呂麗君，黃后雙，2，關(guān)繼羽，周艷龍，王 帥，賀文琦，宋德光，高 豐，趙 魁* (.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 30062；2.深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 58057)

羊傳染性膿皰病毒(Orf virus,ORFV)為痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒屬(Parapoxvirus)成員，具有高度的嗜上皮性，主要引起感染綿羊、山羊的局部性皮膚損傷病變[1-2]。通過與病羊的直接/間接接觸，人(尤其是牧民、屠夫、獸醫(yī))也可發(fā)生感染，成為影響我國乃至世界公共衛(wèi)生安全的一個重要隱患[3-4]。目前，ORFV感染廣泛分布于世界各地，在我國以東北、西北等主要養(yǎng)羊省區(qū)羊群中發(fā)生較為嚴(yán)重，是嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的重要動物疫病之一。盡管該病臨床上具有自限性和低死亡率的特點，但在羔羊、兒童和免疫抑制動物，死亡率可高達80%[5]。

細(xì)胞凋亡是宿主細(xì)胞對抗病毒感染等多種外界刺激所做出的重要防御手段之一，通過誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡從而有效阻止病毒對鄰近細(xì)胞的感染，進而抑制病毒的復(fù)制和傳播[6-7]。然而，作為大型DNA病毒，痘病毒自身能夠復(fù)制編碼一系列抗凋亡基因抑制感染細(xì)胞的凋亡[8]，例如，ORFV ORF125基因被發(fā)現(xiàn)含有與Bcl-2家族成員相同的保守序列，編碼蛋白具有類似Bcl-2的抗凋亡活性[9]。ORFV ORF119蛋白C端存在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)結(jié)合基序“LxCxE”，可通過與pRb家族成員的結(jié)合，進而參與對細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等通路的調(diào)控[10]。

近年來，越來越多的研究表明，多種病毒可激活宿主細(xì)胞PI3K/Akt等抗凋亡通路，通過抑制細(xì)胞凋亡從而有助于病毒完成生命周期[11]。例如，單純皰疹病毒1(herpes simplex virus,HSV-1)能夠激活與凋亡阻斷相關(guān)的PI3K/Akt信號通路，促進病毒基因的表達[12]。乙肝病毒表面抗原(HBxAg)可通過激活PI3K/Akt通路抑制人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡[13]。雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)通過其VP5蛋白與PI3K的p85α亞基相互作用，激活PI3K/Akt信號通路，抑制感染早期細(xì)胞的凋亡，進而促進病毒增殖[14]。腸道病毒71型(entero virus 71,EV71)也可通過激活 PI3K/Akt 通路抑制JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。然而，在ORFV感染過程中，PI3K/Akt信號通路與細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系尚不明確。鑒于此，本研究運用Western blot、免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、藥物阻斷等方法，系統(tǒng)研究ORFV感染對PI3K/Akt通路和細(xì)胞凋亡的影響，以及PI3K/Akt通路介導(dǎo)ORFV感染HeLa細(xì)胞凋亡抑制的途徑。該研究不僅有助于加深對ORFV抑制感染細(xì)胞凋亡機制的了解，而且將為ORFV免疫逃逸機制的全面解析以及疾病防控提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和病毒羊傳染性膿皰病毒(ORFV/JL/08/CC)由本實驗室分離鑒定保存[16]，HeLa細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2 抗體和試劑PI3K抑制劑LY294002購自Calbiochem公司；Akt、磷酸化Akt(Ser473)和β-actin抗體均購自CST公司；MDM2、GSK3β和Bad抗體均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自Proteintech公司；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自GIBCO公司；MTT購自Sigma公司；annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京全式金生物。

1.3 細(xì)胞增殖試驗利用MTT法測定細(xì)胞增殖能力，將96孔板細(xì)胞用不同濃度(10～50 μmol/L)的PI3K抑制劑LY294002處理48 h后，每孔加入MTT試劑使終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，37 ℃、5% CO2孵育4 h；去除培養(yǎng)基，加入DMSO(100 μL/孔)搖板孵育10 min。使用酶標(biāo)儀(BioRad,Hercules,CA)測定活細(xì)胞在570 nm波長下的吸光度。

1.4 病毒感染與藥物處理經(jīng)PI3K抑制劑LY294002(25 μmol/L)預(yù)處理1 h后的Hela細(xì)胞，以MOI=1接種ORFV，或以等體積的MEM作為對照，吸附1 h后，加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養(yǎng)。

