段玉青，王郁，王雪曉，劉麗華,2

0 引言

隨著基因組學研究的進展，發(fā)現(xiàn)90%以上的人類基因組為非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNAs），其中大部分以長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）的形式存在，長度超過200個核苷酸[1]。LncRNA可在表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平直接或者間接參與靶基因的調控，廣泛參與細胞內的重要生理調節(jié)作用[2]。但是，LncRNA表達失調也可通過不同的信號通路調節(jié)多種惡性腫瘤的表型，從而參與腫瘤細胞的增殖、分化、遷移和侵襲等惡性生物學進程[3-5]。近年來，越來越多的研究表明LncRNA可成為惡性腫瘤診斷、治療和評價預后的潛在生物標志物[6-8]。

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的病理類型主要是鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）[9]。由于ESCC患者早期癥狀不典型，大多數(shù)患者就診時已為中晚期，且具有進展快和復發(fā)轉移率高等惡性特點[10]，嚴重影響ESCC的治療效果。因此，迫切需要尋找新的預測標志物和治療靶點以提高整體療效。LncRNA淋巴細胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1,DLEU1）位于染色體13q14.3上，最早發(fā)現(xiàn)其在慢性淋巴細胞白血病等造血系統(tǒng)腫瘤中表達失調并發(fā)揮重要調控作用[11]，后續(xù)多項研究表明DLEU1在口腔癌、宮頸癌和腎癌等實體腫瘤中表達失調，且其異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[12-14]。但是DLEU1在ESCC中的表達及相關功能研究目前尚無報道。本研究擬分析DLEU1在ESCC患者組織中的表達和臨床意義，并探討DLEU1對ESCC細胞增殖和遷移的惡性生物學行為，為深入研究其作用機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年8月—2017年2月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科行根治性腫瘤切除術的58例ESCC患者的癌及癌旁組織（距離癌灶邊緣5 cm以外的癌旁組織）標本，標本取材后迅速置于RNA保存液中，以待提取RNA。所有患者術前3月內未行放化療和免疫治療等抗腫瘤治療，并均于術后經病理學確診為ESCC。58例患者中男44例，女14例，年齡50～76歲，中位年齡63歲。組織標本按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第八版標準進行TNM分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期18例、Ⅲ期34例；腫瘤＜5 cm者37例，≥5 cm者21例；有淋巴結轉移者42例，無淋巴結轉移者16例。所有研究對象均簽署知情同意書，研究方案經河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞株和主要試劑

人ESCC細胞株TE1、Yes-2、Kyse150、Kyse170和Eca9706來自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院東院科研中心。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。0.25%胰蛋白酶和DMSO購自上海索萊寶公司。DLEU1引物由廣州瑞博生物科技有限公司合成，GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。RNA保存液購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。Tri Quick總RNA提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司。qPCR Mix購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。反轉錄試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。siRNA轉染試劑購自上海吉瑪公司。CCK-8試劑購自大連美侖生物技術有限公司。

1.3 RT-qPCR檢測ESCC組織和細胞中DLEU1的表達水平

從RNA保存液中將ESCC及其相應癌旁組織取出，在研缽中將其研磨成粉末后，加入1 ml TRIzol試劑。另外按照TRIzol試劑說明書提取ESCC及其相應癌旁組織和ESCC細胞系TE1、Yes-2、Kyse150、Kyse170和Eca9706中的總RNA，測定RNA純度及濃度。然后按照反轉錄試劑盒合成cDNA，反應條件為：40℃ 60 min，25℃ 5 min，75℃ 5 min。以1 μl cDNA配置qPCR體系，反應管中加入5 μl SYBR Green熒光染料、0.4 μl上下游引物和3.6 μl RNase-free水，混勻后以cDNA為模板、GAPDH為內參，對底物進行擴增，擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 5 s、60℃ 32 s，共40個循環(huán)。引物序列：DLEU1:F:5’-GCGGAGGTGAAGTGAACTTAGA-3’,R:5’-CTCCTAAGCAGGACCCGTATT-3’; GAPDH:F:5’-TCAGAGTGGCGAAGGCAGGAG-3’,R:5’-GCAACTCAAGTAAGTCCGCACCT-3’。實驗結果采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，實驗重復3次。

1.4 分析DLEU1表達水平與ESCC患者臨床病理特征的關系

收集58例ESCC患者的臨床病理資料，分析ESCC患者中DLEU1表達量與臨床病理特征的相關性。根據(jù)ESCC組織中DLEU1的相對表達倍數(shù)分為高表達組和低表達組。本研究將所有ESCC患者DLEU1的相對表達倍數(shù)臨界閾值定義為1，其中＞1為DLEU1高表達組（n=37），≤1為DLEU1低表達組（n=21）。分析DLEU1表達與ESCC患者臨床病理特征的關系。

