胡馨予，董睿陶，李志平，杜琳，劉艷

0 引言

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有高患病率和高死亡率的特點。2018年，肝癌已成為全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年約有841000例新增確診患者和782000例死亡患者[1]。目前，早期預防手段主要是接種乙肝疫苗，而發(fā)病后的治療手段主要包括手術(shù)切除、放射療法和化學療法等，但未能從根本上預防和阻止肝癌的發(fā)展[2]。

大波斯菊苷（Apigenin-7-O-Glucoside,AGL）是一種具有黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物，可從貢菊、律草等多種藥用植物中分離得到[3]。目前的研究表明，AGL具有抗氧化、抗菌和抗病毒等作用，還能夠抑制HepG2細胞的增殖[4-5]，但其抗肝癌活性的相關(guān)機制未見報道。AGL雖未被應用于臨床治療，但從植物中分離得到的天然活性成分具有藥理作用強、毒副作用小的特點。因此，本研究在體外探究AGL對Huh7肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制，同時，在體內(nèi)進一步驗證AGL對Huh7細胞荷瘤小鼠腫瘤進展的影響，擬為AGL用于肝癌的臨床治療提供思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

AGL（578-74-5）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；Huh7細胞（YB-ATCC-2811）購自上海鈺博生物科技有限公司；BALB/c裸鼠（SPF級，雄性）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物倫理批號為SYXK-(JI)20190012；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，40203ES60）購自上海翊圣生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1,T4069）、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA,D6883）購自美國Sigma公司；Muse? Oxidative Stress Kit購自美國Millipore公司；細胞組織裂解液（RIPA,P0013B）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（23225）購自美國Thermo Scientific公司；辣根過氧化物酶化學發(fā)光劑（ECL,WBKlS0100）購自美國Millipore公司；B淋巴瘤-2基因（Bcl-2,ab32124）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax,ab32503）、Bcl-2關(guān)聯(lián)死亡啟動子（Bad,ab129192）、重組人B細胞淋巴瘤因子2-xL（Bcl-xL,ab32370）、裂解的（Cleaved）含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3（ab2302）、Cleaved Caspase-9（ab2324）、磷酸化的（p）-NF-κB（ab86299）、總（T）-NF-κB（ab7970）、p-IKKα/β（ab195907）、T-IKKα/β（ab178870）、p-核因子κB的抑制蛋白α（IκBα,ab12135）、T-IκBα（ab32518）及3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH,ab8245）均購自美國Abcam公司；小鼠IL-2（MM-0701M1）、IL-6（MM-0163M1）、IL-10（MM-0176M1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α,MM-0132M1）ELISA試劑盒購自江蘇科特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標儀（SYNERGY4）購自美國BIOTEK公司；高速離心機（MiniSpin）購自德國Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡（CKX41）購自日本OLYMPUS公司；Muse細胞分析儀（Muse）購自美國MIILLIPORE；凝膠成像系統(tǒng)（BioSpectrum 600）購自美國UVP公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

Huh7細胞采用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基、于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長至80%時進行傳代。

1.4 細胞活力檢測

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液。將細胞分為空白對照組（CTRL）、10、20、40、60、80和100 μmol/L AGL處理組，每組設(shè)置6個復孔?？瞻讓φ战M加入含0.1% DMSO的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，AGL處理組使用DMSO溶解并用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋（DMSO濃度不高于0.1%），將稀釋后的藥品加入96孔板中，孵育24 h。每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱中孵育2 h后，450 nm波長下使用酶標儀測定吸光度值，并計算細胞存活率。

1.5 線粒體膜電位檢測

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為空白對照組（CTRL）、25和50 μmol/L AGL處理組。孵育12 h后，棄去培養(yǎng)液，并使用溫育后的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗細胞，在避光條件下加入10 μg/ml的JC-1染液，培養(yǎng)箱中孵育10 min，PBS清洗，熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.6 活性氧水平檢測

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以2×105個/孔接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h后，細胞分組及處理方案同1.5。孵育12 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，在避光條件下加入2 μmol/L的DCFH-DA探針溶液，培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS清洗。在熒光酶標儀上使用488 nm的激發(fā)波長和525 nm的發(fā)射波長，檢測各組細胞的活性氧（ROS）含量。

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以將2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h。細胞分組及處理方案同1.5。孵育12 h后，收集細胞，PBS沖洗沉淀2次，避光加入Muse?氧化應激染液（Muse?Oxidative Stress Reagent），室溫孵育20 min，Muse細胞分析儀分析細胞內(nèi)ROS含量變化。