1.5 免疫熒光分析使用annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，按照說明書對細(xì)胞進行凋亡檢測；染核：細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，用預(yù)冷的甲醇和丙酮(1∶1)固定10 min，與Hoechst(0.5 g/L)溶液共孵育10 min，再次洗滌后，使用倒置熒光顯微鏡(Leica DM18,Germany)觀察細(xì)胞。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測將細(xì)胞按1.4方法處理后，用胰蛋白酶消化收集并重懸于annexin V結(jié)合緩沖液中，使細(xì)胞濃度為1×106個/mL。取100 μL細(xì)胞懸液(105個細(xì)胞)與annexin V-FITC(0.1 g/mL)混合室溫孵育15 min后，使用500 μL結(jié)合緩沖液重懸并與10 μL的PI(30 g/mL)溶液4 ℃避光染色。利用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)檢測annexin V-FITC熒光，每個樣本至少分析30 000個細(xì)胞。

1.7 Western blot檢測將細(xì)胞按1.4方法處理后，使用含有1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液收集樣品，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。含5%脫脂奶的TBST(0.1% 吐溫20)溶液37℃封閉1 h后，分別用Akt、p-Akt(Ser473)、MDM2、GSK-3β和β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后進行HRP標(biāo)記二抗孵育、ECL顯色，并利用Image J軟件對蛋白進行定量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析通過SPSSV 17.0軟件對結(jié)果進行t檢驗分析(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ORFV感染誘導(dǎo)依賴PI3K的Akt磷酸化Western blot檢測ORFV感染Hela細(xì)胞后Akt和p-Akt的表達情況。結(jié)果顯示，ORFV感染組中p-Akt(Ser 473)水平在3～48 h間先增加后減少，48 h 后p-Akt的水平與對照組細(xì)胞同一時間點的表達相似(圖1A)。由于Akt是PI3K信號通路下游的主要效應(yīng)分子，因此，進一步探究ORFV感染中Akt的活化是否通過PI3K信號通路實現(xiàn)。將ORFV接種于經(jīng)PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預(yù)處理1 h的HeLa細(xì)胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養(yǎng)，收集感染后的細(xì)胞裂解液，Western blot檢測p-Akt水平。結(jié)果顯示，經(jīng)LY294002處理Akt的總蛋白水平未發(fā)生明顯改變，但能夠抑制Akt的磷酸化(圖1B)。該結(jié)果表明，ORFV 感染Hela 細(xì)胞能夠激活依賴PI3K的Akt磷酸化。此外，MTT法檢測結(jié)果顯示，LY294002濃度達40 μmol/L時對Hela細(xì)胞增殖具有顯著影響(圖2)。

A.ORFV感染Hela細(xì)胞誘導(dǎo)Akt發(fā)生磷酸化；B.ORFV感染Hela細(xì)胞誘導(dǎo)依賴PI3K的Akt磷酸化

圖2 MTT法檢測PI3K特異性抑制劑LY294002對Hela細(xì)胞活性的影響

2.2 ORFV感染通過PI3K/Akt信號通路抑制Hela細(xì)胞凋亡將ORFV接種于Hela細(xì)胞，并以等量MEM作為對照，48 h后使用細(xì)胞核染色劑Hoechst 33258和Annexin V-FITC/PI 對細(xì)胞進行染色。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在ORFV感染組中，Hela細(xì)胞核完整，未出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、分割或邊緣化，細(xì)胞膜發(fā)生裂解成塊狀等典型的凋亡狀態(tài)，Annexin V未出現(xiàn)特異性染色，與對照組一致(圖3A)，表明ORFV感染未引起Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。將ORFV接種于經(jīng)PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預(yù)處理1 h的Hela細(xì)胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養(yǎng)，并以等量DMSO作為對照，48 h后使用Hoechst 33258和Annexin V-FITC/PI 對細(xì)胞進行染色。結(jié)果顯示，與DMSO對照組相比，LY294002處理組Hela細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)色濃斑顆粒狀光、體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，Annexin V-FITC標(biāo)記綠色熒光增多，同時PI也使細(xì)胞核發(fā)生了彌散性的紅染(圖3B)，表明經(jīng)LY294002預(yù)處理抑制PI3K/Akt信號通路后，ORFV感染誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述結(jié)果表明，PI3K/Akt 信號通路在ORFV感染Hela細(xì)胞的凋亡抑制過程中起著重要作用。此外，將ORFV接種于經(jīng)PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預(yù)處理1 h的Hela細(xì)胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養(yǎng)，并以等量ORFV單獨接種作為對照，使用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)試劑盒對LY294002和ORFV共培養(yǎng)24、48 h的Hela細(xì)胞進行染色標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。結(jié)果顯示，與ORFV感染組相比，LY294002處理組細(xì)胞凋亡率明顯增高，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多(圖4A,B)。綜上所述，ORFV感染通過激活PI3K/Akt信號通路抑制Hela細(xì)胞凋亡。

