劉曉 李若瑜 宋營改

(北京大學第一醫(yī)院皮膚科，北京大學真菌和真菌病研究中心，北京市皮膚病分子診斷重點實驗室，國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100034)

真菌感染是一個全球關(guān)注的人類健康問題。侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)在重癥患者及免疫抑制人群中具有較高的發(fā)病率和病死率[1-3],以念珠菌感染最常見，可達53%[4]，其次為曲霉、毛霉及隱球菌[5]。侵襲性曲霉病及毛霉病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，病原學診斷困難，往往術(shù)后或尸檢才能診斷，缺少精確的診斷方法。組織病理學是診斷侵襲性真菌感染的金標準之一。由于不同真菌在組織中的形態(tài)類似，僅通過HE染色、各種特殊染色方法觀察真菌形態(tài)特征來鑒定感染真菌的屬和種比較困難，尤其是難以區(qū)分曲霉、毛霉、鐮刀菌及賽多孢霉等絲狀真菌感染[6]。福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織中病原真菌的早期診斷并將致病菌種鑒定至種，對提高診斷水平、精準治療及改善預(yù)后至關(guān)重要。分子病理診斷是準確診斷病原真菌的重要檢測手段，現(xiàn)對侵襲性真菌感染分子病理診斷方法的研究進展進行綜述。

1 FFPE組織中聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)及產(chǎn)物分析

PCR技術(shù)作為診斷FFPE組織中真菌感染的分子診斷方法之一，具有高效、快速、準確的特點。

2017年ESCMID-ECMM-ERS[歐洲臨床微生物與感染性疾病學會(ESCMID)-歐洲醫(yī)學真菌學聯(lián)盟(ECMM)-歐洲呼吸學會(ERS)]指定的曲霉病診斷和治療指南[7]中指出：寬范圍(broad-range) PCR用于鑒別可見菌絲的新鮮組織或石蠟包埋組織中真菌的種、屬具有較高證據(jù)等級(AII級)，而對于未見菌絲的活檢組織則屬于CII級。但FFPE組織PCR在DNA提取、引物的選擇、PCR平臺選擇方面仍缺乏統(tǒng)一標準。不同研究發(fā)現(xiàn)PCR診斷FFPE組織中真菌感染的陽性率15%～90%不等，但特異性較高。PCR陽性率高低的決定因素包括組織樣本的選擇、DNA的提取、DNA的污染、引物的選擇、PCR平臺的選擇等[8]。

1.1 組織樣本的選擇

①樣本的大?。篏omez等[9]利用ITS2區(qū)和D2區(qū)引物對FFPE組織和新鮮組織進行PCR，發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除標本的診斷率(71.5%)高于芯針活檢(50.0%) 和細針抽吸活檢(0%)，結(jié)果顯示組織樣本的大小對于PCR的診斷率存在影響；②樣本含菌量的多少：Dadwal等[10,11]指出由于FFPE組織中真菌負荷量低或DNA片段化，可能造成敏感性降低(敏感性為57%，而特異性為100%)。

1.2 DNA的提取

由于FFPE組織中DNA降解以及DNA交聯(lián)的存在，DNA提取更為困難，使得FFPE組織PCR的陽性率明顯低于新鮮組織。目前DNA的提取多采用商業(yè)化的試劑盒，不同試劑盒提取DNA的效率有所差異，其中自動提取試劑盒的效率最高。在不使用溶細胞酶情況下，MO BIO BiOstic FFPE Tissue DNA Isolation Kit可以分離出更高質(zhì)量的真菌DNA[12,13]。

1.3 DNA污染

DNA污染包括提取過程中其他真菌的污染以及宿主組織DNA的干擾。操作應(yīng)在生物安全柜中進行以避免空氣中真菌的污染。對于組織DNA的干擾：更為優(yōu)化的方案是基于激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection, LCM)提取DNA，將組織切片染色，精準切割病原真菌。LCM是一種有價值的工具，可在小樣本組織中獲得大數(shù)據(jù)[14]，幫助研究人員從復(fù)雜的異質(zhì)生物樣品中對單個細胞或一組細胞進行選擇性取樣。其UV-LCM的基本原理[15]是利用波長為337 nm的脈沖UVA激光，從乙烯乙酸乙烯酯膜上分離特定大小的細胞或組織區(qū)域，通過聚焦激光束的激光壓力彈射，將分離的細胞或組織區(qū)域轉(zhuǎn)移到放置在分離區(qū)域下方的離心管蓋中。LCM不僅在腫瘤、細菌及病毒感染的診斷中發(fā)揮重要作用，近年來也發(fā)現(xiàn)其在真菌感染中具備診斷潛力：趙作濤等[16]利用LCM成功鑒定了皮膚FFPE組織中的隱球菌感染；Schofield[17]成功捕獲鑒定小鼠舌組織中的白念珠菌感染；Zhou等[18]利用LCM-PCR技術(shù)成功鑒定1例人類肺FFPE組織單用PCR技術(shù)難以確診的長枝木霉病原菌感染；Olias等[15]利用LCM對鳥類肺組織中曲霉菌的感染進行鑒定，證實基于LCM的分子鑒定具有普遍適用性；Wang等[19]利用LCM-PCR技術(shù)，診斷小鼠侵襲性肺曲霉病的靈敏度達到89%，特異度為100%，表明以LCM為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)在準確診斷侵襲性肺曲霉病方面有較大的潛力。由于在整個組織的分析中，含量較少的真菌DNA可能會被組織DNA稀釋、混淆，LCM成功克服這一缺點，為獲得不受周圍組織成分污染或污染程度極低的純特異性細胞提供可能。

