段玉青，王郁，王雪曉，劉麗華,2

0 引言

隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)90%以上的人類基因組為非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNAs），其中大部分以長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）的形式存在，長度超過200個(gè)核苷酸[1]。LncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平直接或者間接參與靶基因的調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的重要生理調(diào)節(jié)作用[2]。但是，LncRNA表達(dá)失調(diào)也可通過不同的信號通路調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的表型，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)進(jìn)程[3-5]。近年來，越來越多的研究表明LncRNA可成為惡性腫瘤診斷、治療和評價(jià)預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[6-8]。

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的病理類型主要是鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）[9]。由于ESCC患者早期癥狀不典型，大多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期，且具有進(jìn)展快和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等惡性特點(diǎn)[10]，嚴(yán)重影響ESCC的治療效果。因此，迫切需要尋找新的預(yù)測標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)以提高整體療效。LncRNA淋巴細(xì)胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1,DLEU1）位于染色體13q14.3上，最早發(fā)現(xiàn)其在慢性淋巴細(xì)胞白血病等造血系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)失調(diào)并發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]，后續(xù)多項(xiàng)研究表明DLEU1在口腔癌、宮頸癌和腎癌等實(shí)體腫瘤中表達(dá)失調(diào)，且其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。但是DLEU1在ESCC中的表達(dá)及相關(guān)功能研究目前尚無報(bào)道。本研究擬分析DLEU1在ESCC患者組織中的表達(dá)和臨床意義，并探討DLEU1對ESCC細(xì)胞增殖和遷移的惡性生物學(xué)行為，為深入研究其作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年8月—2017年2月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科行根治性腫瘤切除術(shù)的58例ESCC患者的癌及癌旁組織（距離癌灶邊緣5 cm以外的癌旁組織）標(biāo)本，標(biāo)本取材后迅速置于RNA保存液中，以待提取RNA。所有患者術(shù)前3月內(nèi)未行放化療和免疫治療等抗腫瘤治療，并均于術(shù)后經(jīng)病理學(xué)確診為ESCC。58例患者中男44例，女14例，年齡50～76歲，中位年齡63歲。組織標(biāo)本按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第八版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期34例；腫瘤＜5 cm者37例，≥5 cm者21例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例。所有研究對象均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株和主要試劑

人ESCC細(xì)胞株TE1、Yes-2、Kyse150、Kyse170和Eca9706來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院東院科研中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。0.25%胰蛋白酶和DMSO購自上海索萊寶公司。DLEU1引物由廣州瑞博生物科技有限公司合成，GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNA保存液購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。Tri Quick總RNA提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司。qPCR Mix購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪公司。CCK-8試劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3 RT-qPCR檢測ESCC組織和細(xì)胞中DLEU1的表達(dá)水平

從RNA保存液中將ESCC及其相應(yīng)癌旁組織取出，在研缽中將其研磨成粉末后，加入1 ml TRIzol試劑。另外按照TRIzol試劑說明書提取ESCC及其相應(yīng)癌旁組織和ESCC細(xì)胞系TE1、Yes-2、Kyse150、Kyse170和Eca9706中的總RNA，測定RNA純度及濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為：40℃ 60 min，25℃ 5 min，75℃ 5 min。以1 μl cDNA配置qPCR體系，反應(yīng)管中加入5 μl SYBR Green熒光染料、0.4 μl上下游引物和3.6 μl RNase-free水，混勻后以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參，對底物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min；95℃ 5 s、60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：DLEU1:F:5’-GCGGAGGTGAAGTGAACTTAGA-3’,R:5’-CTCCTAAGCAGGACCCGTATT-3’; GAPDH:F:5’-TCAGAGTGGCGAAGGCAGGAG-3’,R:5’-GCAACTCAAGTAAGTCCGCACCT-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 分析DLEU1表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