1.7 細胞凋亡檢測

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以5×104個/孔的密度接種在24孔板，培養(yǎng)24 h。細胞分組及處理方案同1.5。孵育12 h后，收集細胞，PBS沖洗細胞沉淀2次，避光加入含有碘化丙啶（PI）和膜聯(lián)蛋白V（Annexin）的染液，室溫孵育20 min后，Muse細胞分析儀進行分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法

細胞長至80%時傳代，收集細胞懸液，并將Huh7細胞以2×105個/孔的密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h后，以1.5中的方案進行分組給藥。孵育24 h后，加入100 μl含有1%蛋白酶抑制劑和2%苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液，在冰上裂解10 min。BCA蛋白檢測試劑盒對各組別的蛋白含量進行檢測，并將蛋白定量至40 μg。12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%牛血清白蛋白（BSA）4℃封閉4 h，將膜分別與Bax、Bad、Bcl-xL、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p-NF-κB、T-NF-κB、p-IKKα/β、T-IKKα/β、p-IκBα、T-IκBα和GAPDH抗體孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育4 h。使用ECL檢測試劑盒和凝膠成像儀對條帶進行顯色，并使用Image J軟件進行定量分析。

1.9 異種移植腫瘤小鼠模型的建立

將30只5周齡雄性BALB/c裸鼠于無菌環(huán)境中飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)一周后，將8×107/ml的Huh7細胞接種至裸鼠的背部右后方。當接種的腫瘤體積達到150 mm3左右時，將小鼠隨機分為三組，分別為空白對照組（n=10，腹腔注射含0.1%DMSO的0.9%氯化鈉溶液）、低劑量給藥組（n=10，腹腔注射含0.1%DMSO的10 mg/kg AGL）和高劑量給藥組（n=10，腹腔注射含0.1%DMSO的20 mg/kg AGL）。給藥共持續(xù)14天，每兩天給藥一次并測量體重和瘤體積。在最后一次給藥后，麻醉小鼠并拍照。待小鼠蘇醒后，眼眶靜脈叢取血，隨后使小鼠安樂死，收集腫瘤組織進行拍照，收集肝臟、脾臟和腎臟組織固定于福爾馬林液體中，用于后續(xù)的組織病理學檢查。

1.10 組織病理學檢測

將固定后的肝臟、脾臟和腎臟包埋在石蠟中，使用切片機切割5 μm厚的石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染液進行染色，并在顯微鏡下進行觀察。

1.11 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

收集小鼠外周血，3000 r/min離心10 min，將吸取的上清液再次3000 r/min離心5 min，收集上清液。按照ELISA說明書對血清中IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的水平進行檢測。

1.12 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進行ANOVA分析和Tukey’s檢測，結(jié)果采用均值±標準差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AGL通過影響Huh7細胞的線粒體功能誘導肝癌細胞凋亡

2.1.1 AGL對Huh7細胞活力的影響 AGL處理24 h后，Huh7細胞的半數(shù)抑制濃度約為50 μmol/L（P＜0.001），隨著AGL濃度的增加，細胞活力下降，表明大波斯菊苷具有抑制肝癌Huh7細胞增殖的能力，見圖1。

圖1 大波斯菊苷對Huh7細胞活力的影響Figure 1 Effects of AGL on viability of Huh7 cells

2.1.2 大波斯菊苷對Huh7細胞線粒體膜電位的影響

與空白對照組相比，不同濃度的AGL處理后，Huh7細胞開始出現(xiàn)綠色熒光，尤其在50 μmol/L AGL處理后，綠色熒光的比例顯著增加，熒光定量分析結(jié)果也顯示，不同濃度的AGL處理能夠顯著降低紅/綠熒光的比率（P＜0.001），見圖2。說明AGL可以降低Huh7細胞的線粒體膜電位，促進細胞凋亡。

2.1.3 AGL對Huh7細胞內(nèi)ROS含量的影響 熒光酶標儀檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，AGL處理組的吸光度值顯著升高，即Huh7細胞內(nèi)ROS的水平顯著升高（P＜0.001）。隨著給藥濃度的增加，熒光強度逐漸增強，見圖3A；進一步通過流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)ROS的積累情況，不同濃度AGL處理后均能顯著升高Huh7肝癌細胞內(nèi)的ROS積累（P＜0.001），見圖3B。說明大波斯菊苷能夠促進細胞凋亡。

