商佳亮，騰召劍，陳立功，倪福太，宋勤葉*，周雙海 (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 07000；.吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 36000；3.北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 006)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可引起妊娠母豬厭食、發(fā)熱，懷孕后期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎兒或弱仔，仔豬和生長肥育豬呼吸困難、間質(zhì)性肺炎以及免疫功能抑制等臨床癥狀與病理變化。該病毒是當今危害全球養(yǎng)豬生產(chǎn)最重要的病原之一[1-4]。20世紀80年代中后期，PRRSV在北美洲和歐洲幾乎同時暴發(fā)，隨后在世界各地相繼流行，1996年郭保清等[5]首次從我國豬場的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離鑒定到該病毒。自PRRSV暴發(fā)流行以來，每年該病毒均給我國和世界其他國家的養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。

PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)成員，是一種單股正鏈RNA病毒。依據(jù)病毒的核苷酸序列和血清學(xué)反應(yīng)特征，PRRSV可分為PRRSV-1型(歐洲型)和PRRSV-2型(北美洲型)兩個基因型，其中PRRSV-2型為我國流行的主要基因型[6-7]。PRRSV容易變異，從1995年我國首次暴發(fā)PRRSV至今，豬場流行的PRRSV毒株歷經(jīng)經(jīng)典毒株、高致病性毒株(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)及類NADC30毒株的明顯變異[6,8-9]。目前豬場流行的PRRSV以類NADC30毒株和HP-PRRSV毒株為主，經(jīng)典毒株在一些豬場零星散發(fā)[8,10-11]。對臨床PRRS疑似病例做出快速診斷、了解豬群的感染狀況對于PRRSV的有效防控具有重要意義。已有鑒別PRRSV經(jīng)典毒株、高致病性毒株或歐洲毒株的多重PCR方法[12-13]，但尚未見到鑒別類NADC30、高致病性與經(jīng)典PRRSV毒株的PCR檢測方法的研究報道。本研究建立了應(yīng)用1對引物即可鑒別PRRSV類NADC30、高致病性與經(jīng)典毒株的PCR檢測方法，并進行初步應(yīng)用，以期為臨床病例的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 毒株與菌株高致病性PRRSV弱毒疫苗株JXA1購自中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠；豬經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗株CH-1R購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；PRRSV類NADC30毒株HBDZ2019、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室分離鑒定；豬瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗株(細胞源)購自遼寧益康生物股份有限公司；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)購自中國獸藥監(jiān)察所；大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細胞DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒購自深圳真瑞生物科技有限公司；2×Taq MasterMix(含染料)購自北京康為試劑生物科技有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。

1.3 病料2017-2019年從河北保定、石家莊、邢臺、邯鄲等地采集的PRRSV感染患病豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織，共38份。

1.4 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中公布的PRRSV經(jīng)典毒株(GenBank收錄號：AY032626)、高致病性毒株(GenBank收錄號：EF112445)與NADC30毒株(GenBank收錄號：JN654459)的核苷酸序列，運用Oligo6.0軟件設(shè)計3條針對PRRSV ORF1a核苷酸序列的特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 設(shè)計的PCR引物列表

1.5 病毒核酸提取與cDNA的合成根據(jù)病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒說明，提取PRRSV CH-1R、JXA1-R和類NADC30株細胞毒的RNA,然后按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RNA反轉(zhuǎn)錄過程：在滅菌的無RNA酶的1.5 mL離心管內(nèi)分別加入不同病毒的RNA 9 μL和隨機引物(25 pmol/L)1 μL，混勻，置71℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)5 min；取出離心管，立即冰浴5 min,瞬時離心，加入5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、dNTP(10 mmol/L)4 μL、RNA 酶抑制劑(20 U)1 μL、M-MLV(200 U)1 μL，混勻，置37℃反轉(zhuǎn)錄1 h，70℃作用5 min后備用。

1.6 引物的篩選以PRRSV CH-1R、JXA1-R、類NADC30株或3個毒株的核酸cDNA混合物為模板，分別用引物F1-R1或F1-R2進行PCR。PCR體系為20 μL，包括2×Taq MasterMix 10 μL、上下游引物各0.5 μL(25 pmol/L)、模板2 μL與滅菌雙蒸水(ddH2O)7 μL，瞬時離心混勻后進行PCR擴增。PCR擴增參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，59℃ 1 min，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)后72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，檢查不同引物的擴增效率，篩選最佳引物。同時純化回收用所篩選引物擴增的目的條帶，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.7 退火溫度的優(yōu)化在不同退火溫度下，以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類NADC30株的核酸cDNA為模板，用篩選的引物進行梯度PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中各成分組成與1.6中所述的一致。梯度PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，58～62℃ 1 min，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72℃總延伸10 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分析比較不同退火溫度下的PCR擴增效率，確定最佳退火溫度。