收集58例ESCC患者的臨床病理資料，分析ESCC患者中DLEU1表達(dá)量與臨床病理特征的相關(guān)性。根據(jù)ESCC組織中DLEU1的相對表達(dá)倍數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。本研究將所有ESCC患者DLEU1的相對表達(dá)倍數(shù)臨界閾值定義為1，其中＞1為DLEU1高表達(dá)組（n=37），≤1為DLEU1低表達(dá)組（n=21）。分析DLEU1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 多因素Cox回歸分析DLEU1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪時(shí)間定義為術(shù)后病理確診時(shí)間至患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或隨訪截止時(shí)間，隨訪時(shí)間為36月，隨訪方式主要為電話隨訪和門診隨訪兩種方式，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。如隨訪期間患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，隨訪時(shí)間終止；如患者隨訪期間失訪，則以末次有效隨訪時(shí)間為止。計(jì)算各例患者的生存時(shí)間（月），根據(jù)分組情況用乘積極限法（Kaplan-Meier）進(jìn)行單因素生存分析并行Log rank檢驗(yàn)。并釆用多因素Cox回歸方法分析ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的Eca9706細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將LipofectamineTM2000及5 μl siRNA-DLEU1或5 μl siRNA-NC轉(zhuǎn)染入Eca9706細(xì)胞系，4～6 h后更換含F(xiàn)BS新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)功能試驗(yàn)。si-DLEU1和si-NC的序列分別是5’-GCAGUCUGUUCUGAACAUA-3’和5’-GUCUGCAGCUGAGAGUAT-3’。

1.7 CCK-8法檢測ESCC細(xì)胞增殖能力

取轉(zhuǎn)染后的各組Eca9706細(xì)胞，以1.5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后分別每孔加入10 μl CCK-8試劑，常規(guī)孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測ESCC細(xì)胞的遷移能力

6孔板接種約5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后，用200 μl槍頭在細(xì)胞中劃2條垂直于培養(yǎng)板底的直線，PBS沖洗3次，加入2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0和24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)比較各組表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系；生存分析比較采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)；多變量Cox回歸模型評估DLEU1及其他各變量對預(yù)后的作用。GraphPad Prism8對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖片的繪制。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLEU1在ESCC組織中的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，ESCC組織中DLEU1的表達(dá)水平（1.97±2.87）顯著高于配對癌旁組織（1±1.87），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.907,P＜0.01），見圖1。表明DLEU1在ESCC組織中高表達(dá)。

圖1 RT-qPCR法檢測ESCC組織中DLEU1的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of DLEU1 in ESCC tissues detected by RT-qPCR

2.2 DLEU1表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系

ESCC組織中DLEU1高表達(dá)組37例（63.79%），DLEU1低表達(dá)組21例（36.21%）。DLEU1高表達(dá)組中DLEU1的表達(dá)水平是相應(yīng)癌旁組織的（4.59±3.16）倍（P＜0.0001，DLEU1低表達(dá)組中DLEU1的表達(dá)水平是相應(yīng)癌旁組織的（0.73±0.32）倍（P=0.000397）。進(jìn)一步分析DLEU1基因表達(dá)水平對ESCC患者臨床病理特征的影響，結(jié)果顯示，ESCC組織中DLEU1表達(dá)水平與ESCC患者的腫瘤大小（P=0.0089）、TNM分期（P=0.0437）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.0015）具有相關(guān)性（均P＜0.05），而與患者性別（P=0.4949）和年齡（P=0.9845）無相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

2.3 DLEU1表達(dá)水平與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系

本研究共隨訪病例58例，無失訪病例，隨訪率100%。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，與DLEU1基因低表達(dá)組相比，DLEU1基因高表達(dá)組ESCC患者3年生存率顯著降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=2.808,P＜0.01），見圖2。以上結(jié)果表明ESCC組織中高表達(dá)DLEU1基因提示患者預(yù)后不良。

2.4 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析結(jié)果

進(jìn)一步進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明，DLEU1高表達(dá)是ESCC患者較短生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.769,95%CI:1.101～6.96,P=0.03），見圖3、表2。說明高表達(dá)DLEU1是影響ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1 DLEU1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的相關(guān)性(n=58)Table 1 Correlation between DLEU1 expression and clinicopathological features of ESCC patients (n=58)

2.5 構(gòu)建DLEU1低表達(dá)的食管癌細(xì)胞系

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與TE1細(xì)胞相比，食管鱗癌Eca9706、Yes-2、Kyse170和Kyse150細(xì)胞中DLEU1表達(dá)水平明顯升高（t=27.14,21.89,22.97,32.06，均P＜0.01），見圖4A，因此我們選擇Eca9706細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。進(jìn)一步RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-DLEU1組中DLEU1表達(dá)水平明顯降低（t=6.682,P＜0.01），見圖4B，證實(shí)成功構(gòu)建低表達(dá)DLEU1的食管癌細(xì)胞系。