A.ORFV感染Hela細(xì)胞；B.ORFV感染經(jīng)PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理的Hela細(xì)胞

A.ORFV感染Hela細(xì)胞;B.ORFV感染經(jīng)LY294002預(yù)處理的Hela細(xì)胞

2.3 PI3K/Akt通過激活其下游效應(yīng)分子Bad抑制Hela細(xì)胞凋亡將ORFV接種于經(jīng)PI3K特異性抑制劑LY294002(25 μmol/L)預(yù)處理1 h的Hela細(xì)胞，吸附1 h后加入含有相同濃度LY294002的MEM共培養(yǎng)，Western blot檢測6、24 h后MDM2、GSK-3β、Bad的表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，當(dāng)PI3K被LY294002抑制后，ORFV感染Hela細(xì)胞MDM2和GSK-3β分子無顯著變化，但Bad表達量顯著增加(圖5A,B)。結(jié)果表明Bad分子參與了ORFV感染Hela細(xì)胞的抗凋亡過程。

A.PI3K/Akt下游效應(yīng)分子MDM2、GSK-3β、Bad表達；B.ORFV感染Hela細(xì)胞Bad分子表達

3 討論

許多病毒感染宿主細(xì)胞后，能夠破壞宿主細(xì)胞的防御系統(tǒng)以確保自身的生存、復(fù)制和增殖，從而達到持續(xù)性感染的目的。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，以細(xì)胞收縮、核濃縮和漿膜起泡為特征，在組織發(fā)育、體內(nèi)平衡和各類疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是宿主對病毒感染反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。研究表明，大量病毒已經(jīng)進化出復(fù)雜的分子策略來破壞宿主細(xì)胞的凋亡防御。在宿主細(xì)胞部署的各種防御機制中，一些依賴于細(xì)胞程序性死亡的途徑可被快速激活。例如，許多病毒獲得了Bcl-2的同源物來破壞宿主細(xì)胞的凋亡和自噬，以防止被感染細(xì)胞的過早死亡，從而影響宿主與病毒的相互作用，最終使病毒感染成功建立和傳播。

研究發(fā)現(xiàn)，痘病毒中1/3～1/2的病毒基因組致力于免疫逃避，其中多種痘病毒產(chǎn)物參與拮抗細(xì)胞凋亡反應(yīng)，從而使病毒完成其生命周期并產(chǎn)生子代病毒粒子。如牛痘病毒(VACV)的B13和B22蛋白能夠抑制Caspase(半胱天冬酶)活性從而抑制凋亡；豬痘病毒(SPV)的032蛋白抑制PKR激活能夠減少或阻止Caspase-7和PARP-1的裂解。研究表明，ORFV作為痘病毒科副痘病毒屬的一員，其編碼的ORF125抗凋亡基因可抑制感染細(xì)胞的凋亡。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡調(diào)控相關(guān)通路的重要分子PI3K對ORFV的復(fù)制增殖具有明顯的促進作用，然而具體的機制尚不清楚[22]。

本研究深入探究ORFV感染對PI3K/Akt通路和細(xì)胞凋亡的影響，以及PI3K/Akt通路介導(dǎo)ORFV感染Hela細(xì)胞凋亡抑制的途徑。研究發(fā)現(xiàn)，ORFV感染Hela細(xì)胞能夠激活p-Akt(Ser473)，而PI3K特異性抑制劑LY294002處理則使p-Akt表達顯著降低，說明ORFV感染Hela細(xì)胞能夠激活PI3K/Akt信號通路。此外，免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，ORFV感染未引起Hela細(xì)胞凋亡，但PI3K/Akt信號被LY294002抑制后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象，表明ORFV感染能夠通過激活PI3K/Akt信號通路抑制Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡。進一步對PI3K/Akt下游效應(yīng)分子MDM2、GSK-3β、Bad表達情況檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002預(yù)處理后，ORFV感染Hela細(xì)胞MDM2、GSK-3β表達均無顯著變化，僅Bad分子表達顯著增加，表明Bad分子可能參與ORFV感染Hela細(xì)胞的抗凋亡過程。綜上所述，ORFV感染可通過激活PI3K/Akt/Bad信號抑制Hela細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果不僅有助于解析ORFV抑制感染細(xì)胞凋亡的機制，而且將為全面闡明ORFV免疫逃逸機制及疾病防控提供重要的理論依據(jù)。