2.1.4 AGL對Huh7細胞凋亡的影響 空白對照組的細胞凋亡率為7.78%，經(jīng)過25和50 μmol/L的AGL處理后，Huh7肝癌細胞的凋亡率分別增加至12.94%和25.23%（均P＜0.001），說明AGL能夠明顯增加Huh7細胞的凋亡率，促進肝癌細胞凋亡，見圖4。

2.2 AGL調(diào)節(jié)Huh7細胞中蛋白的表達

與空白對照組相比，AGL能夠增加促凋亡蛋白Bax和Bad的水平，降低抗凋亡蛋白Bcl2和Bcl-xL的水平，同時增加了Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的水平，說明大波斯菊苷能夠調(diào)控細胞中抗凋亡和促凋亡蛋白的表達水平，進而促進Huh7細胞凋亡，見圖5A。

與空白對照組相比，不同濃度的AGL處理均能夠降低NF-κB、IKKα/β和IκBα的磷酸化水平，延緩腫瘤的發(fā)展，見圖5B。

2.3 AGL對Huh7荷瘤小鼠生理病理狀態(tài)的影響

2.3.1 對小鼠腫瘤生長的影響 與空白對照組相比，AGL處理后能夠降低Huh7荷瘤小鼠腫瘤的增長速度，腫瘤體積顯著減小（P＜0.05）。而在空白對照組和AGL處理組之間，小鼠的體重并無顯著變化，見圖6。

2.3.2 對小鼠臟器組織的影響 進一步通過HE染色觀察小鼠的肝臟、脾臟和腎臟的病理變化。在空白對照組與AGL處理組小鼠的肝臟和脾臟中均未見水腫和炎性浸潤，腎臟中無腎小球病變，各臟器中的細胞排列整齊、狀態(tài)良好且未發(fā)現(xiàn)炎性浸潤，說明AGL對小鼠的臟器組織無明顯的毒副作用，見圖7。

2.4 大波斯菊苷調(diào)節(jié)Huh7荷瘤小鼠血清中炎性相關(guān)因子的水平

圖2 大波斯菊苷對Huh7細胞線粒體膜電位的影響Figure 2 Effects of AGL on mitochondrial membrane potential of Huh7 cells

圖3 熒光酶標儀(A)和流式細胞術(shù)(B)分析大波斯菊苷對Huh7細胞內(nèi)ROS水平的影響Figure 3 Effects of AGL on ROS levels in Huh7 cells analyzed via fluorescence microplate reader (A) and flow cytometry (B)

圖4 大波斯菊苷對Huh7細胞凋亡的影響Figure 4 Effects of AGL on apoptosis of Huh7 cells

圖5 大波斯菊苷對Huh7細胞內(nèi)蛋白表達的影響Figure 5 Effects of AGL on protein expression of Huh7 cells

圖6 大波斯菊苷對Huh7細胞荷瘤裸鼠體重和瘤體積的影響Figure 6 Effects of AGL on body weight and tumor volume of Huh7-xenograft tumor nude mice

與空白對照組小鼠相比，AGL處理組小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量顯著降低（P＜0.05），同時IL-2和IL-10的含量升高（P＜0.01），其中20 mg/kg AGL對這四種因子的調(diào)節(jié)作用更加顯著（P＜0.01），見表1。

3 討論

大波斯菊苷是一類具有黃酮類葡糖苷結(jié)構(gòu)的單體藥物，研究報道其可抑制癌細胞生長、真菌生長、細胞內(nèi)和細胞外活性氧的生成，引起細胞停滯和質(zhì)膜損傷[6]。在民間醫(yī)學中，大波斯菊苷常被用于治療肝功能異常（肝炎和黃疸）的患者[7]。據(jù)報道，大波斯菊苷能夠通過TLR4/NF-κB的失活和Nrf2信號通路的增強來阻斷炎性反應和氧化應激，改善脂多糖誘導的小鼠急性中耳炎[8]。大波斯菊苷能夠通過PI3K/AKT/mTOR途徑誘導AGS胃癌細胞的G2/M期細胞周期停滯、外源性凋亡和自噬細胞死亡，這可能會抑制胃癌的發(fā)展[9]。但是，大波斯菊苷在Huh7肝癌細胞中的作用以及機制鮮見報道。因此，本研究旨在探索大波斯菊苷在肝癌發(fā)展中的作用及其機制，以期發(fā)現(xiàn)新的治療肝癌的藥物。

圖7 大波斯菊苷對Huh7細胞荷瘤裸鼠肝臟、脾臟和腎臟的影響 (HE ×200)Figure 7 Effects of AGL on liver,spleen and kidney of Huh7-xenograft tumor nude mice (HE ×200)

