min，80℃作用5 min 結(jié)束反應(yīng)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備用PCR(premixTaq，TaKaRa，大連)擴(kuò)增BVDV外引物(BVDV-B3，BVDV-F3)228 bp片段和BRV外引物(BRV-B3，BRV-F3)215 bp片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連入pGM-T載體(天根，北京)，轉(zhuǎn)DH5α大腸桿菌培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑和PCR篩選陽(yáng)性重組菌，用質(zhì)粒抽提試劑盒(MidiPlasmidkid，天根，北京)提取重組質(zhì)粒。參照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為RNA，用核酸測(cè)定儀Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)D260測(cè)定體外轉(zhuǎn)錄RNA的濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)×10-9×6.02×1023/660×3 100(質(zhì)?？傞L(zhǎng)度)。將計(jì)算好拷貝數(shù)的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋至濃度為1×107～1拷貝/μL，再將同稀釋度的2種體外轉(zhuǎn)錄RNA等體積混合，制備成RNA標(biāo)準(zhǔn)品(含有BVDV和BRV特異性片段)，-70℃保存?zhèn)溆茫糜隍?yàn)證二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)方法的敏感性。

1.5 干擾性試驗(yàn)人工制備模擬混合感染樣品，將BRV和BVDV RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品按不同濃度進(jìn)行混合：樣品1(105BVDV+102BRV)、樣品2(107BVDV+103BRV)、樣品3(102BVDV+106BRV)、樣品4(103BVDV+106BRV)。用二重RT-LAMP檢測(cè)，以測(cè)試高濃度模板是否會(huì)搶奪反應(yīng)試劑資源，抑制低濃度模板的擴(kuò)增。

表2 引物序列

1.6 臨床樣品檢測(cè)從廣西各地牛場(chǎng)采集144份腹瀉牛的糞便棉拭子，用PBS洗脫后5 000×g離心5 min，取250 μL上清抽提病毒RNA，抽提好的RNA同時(shí)用二重RT-LAMP和熒光RT-PCR檢測(cè),熒光RT-PCR具體操作參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，將熒光RT-PCR陽(yáng)性樣品送廣州華大基因公司測(cè)序鑒定，以排除非特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果為了評(píng)估已建立的二重?zé)晒釸T-LAMP方法的特異性，對(duì)表1中常見(jiàn)牛病原體病進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，該方法只擴(kuò)增BRV和BVDV以及BRV和BVDV混合模板。BRV陽(yáng)性條帶呈紅色，僅在670通道下能看到；BVDV陽(yáng)性條帶呈黃綠色，僅在520通道下能看到；BVDV和BRV混合模板條帶呈紅綠色混合，在520和670兩個(gè)通道下都能觀察到，與其他牛病原體及陰性對(duì)照均無(wú)反應(yīng)(圖2)，該方法特異性好。

A.520通道下電泳圖;B.670通道下電泳圖;C.520和670雙通道下電泳圖

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果用已建立的二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)BRV和BVDV混合模板標(biāo)準(zhǔn)品,結(jié)果如圖3，圖3A,B,C是在不同通道下的電泳圖，圖3D為實(shí)時(shí)濁度圖(由濁度儀loopam LA-320C生成)，二重?zé)晒釸T-LAMP最低可檢測(cè)到100個(gè)BVDV RNA和100個(gè)BRV RNA，可見(jiàn)該方法靈敏性高。

1～7.106～1拷貝/μL(BVDV和BRV RNA混合模板標(biāo)準(zhǔn)品);8.陰性對(duì)照

2.3 干擾性試驗(yàn)結(jié)果在同一反應(yīng)管中存在不同濃度的2種模板時(shí)，高濃度的模板不會(huì)搶奪試劑資源，低濃度模板也不會(huì)被抑制，2種模板能相互不影響實(shí)現(xiàn)均一穩(wěn)定的擴(kuò)增，由此可見(jiàn)該二重?zé)晒釸T-LAMP可同時(shí)檢測(cè)到BVDV和BRV 2種模板(圖4)，干擾性小。

1.105 BVDV+102 BRV;2.107 BVDV+103 BRV;3.102 BVDV+106 BRV;4.103 BVDV+106 BRV

2.4 臨床樣品檢測(cè)對(duì)144份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果如下，熒光RT-PCR檢出BVDV 24份，感染率為18.1%[(24+2)/144]、BRV 9份,感染率為7.6%[(9+2)/144]、BVDV和BRV混合感染2份,感染率為1.4%(2/144)；二重RT-LAMP檢出BVDV 24份，BRV 9份、BVDV和BRV混合感染2份。與熒光RT-PCR方法相比二重RT-LAMP方法敏感性為100.0%，特異性為100.0%?？寺∷械年?yáng)性樣品熒光RT-PCR擴(kuò)增片段，經(jīng)測(cè)序鑒定均為陽(yáng)性。結(jié)果表明，二重RT-LAMP與熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相同。