1.8 引物含量的優(yōu)化將上、下游引物分別稀釋為40、30、20、10 pmol/L，然后以PRRSV CH-1R、JXA1-R、類NADC30株以及三者的核酸cDNA混合物為模板，分別進行PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq MasterMix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL與ddH2O 7 μL。擴增參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，58℃ 1 min，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72℃總延伸10 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，比較不同引物濃度下的PCR擴增結(jié)果，確定最佳引物用量。

1.9 敏感性檢測將CH-1R(0.608 mg/L)、JXA1-R(6.93 mg/L)與類NADC30(29.67 mg/L)毒株的cDNA混合，用ddH2O做101～106倍系列稀釋。以稀釋后的cDNA作為模板(2 μL/反應(yīng))進行PCR，測定方法的敏感性。

1.10 特異性檢測提取PCV2、CSFV、PRV、PEDV、TGEV核酸，用建立的PCR方法檢測，同時設(shè)立PRRSV CH-1R、JXA1-R和類NADC30株以及三者的核酸cDNA混合物模板對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，判定方法的特異性。

1.11 臨床樣本檢測用建立的PCR方法檢測2017-2019年收集的38份臨床PRRSV感染病豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織，分析不同毒株的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 引物的選擇分別以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類NADC30毒株的核酸cDNA為模板，用引物F1-R1或F1-R2進行PCR擴增。結(jié)果兩對引物均能針對毒株CH-1R、JXA1-R或類NADC30擴增出預(yù)期大小的核酸片段。序列測定顯示，各個片段的核酸序列與相應(yīng)參考毒株的序列一致。當模板中同時含有PRRSV經(jīng)典、高致病性和類NADC30毒株核酸時，均可以同時擴增出3個不同大小的DNA片段，但使用引物F1-R1進行PCR時，擴增效率更高(圖1)，故選擇F1-R1用于后續(xù)試驗。

1.DL100 DNA Ladder Marker；2～5.引物F1-R1,模板分別為毒株CH-1R、JXA1-R、類NADC30及其核酸混合物；6～9.引物F1-R2,模板分別為毒株CH-1R、JXA1-R、類NADC30及及其核酸混合物；10.水對照

2.2 確定退火溫度以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類NADC30株的核酸cDNA為模板，用引物F1-R1進行梯度PCR。結(jié)果如圖2所示，退火溫度在58～62℃時能擴增出預(yù)期大小的目的條帶，但當退火溫度在59.8～62℃時，針對JXA1-R毒株的擴增效率顯著下降；當退火溫度高于60℃時，針對CH-1R株和類NADC30株的擴增效率也明顯下降；因此，選擇58℃為該PCR的退火溫度。

A.CH-1R株;B.JXA1-R株;C.類NADC30株(1.DL100 DNA Ladder Marker;2～7.退火溫度分別為58.0、59.0、59.8、60.0、61.0和62.0℃)

2.3 確定引物含量當上、下游引物濃度為20、30或40 pmol/L，即PCR反應(yīng)體系中引物含量為10、15或20 pmol時，均能擴增出針對CH-1R、JXA1-R、類NADC30株的預(yù)期大小的DNA產(chǎn)物，擴增效率高。但是當引物濃度降低到10 pmol/L，即體系中引物含量為5 pmol時，擴增效率顯著下降(圖3)，故將該PCR擴增體系中引物的最適含量為10 pmol。

1.DL100 DNA Ladder Marker;2～5、6～9、10～13、14～17.引物量分別為20、15、10和5 pmol,用每個引物濃度進行PCR擴增時的模板依次為PRRSV CH-1R、JXA1-R、類NADC30毒株及其混合物

2.4 敏感性檢測將CH-1R株、JXA1-R株、類NADC30毒株的cDNA混合模板系列稀釋后進行PCR，結(jié)果如圖4所示，CH-1R株、JXA1-R株與類NADC30株的cDNA最低檢出量分別為12.16、138.70和59.30 pg。

1.DL100 DNA Ladder Marker;2～7.模板稀釋101、102、103、104、105、106倍(2 μL/反應(yīng))；CH-1R株、JXA1-R株和類NADC30毒株的cDNA起始質(zhì)量濃度分別為0.608、6.930與29.670 mg/L

2.5 特異性檢測以PCV2、CSFV、PRV、PEDV、TGEV等病毒的核酸為模板，用建立的PCR方法檢測，結(jié)果均沒有擴增到預(yù)期大小的核酸產(chǎn)物(圖5)，而單一PRRSV CH-1R、JXA1-R、類NADC30毒株或三者核酸混合的模板均擴增到了相應(yīng)目的片段，表明建立的方法具有很高的特異性。

1.DL100 DNA Ladder Marker;2.CH-1R;3.JXA1-R;4.類NADC30;5.不同PRRSV毒株混合;6.PCV2;7.CSFV;8.PRV;9.PEDV;10.TGEV