1.4 引物的選擇

引物可以是泛真菌引物亦可為種、屬特異性引物；引物靶點多針對真菌的ITS1、ITS2區(qū)以及18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA基因。由于真菌混合感染可能性的存在，選擇泛真菌PCR尤為重要。對于泛真菌引物而言，針對ITS1、ITS2區(qū)的序列使用率較高[20,21]。28S rDNA的D1/D2區(qū)、18S rDNA具有較高的屬鑒別能力[8,22-23]。由于FFPE組織中真菌DNA受到福爾馬林影響，PCR引物擴增DNA片段長度以短于300 bp最為合適。

1.5 PCR平臺的選擇

目前PCR常用的平臺為傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、實時定量PCR。巢式PCR及實時定量PCR具有更高的靈敏度，但選擇何種平臺目前尚無確定標準。選擇合適的引物及平臺可將診斷的靈敏度提高至79.3%～96%[24,25]。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物的分析

測序技術(shù)從第1代測序發(fā)展到第3代測序，而FFPE組織提取DNA行PCR擴增后多進行第1代測序。第1代測序技術(shù)具有操作快速、簡單的優(yōu)勢，對ITS區(qū)測序可鑒定大多數(shù)真菌菌種，目前被廣泛應(yīng)用于中、小片段DNA測序鑒定。第2代及第3代測序使得全基因組測序進一步發(fā)展，具有通量高和讀長較長的優(yōu)勢，可大大降低測序成本，提高測序速度和效率。目前第3代測序技術(shù)尚未在FFPE組織DNA中應(yīng)用。

2 熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in Situ hybridization, FISH)

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)作為一種基于組織學并進行原位觀察的分子診斷技術(shù)，可避免實驗人員暴露于危險病原微生物，具有較好的應(yīng)用前景。其基本原理[26]是根據(jù)兩條同源單鏈核酸在合適的雜交條件下按堿基配對形成雙鏈的原理，利用熒光標記探針檢測組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。有多種因素可以影響原位雜交對目標DNA或RNA序列的檢測，包括組織片段的預(yù)處理、雜交緩沖液中甲酰胺的濃度、沖洗液中NaCl的濃度、探針序列以及雜交的有效性。目前在熒光強度及探針選取方面仍存在一定限制。在高pH值的溶液中高溫加熱可有效增強探針結(jié)合強度(pH 9.5, 95℃)[27]。常用的探針包括RNA探針、dsDNA探針、寡核苷酸(DNA)探針、LNA(Locked nucleic acids)探針及PNA探針，LNA、PNA探針與DNA探針相比具有較強的熒光信號[28]。

國內(nèi)外已有較多關(guān)于原位雜交技術(shù)用于組織中病原真菌鑒定的文獻報道。FISH常用于念珠菌病的診斷，其對診斷酵母菌的靈敏度要高于絲狀真菌[29]。PNA-FISH可用于鑒別念珠菌及毛孢子菌[30]。但FISH在絲狀真菌的診斷方面研究較少，可以確定的是針對煙曲霉ALP基因的特異性dsDNA探針、鐮刀菌屬28S rRNA的PNA探針具有較高的診斷價值[31,32]。而毛霉因其D1-D2區(qū)的高度異質(zhì)性，故難以設(shè)計針對28S rRNA基因的毛霉目特異性探針[29]。針對28S rRNA基因、18S rRNA基因的泛真菌探針診斷靈敏度可達60%～80%[33-34]。表明針對rRNA靶點的FISH已成為診斷FFPE組織中真菌感染的有效手段。

3 小 結(jié)

侵襲性真菌感染的分子病理診斷技術(shù)在不斷成熟。目前的研究中值得肯定的是，PCR技術(shù)：對于組織病理可見真菌成分者，泛真菌PCR技術(shù)的價值肯定，已被寫入2017 ESCMID-ECMM-ERS侵襲性曲霉病診療指南中 (AII)；FISH技術(shù)：用于酵母菌的診斷比較穩(wěn)定，對于絲狀真菌，針對煙曲霉ALP基因的dsDNA探針和鐮刀菌屬的PNA探針具有一定的診斷價值。分子病理在侵襲性真菌感染的早期診斷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但由于PCR技術(shù)在各個層面尚缺乏標準化、存在假陽性的可能，以及FISH對于絲狀真菌特異性探針的缺乏，兩者目前尚未在臨床推廣應(yīng)用。因此需要進一步優(yōu)化、篩選PCR引物和針對絲狀真菌的FISH特異性探針，建立一套標準化、具有穩(wěn)定的高靈敏度及特異度的分子病理診斷方法，高效、快速、準確地將致病真菌鑒定到種水平，以便于臨床選擇敏感抗菌藥物，有效治療疾病，改善患者預(yù)后，降低死亡率。