3 討論

LAMP是2000年日本研究者NOTOMI等[13]首先開(kāi)發(fā)出的一種新興恒溫核酸擴(kuò)增方法，它反應(yīng)快速，只需1 h就能完成；操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可憑肉眼讀取；成本低，只需要一個(gè)水浴鍋就能完成反應(yīng)，基于LAMP的這些優(yōu)點(diǎn)，得到了眾多研究者的青睞。但LAMP也有其局限性就是很難進(jìn)行多重檢測(cè)，其原因是LAMP的3種結(jié)果判定方法(觀察白色沉淀物、加染料看顏色變化和電泳)無(wú)論是多重還是單重檢測(cè)，呈現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果都一樣，不能準(zhǔn)確的判斷出是由哪種病原所引起的，因此很難實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。

目前我國(guó)雖然已有學(xué)者建立相關(guān)多重LAMP檢測(cè)的報(bào)道，但都不是真正的鑒別檢測(cè)，不能廣泛的應(yīng)用在臨床檢測(cè)。劉寧偉等[14]建立了多重LAMP檢測(cè)沙門菌、副溶血弧菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌；趙軍等[15]建立二重LAMP檢測(cè)雞蛋中蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌；陳兵等[16]建立禽流感、新城疫和傳染性法氏囊3種家禽病毒多重RT-LAMP檢測(cè)方法，這3種方法都是在同一反應(yīng)體系中加入多套LAMP引物共同反應(yīng)，這樣只能粗略地檢測(cè)樣品是攜帶病原體，但不能準(zhǔn)確地鑒別診斷到底是何種病原體。姜侃等[17]建立食品中產(chǎn)毒素性霍亂弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲線檢測(cè)方法，該方法仍需借助在熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，并在反應(yīng)后使用熔解曲線分析才能確診病原，對(duì)儀器設(shè)備要求高，耗時(shí)長(zhǎng)，且熔解曲線分析菜花狀LAMP產(chǎn)物，準(zhǔn)確率低。王彩霞等[18]建立同時(shí)檢測(cè)貝類派琴蟲(chóng)和包納米蟲(chóng)的雙重LAMP方法，在引物中添加酶切位點(diǎn)，反應(yīng)后對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)電泳檢測(cè)，通過(guò)目的片段的大小來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的判定結(jié)果，此方法操作復(fù)雜，易造成實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染。本研究首次在引物上標(biāo)記了2種新型熒光基團(tuán)，CY5.5和FITC,2種熒光基團(tuán)的吸收光和激發(fā)光均不同，因此在不同的波長(zhǎng)下可呈現(xiàn)不同的顏色，例如CY5.5吸收波為670 nm，呈大紅色，F(xiàn)ITC吸收波為520 nm，呈黃綠色。不同的熒光基團(tuán)，只能在與其匹配的特定通道下觀察到，即在670通道下只能看到CY5.5，無(wú)法觀察到FITC，比起觀察白沉淀物、加染料觀察顏色變化等方式更準(zhǔn)確。熒光基團(tuán)標(biāo)記在內(nèi)引物FIP的5′端，擴(kuò)增過(guò)程中比普通引物需要消耗更多的自由能，DNA模板分子與引物碰撞需要高度配合，可以有效減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)，這是首次實(shí)現(xiàn)了真正意義上的多重LAMP鑒別診斷。

表3 二重RT-LAMP和熒光RT-PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果比較 份

LAMP方法的擴(kuò)增，不需要使用復(fù)雜儀器設(shè)備，只需要一個(gè)能控溫的恒溫水浴鍋，可在條件簡(jiǎn)陋的基層使用，如獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢疫。若在現(xiàn)場(chǎng)檢疫只需要檢測(cè)出腹瀉病陽(yáng)性樣品，不需要區(qū)分是BVDV或是BRV時(shí)，可以在反應(yīng)后添加染料，用肉眼觀察顏色變化直接讀取結(jié)果。使用鈣黃綠素為染料，將25 μmol/L鈣黃綠素與300 μmol/L氯化錳按10∶1配制為熒光染料工作液，每個(gè)反應(yīng)中加入1 μL熒光染料與反應(yīng)試劑一起反應(yīng)，反應(yīng)后觀察反應(yīng)管顏色，反應(yīng)管呈黃綠色為陽(yáng)性，橙色為陰性。二重?zé)晒釸T-LAMP電泳時(shí)不需要使用Marker，原因是LAMP產(chǎn)物是一些長(zhǎng)度不等的DNA片段混合物，電泳后呈現(xiàn)梯狀條帶，Marker對(duì)這些片段無(wú)指示意義。本研究使用Bst DNA 聚合酶3.0,該聚合酶不僅擴(kuò)增效率高，而且具備反轉(zhuǎn)錄功能，因此反應(yīng)體系中不需要再加入反轉(zhuǎn)錄酶也可以完成反應(yīng)，省時(shí)省成本。

本研究設(shè)計(jì)了2套針對(duì)BVDV和BRV的特異性LAMP引物，優(yōu)化引物配比及反應(yīng)條件，成功建立了在同一反應(yīng)管里鑒別診斷BVDV和BRV二重?zé)晒釸T-LAMP檢測(cè)方法。該方法特異性好，并對(duì)其他病原核酸不發(fā)生非特異性擴(kuò)增，靈敏度高，每個(gè)反應(yīng)最低能檢測(cè)到100個(gè)拷貝病毒RNA混合模板，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，只需一臺(tái)普通水浴鍋即可完成，具有特異、敏感、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛腹瀉病流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢測(cè)。