1.5 多因素Cox回歸分析DLEU1表達與ESCC患者預后的關系

隨訪時間定義為術后病理確診時間至患者出現(xiàn)轉移或隨訪截止時間，隨訪時間為36月，隨訪方式主要為電話隨訪和門診隨訪兩種方式，隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。如隨訪期間患者出現(xiàn)轉移，隨訪時間終止；如患者隨訪期間失訪，則以末次有效隨訪時間為止。計算各例患者的生存時間（月），根據(jù)分組情況用乘積極限法（Kaplan-Meier）進行單因素生存分析并行Log rank檢驗。并釆用多因素Cox回歸方法分析ESCC患者的獨立預后因素。

1.6 細胞轉染

取對數(shù)生長期的Eca9706細胞，以1×105個/孔密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%～80%時，按LipofectamineTM2000轉染試劑的說明書，將LipofectamineTM2000及5 μl siRNA-DLEU1或5 μl siRNA-NC轉染入Eca9706細胞系，4～6 h后更換含F(xiàn)BS新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)功能試驗。si-DLEU1和si-NC的序列分別是5’-GCAGUCUGUUCUGAACAUA-3’和5’-GUCUGCAGCUGAGAGUAT-3’。

1.7 CCK-8法檢測ESCC細胞增殖能力

取轉染后的各組Eca9706細胞，以1.5×103個/孔的密度接種于96孔板，每組設4個平行復孔，培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后分別每孔加入10 μl CCK-8試劑，常規(guī)孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm波長的光密度（OD）值，計算細胞增殖能力，實驗重復3次。

1.8 劃痕實驗檢測ESCC細胞的遷移能力

6孔板接種約5×105個細胞，待細胞長滿后，用200 μl槍頭在細胞中劃2條垂直于培養(yǎng)板底的直線，PBS沖洗3次，加入2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0和24 h在顯微鏡下觀察細胞的遷移距離，實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗比較各組表達情況與臨床病理特征的關系；生存分析比較采用Kaplan-Meier檢驗；多變量Cox回歸模型評估DLEU1及其他各變量對預后的作用。GraphPad Prism8對實驗數(shù)據(jù)進行相關圖片的繪制。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DLEU1在ESCC組織中的表達水平

RT-qPCR結果顯示，ESCC組織中DLEU1的表達水平（1.97±2.87）顯著高于配對癌旁組織（1±1.87），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.907,P＜0.01），見圖1。表明DLEU1在ESCC組織中高表達。

圖1 RT-qPCR法檢測ESCC組織中DLEU1的表達水平Figure 1 Expression levels of DLEU1 in ESCC tissues detected by RT-qPCR

2.2 DLEU1表達水平與ESCC患者臨床病理特征的關系

ESCC組織中DLEU1高表達組37例（63.79%），DLEU1低表達組21例（36.21%）。DLEU1高表達組中DLEU1的表達水平是相應癌旁組織的（4.59±3.16）倍（P＜0.0001，DLEU1低表達組中DLEU1的表達水平是相應癌旁組織的（0.73±0.32）倍（P=0.000397）。進一步分析DLEU1基因表達水平對ESCC患者臨床病理特征的影響，結果顯示，ESCC組織中DLEU1表達水平與ESCC患者的腫瘤大?。≒=0.0089）、TNM分期（P=0.0437）和淋巴結轉移（P=0.0015）具有相關性（均P＜0.05），而與患者性別（P=0.4949）和年齡（P=0.9845）無相關性（均P＞0.05），見表1。

2.3 DLEU1表達水平與ESCC患者預后的關系

本研究共隨訪病例58例，無失訪病例，隨訪率100%。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，與DLEU1基因低表達組相比，DLEU1基因高表達組ESCC患者3年生存率顯著降低，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（HR=2.808,P＜0.01），見圖2。以上結果表明ESCC組織中高表達DLEU1基因提示患者預后不良。

2.4 Cox風險回歸模型多因素分析結果

進一步進行多因素分析，結果表明，DLEU1高表達是ESCC患者較短生存期的獨立危險因素（HR=2.769,95%CI:1.101～6.96,P=0.03），見圖3、表2。說明高表達DLEU1是影響ESCC患者預后的獨立危險因素。

表1 DLEU1表達與ESCC患者臨床病理特征的相關性(n=58)Table 1 Correlation between DLEU1 expression and clinicopathological features of ESCC patients (n=58)

2.5 構建DLEU1低表達的食管癌細胞系

RT-qPCR檢測結果顯示，與TE1細胞相比，食管鱗癌Eca9706、Yes-2、Kyse170和Kyse150細胞中DLEU1表達水平明顯升高（t=27.14,21.89,22.97,32.06，均P＜0.01），見圖4A，因此我們選擇Eca9706細胞進行后續(xù)研究。進一步RT-qPCR檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-DLEU1組中DLEU1表達水平明顯降低（t=6.682,P＜0.01），見圖4B，證實成功構建低表達DLEU1的食管癌細胞系。