表1 大波斯菊苷對Huh7細胞荷瘤裸鼠血清中炎性相關(guān)因子的影響Table 1 Effect of AGL on inflammation-related factors in serum of Huh7-xenograft tumor nude mice

細胞的死亡主要分為兩種類型：壞死和凋亡。誘導腫瘤細胞凋亡被認為是治療癌癥的有效策略。大量研究表明，細胞的凋亡可以由聚集在線粒體上的多種促凋亡因子刺激而觸發(fā)，從而引起線粒體去極化、細胞色素c的釋放以及胱天蛋白酶的激活[10]。在線粒體介導的凋亡內(nèi)在途徑中，細胞色素c從受損的線粒體中釋放出來，使Caspase-9活化，隨后激活下游Caspase-3蛋白，起到級聯(lián)放大作用，最終使多聚ADP核糖聚合酶（PARP）失活，誘導細胞凋亡[11]。在活細胞中，Bcl-2和Bcl-xL與促細胞凋亡家族成員的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而抑制細胞凋亡[12]。Bad基因編碼的蛋白質(zhì)與Bcl-xL和Bcl-2形成異源二聚體，并逆轉(zhuǎn)它們的死亡抑制活性，因此啟動細胞凋亡[13]。本研究證實，大波斯菊苷能夠引起線粒體上的多種促凋亡刺激來觸發(fā)Huh7細胞的凋亡。

肝癌與由不同病因引起的慢性炎性反應和肝臟的纖維化有關(guān)。IL-6是參與肝臟炎性反應的關(guān)鍵因素之一，在炎性反應中，IL-6通過控制肝急性期反應而充當激活劑，可以激活多種途徑，包括Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活劑（STAT）、p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和磷酸肌醇3激酶[14]。IL-10能夠抑制TNF-α和IL-23的富集，可以通過抑制T細胞和巨噬細胞促炎細胞因子的表達來限制炎性反應的程度[15]。IL-2可以誘導自然殺傷細胞并增強其溶細胞作用，促進去除自身反應性細胞和維持體內(nèi)平衡所需的許多其他免疫系統(tǒng)成分，激活單核-巨噬細胞，增強對腫瘤的殺傷作用[16]。TNF-α能夠通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達增強腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進腫瘤細胞的增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，大波斯菊苷能夠增加小鼠血清中IL-2和IL-10的水平，同時降低IL-6和TNF-α的水平，減緩炎性反應的發(fā)展。

肝臟的慢性炎性反應會損傷肝上皮細胞，引起脫氧核糖核酸（DNA）的損傷，增加基因組DNA突變的頻率。當高細胞增殖率和DNA突變結(jié)合在一起時，肝臟炎性反應的惡性轉(zhuǎn)化率便會大大增加[18]。促炎細胞因子的自分泌和旁分泌引起的慢性炎性反應會激活I(lǐng)κB激酶（IKK）的活性并導致核因子-κB（NF-κB）的組成性激活[19]。現(xiàn)有證據(jù)表明，NF-κB的活化可能是肝癌發(fā)生過程中的主要致癌驅(qū)動因素，這為選擇肝癌治療的分子靶標提供了思路[19]。NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可以被多種刺激激活，包括生長因子、細胞因子、淋巴因子、紫外線等，被認為是應激反應的一部分[20]。在正常情況下，NF-κB以無活性的狀態(tài)與IκB結(jié)合，廣泛存在于細胞質(zhì)中[21]。在TNF-α和IL-1β等因子的異常存在下，IKK復合物被激活，IKK作為IκB的激酶，能夠進一步磷酸化IκB蛋白并觸發(fā)IκB的泛素化和降解，從而釋放p50/p65異二聚體，使NF-κB易位至細胞核，引起下游基因的轉(zhuǎn)錄[22]。NF-κB在肝癌中激活后，能夠促進癌癥的發(fā)展和化學抗性，因此，尋找抑制NF-κB活性的藥物可能為抗癌治療提供新的思路[23-24]。

綜上所述，在Huh7細胞中，大波斯菊苷能夠通過影響線粒體功能進而誘導肝癌細胞的凋亡，該過程可能與NF-κB途徑相關(guān)；同時大波斯菊苷抑制肝癌發(fā)展的效果也進一步在Huh7細胞荷瘤裸鼠中得到證實，本研究結(jié)果將為開發(fā)大波斯菊苷作為抗肝癌藥物提供思路和一定的數(shù)據(jù)支持。