2.6 敲低DLEU1表達(dá)抑制Eca9706細(xì)胞的增殖和遷移能力

圖2 DLEU1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Relation between DLEU1 expression and prognosis of ESCC patients

表2 多因素Cox回歸分析各臨床參數(shù)與ESCC患者的生存的相關(guān)性Table 2 Multivariate Cox regression analysis of correlation between clinical parameters and survival of ESCC patients

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，siRNA-DLEU1組在48、72、96 h細(xì)胞增殖能力明顯低于si-NC組，分別為（t48=5.2,t72=5.716,t96=5.346，均P＜0.01），見圖5A。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)表明，siRNA-DLEU1組細(xì)胞的遷移能力明顯小于siRNA-NC組（t=7.333,P＜0.01），見圖5B。綜上所述，敲低DLEU1可抑制食管癌Eca9706細(xì)胞的增殖和遷移能力。

圖3 ESCC患者Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析Figure 3 Multivariate Cox risk regression analysis of ESCC patients

圖4 RT-qPCR檢測ESCC細(xì)胞系中(A)和Eca9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-DLEU1、si-NC后(B)DLEU1的表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of DLEU1 in ESCC cell line(A)and Eca9706 cells transfected with si-DLEU1 or si-NC(B)detected by RT-qPCR

3 討論

近年來，越來越多的研究表明LncRNA的異常表達(dá)與ESCC的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，并參與ESCC的發(fā)生發(fā)展[15-16]。DLEU1是一種定位于人染色體13q14.2-q14.3區(qū)域，高度保守的LncRNA。早期研究[11]發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的患者中存在DLEU1失調(diào)，其過表達(dá)可以提高患者治愈率及生存率，推測DLEU1作為腫瘤抑制基因參與B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展。隨后多項(xiàng)研究[17-19]表明，DLEU1在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可作為一種癌基因調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，LncRNA DLEU1在胰腺癌組織中高表達(dá)，敲低DLEU1可明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，LncRNA DLEU1高表達(dá)為預(yù)后不良指標(biāo)。在胃癌中，DLEU1高表達(dá)狀態(tài)和腫瘤大小、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其作用機(jī)制可能通過上調(diào)KLF2表達(dá)參與胃癌的惡性生物學(xué)行為[21]。以上研究結(jié)果表明DLEU1的表達(dá)失調(diào)調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，關(guān)于DLEU1在ESCC中的研究缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究檢測了ESCC組織和癌旁組織中DLEU1的表達(dá)水平，分析其與ESCC患者的臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，并初步探索了DLEU1在食管癌細(xì)胞系中的功能影響，旨在為ESCC的早期診斷和判斷預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)的癌旁組織表達(dá)相比，ESCC組織中DLEU1的相對表達(dá)水平顯著升高。表明DLEU1在ESCC組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，提示我們增高的DLEU1 可能參與了食管鱗癌腫瘤生物學(xué)特性的形成和腫瘤進(jìn)展過程。進(jìn)一步分析了ESCC組織中DLEU1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示DLEU1表達(dá)水平與年齡和性別無關(guān)，與腫瘤組織大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即腫瘤組織越大、TNM分期越晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，DLEU1 表達(dá)水平越高。綜上所述，DLEU1可能通過上調(diào)其表達(dá)參與ESCC腫瘤組織的浸潤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲過程。

圖5 DLEU1促進(jìn)Eca9706細(xì)胞的增殖(A)和遷移(B)能力Figure 5 DLEU1 promoted proliferation(A) and migration(B) of Eca9706 cells

本研究Kaplan-Meier生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLEU1高表達(dá)患者具有較短的生存期，提示DLEU1高表達(dá)預(yù)示ESCC患者預(yù)后不良。后續(xù)采用多因素Cox回歸分析證實(shí)了DLEU1高表達(dá)是ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。另外，本研究成功構(gòu)建DLEU1低表達(dá)的食管癌細(xì)胞系，初步探討DLEU1在食管癌細(xì)胞系中的惡性生物學(xué)行為。通過CCK-8和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默DLEU1可明顯抑制ESCC細(xì)胞的增殖和遷移能力。因此，DLEU1可作為癌基因參與ESCC的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，DLEU1在ESCC組織中高表達(dá)，其高表達(dá)水平與腫瘤組織大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)，且是ESCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素。另外，DLEU1可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖和遷移能力。以上結(jié)果提示DLEU1可以作為ESCC潛在的分子標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)，為深入探討DLEU1影響食管癌浸潤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。