2.6 敲低DLEU1表達抑制Eca9706細胞的增殖和遷移能力

圖2 DLEU1表達與ESCC患者預后的關系Figure 2 Relation between DLEU1 expression and prognosis of ESCC patients

表2 多因素Cox回歸分析各臨床參數(shù)與ESCC患者的生存的相關性Table 2 Multivariate Cox regression analysis of correlation between clinical parameters and survival of ESCC patients

CCK-8法檢測結果顯示，siRNA-DLEU1組在48、72、96 h細胞增殖能力明顯低于si-NC組，分別為（t48=5.2,t72=5.716,t96=5.346，均P＜0.01），見圖5A。劃痕愈合實驗表明，siRNA-DLEU1組細胞的遷移能力明顯小于siRNA-NC組（t=7.333,P＜0.01），見圖5B。綜上所述，敲低DLEU1可抑制食管癌Eca9706細胞的增殖和遷移能力。

圖3 ESCC患者Cox風險回歸模型多因素分析Figure 3 Multivariate Cox risk regression analysis of ESCC patients

圖4 RT-qPCR檢測ESCC細胞系中(A)和Eca9706細胞轉染si-DLEU1、si-NC后(B)DLEU1的表達水平Figure 4 Expression levels of DLEU1 in ESCC cell line(A)and Eca9706 cells transfected with si-DLEU1 or si-NC(B)detected by RT-qPCR

3 討論

近年來，越來越多的研究表明LncRNA的異常表達與ESCC的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學行為密切相關，并參與ESCC的發(fā)生發(fā)展[15-16]。DLEU1是一種定位于人染色體13q14.2-q14.3區(qū)域，高度保守的LncRNA。早期研究[11]發(fā)現(xiàn)B細胞慢性淋巴細胞白血病的患者中存在DLEU1失調，其過表達可以提高患者治愈率及生存率，推測DLEU1作為腫瘤抑制基因參與B細胞慢性淋巴細胞白血病的發(fā)生發(fā)展。隨后多項研究[17-19]表明，DLEU1在多種實體腫瘤中表達上調，可作為一種癌基因調控腫瘤的惡性生物學進程。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，LncRNA DLEU1在胰腺癌組織中高表達，敲低DLEU1可明顯抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，LncRNA DLEU1高表達為預后不良指標。在胃癌中，DLEU1高表達狀態(tài)和腫瘤大小、病理分期和淋巴結轉移有關，其作用機制可能通過上調KLF2表達參與胃癌的惡性生物學行為[21]。以上研究結果表明DLEU1的表達失調調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，關于DLEU1在ESCC中的研究缺乏相關報道。本研究檢測了ESCC組織和癌旁組織中DLEU1的表達水平，分析其與ESCC患者的臨床病理特征以及預后的相關性，并初步探索了DLEU1在食管癌細胞系中的功能影響，旨在為ESCC的早期診斷和判斷預后提供新的生物標志物。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，與相應的癌旁組織表達相比，ESCC組織中DLEU1的相對表達水平顯著升高。表明DLEU1在ESCC組織中呈高表達狀態(tài)，提示我們增高的DLEU1 可能參與了食管鱗癌腫瘤生物學特性的形成和腫瘤進展過程。進一步分析了ESCC組織中DLEU1表達與ESCC患者臨床病理特征的相關性。結果顯示DLEU1表達水平與年齡和性別無關，與腫瘤組織大小、TNM分期和淋巴結轉移密切相關，即腫瘤組織越大、TNM分期越晚和有淋巴結轉移，DLEU1 表達水平越高。綜上所述，DLEU1可能通過上調其表達參與ESCC腫瘤組織的浸潤生長、轉移及侵襲過程。

圖5 DLEU1促進Eca9706細胞的增殖(A)和遷移(B)能力Figure 5 DLEU1 promoted proliferation(A) and migration(B) of Eca9706 cells

本研究Kaplan-Meier生存分析結果發(fā)現(xiàn)，DLEU1高表達患者具有較短的生存期，提示DLEU1高表達預示ESCC患者預后不良。后續(xù)采用多因素Cox回歸分析證實了DLEU1高表達是ESCC患者預后的獨立影響因素。另外，本研究成功構建DLEU1低表達的食管癌細胞系，初步探討DLEU1在食管癌細胞系中的惡性生物學行為。通過CCK-8和劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)沉默DLEU1可明顯抑制ESCC細胞的增殖和遷移能力。因此，DLEU1可作為癌基因參與ESCC的惡性生物學行為。

綜上所述，DLEU1在ESCC組織中高表達，其高表達水平與腫瘤組織大小、TNM分期、淋巴結轉移及預后不良密切相關，且是ESCC患者不良預后的獨立影響因素。另外，DLEU1可促進ESCC細胞的增殖和遷移能力。以上結果提示DLEU1可以作為ESCC潛在的分子標志物及藥物靶點，為深入探討DLEU1影響食管癌浸潤轉移的分子機制奠定理論基礎。