2.6 臨床應(yīng)用用建立PCR檢測38份病料顯示，PRRSV全部陽性，其中類NADC30毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株的檢出率分別為89.5%(34/38)、26.3%(10/38)和7.9%(3/38)；類NADC30毒株與高致病性毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株以及類NADC30毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株混合感染的檢出率分別為18.4%(7/38)、7.9%(3/38)和2.6%(1/38)。該檢測結(jié)果表明，當前河北省豬場類NADC30毒株的感染率超過了高致病性毒株，成為當?shù)亓餍械膬?yōu)勢毒株，并且呈現(xiàn)在一個豬場內(nèi)同時有不同毒株流行的復(fù)雜感染狀態(tài)。

3 討論

遺傳多樣性是PRRSV的主要特征，PRRSV-1型和PRRSV-2型在我國豬場均有流行，但各地流行的毒株以PRRSV-2型為主，1型主要處于零星散發(fā)狀態(tài)[7-8,11]。從1995年以來，我國豬場流行PRRSV優(yōu)勢毒株經(jīng)歷了2次明顯變化，即2006年的第1次變化，經(jīng)典毒株(以CH-1a或BJ-4為代表毒株)的檢出率逐漸降低，取而代之的是高致病性毒株(以JXA1為代表毒株)，該毒株引起20%～80%的生豬死亡[8-9]；2013年的第2次變化，類NADC30毒株暴發(fā)，此后其在豬群中的感染率逐漸增加，目前在某些地區(qū)類NADC30毒株已成為優(yōu)勢毒株，其次為HP-PRRSV，經(jīng)典毒株感染或與類NADC30、HP-PRRSV毒株混合感染也時有發(fā)生[8-9,11]。豬場PRRSV感染的復(fù)雜性增加了臨床病例診斷和有效防控的困難。病毒分離鑒定、免疫組化、PCR等技術(shù)常用于PRRSV的實驗室檢測或診斷，其中PCR具有敏感性高、操作簡單、成本低、快捷等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于病原學(xué)的快速診斷與流行病學(xué)監(jiān)測。因此，建立鑒別PRRSV經(jīng)典、高致病性與類NADC30毒株的PCR方法，對于PRRSV感染的快速診斷及有效防控具有重要意義。

PRRSV基因變異表現(xiàn)為堿基的突變、置換、缺失、重組等多種形式，基因組中ORF1a、ORF3和ORF5是高變區(qū)[3,6-7]。PRRSV毒株的2次大的突變以O(shè)RF1a的Nsp2區(qū)域最顯著[3,15]。因此，本研究以O(shè)RF1a的Nsp2區(qū)域為靶基因，通過比對經(jīng)典毒株、高致病性毒株與類NADC30毒株的基因序列，設(shè)計合成PCR所需引物。引物設(shè)計思路與文獻[12-14,16]的思路相似，但本研究融入了對類NADC30毒株的檢測。已知引物的特異性是決定PCR特異性與敏感性的重要因素。因此，本研究首先比較分析了2對引物的擴增效率與特異性，篩選出1對最優(yōu)引物，進而優(yōu)化了退火溫度。此外，由于試驗中使用的是標準化的PCR反應(yīng)混合緩沖液，故本研究沒有對緩沖液成分及dNTPs濃度進行優(yōu)化，而是重點優(yōu)化了反應(yīng)體系中的引物含量。經(jīng)過對引物與退火溫度的優(yōu)化，該PCR對3個毒株核酸cDNA的檢測敏感性均達到pg級，對PCV2、CSFV、PRV等常見病毒沒有非特異性擴增，說明本研究中建立的PCR方法的敏感性和特異性均很高，并且反應(yīng)體系中只用到1對引物，即可同時鑒別檢測3個毒株，避免了引物之間的干擾，同時節(jié)約了檢測時間與檢測成本。

為了評價方法的對臨床樣本的檢測效果，本試驗用該PCR方法檢測了2017—2019年間采集的已知PRRSV感染病豬的組織樣本，顯示類NADC30毒株的檢出率最高，其次是高致病性毒株，而經(jīng)典毒株的檢出率很低，同時檢測到2個或3個不同毒株的混合感染病料。說明類NADC30毒株在河北省部分地區(qū)豬場已成為優(yōu)勢流行毒株，同時存在1個豬場內(nèi)同時流行不同毒株的復(fù)雜感染狀態(tài)。這些結(jié)果與國內(nèi)其他地區(qū)的流行情況基本相似[8,11]，同時提示當?shù)刎i場應(yīng)加強對PRRSV的防控力度，嚴格生物安全防控措施，以降低該病毒給豬場造成的經(jīng)濟損失。

總之，本研究建立的PCR方法能夠用1對引物同時檢測PRRSV經(jīng)典、高致病性和類NADC30毒株。該方法不僅能夠用于臨床PRRSV感染的快速診斷，而且可以為PRRSV疫情監(jiān)測與預(yù)警以及流行病學(xué)調(diào)查提供重要技術(shù)支撐。