舒家武，李熙君，朱力勤，王燕燕

0 引言

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種人表皮生長(zhǎng)因子2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）、雌激素受體（estrogen receptor,ER）和孕激素受體（progesterone receptor,PR）均為陰性的乳腺癌。TNBC大約占所有乳腺癌患者的15%～20%，常見(jiàn)于年輕女性，并具有高侵襲、惡性程度高的特點(diǎn)[1]。目前，化療仍然是治療TNBC的主要手段。雖然在治療前期，傳統(tǒng)的化療有效，但TNBC惡性程度高，與其他亞型相比更易復(fù)發(fā)和死亡，4年內(nèi)的復(fù)發(fā)率超過(guò)70%[2]。因此，尋找TNBC的治療手段意義重大。

Long non-coding RNA（LncRNA）是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，它們參與著細(xì)胞增殖、分化、染色體重塑、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過(guò)程[3]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、耐藥及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition,EMT）等過(guò)程中起著重要作用[4]。LncRNA WT1-AS是Wilm’s腫瘤基因的翻譯轉(zhuǎn)錄物，編碼鋅指結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有致癌與抑癌作用[5]，它的表達(dá)量與肝癌患者的生存期呈正相關(guān)[6]，而與早期宮頸癌患者生存呈負(fù)相關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)WT1-AS在TNBC中表達(dá)顯著上調(diào)[8]。但目前關(guān)于WT1-AS在TNBC中的研究仍較少，本文通過(guò)檢測(cè)WT1-AS在TNBC細(xì)胞中的表達(dá)，探討WT1-AS對(duì)TNBC細(xì)胞侵襲、遷移的影響，探討其在TNBC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；DMEM/F12和L15培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；馬血清購(gòu)自上海Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、5×上樣緩沖液、RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑、嘌呤霉素及ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自上海Solarbio公司；Lipofectamine RNAiMAX和SYBR Select Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；shRNA-WT1-AS購(gòu)自上海RealGene公司；引物購(gòu)自上海英濰捷基公司；E-cadherin鼠單克隆抗體、N-cadherin鼠單克隆抗體、Vimentin鼠單克隆抗體、Snail鼠單克隆抗體、GAPDH鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記抗鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒感染 人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A使用含5%熱滅活馬血清、10 μg/ml胰島素、20 ng/ml EGF、100 ng/ml霍亂毒素和0.5 μg/ml氫化可的松DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天更換培養(yǎng)基。

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468使用含有10%熱滅活胎牛血清（FBS）的L15培養(yǎng)基于37℃，無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天更換培養(yǎng)基。

使用10cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)融合至50%～60%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine RNAiMAX將WT1-AS轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞。感染后培養(yǎng)4周，換成含嘌呤霉素（1.5 μg/ml）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)兩周，每3天更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基獲得慢病毒感染且穩(wěn)定敲除WS1-AS的MDAMB-231細(xì)胞株。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 參照說(shuō)明書利用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后利用SYBR Select Master Mix試劑盒在ABI 7900儀器上進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列：WT1-AS:5’-GCCTCTCTGTCCTCTTCTTTGT-3’（正義引物），長(zhǎng)度22 bp，5’-GCTGTGAGTCCTGGTGCTTAG-3’（反義引物），長(zhǎng)度21 bp；GAPDH:5’-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’（正義引物），長(zhǎng)度20 bp，5’-ACGACCAAATCCGTTGACTC3’（反義引物），長(zhǎng)度20 bp。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后用200 μl槍頭劃痕，然后用0.01 mol/L PBS沖洗3次，并更換為含有1%血清的培養(yǎng)基，劃痕后0、24 h觀察細(xì)胞遷移并拍照。遷移率=（寬度0h-寬度24h）/寬度0h×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室放置24孔板中，小室內(nèi)膜用Matrigel膠（1:8稀釋）80 μl均勻涂抹，37℃孵育30 min使膠凝固。使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋腫瘤細(xì)胞，將1×105個(gè)細(xì)胞（100 μl）加入Transwell上室，在下室中加入600 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞固定并用結(jié)晶紫染色，擦拭去掉內(nèi)膜的細(xì)胞，于鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集各組的心肌細(xì)胞，使用含有蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，并將蛋白液95℃處理5 min變性。取50 μg蛋白樣本行8%SDS-PAGE。濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和GAPDH抗體4℃過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用（）表示，組間比較采用Student’st-test檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA WT1-AS在TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，TNBC細(xì)胞MDAMB-231、MDA-MB-453、MDA-MB468中LncRNA WT1-AS的表達(dá)量顯著高于正常乳腺細(xì)胞MCF10A（P=0.001、P=0.007、P=0.005），見(jiàn)圖1A。轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞LncRNA WT1-AS的表達(dá)量顯著降低（P=0.001），見(jiàn)圖1B。

圖1 LncRNA WT1-AS在TNBC細(xì)胞中的表達(dá)Figure 1 Expression of LncRNA WT1-AS in triplenegative breast cancer (TNBC) cells

2.2 LncRNA WT1-AS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果顯示，在沉默MDA-MB-231細(xì)胞LncRNA WT1-AS表達(dá)后，穿膜細(xì)胞的數(shù)量由107±6下降至61±5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），見(jiàn)圖 2。表明下調(diào)LncRNA WT1-AS可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力。

2.3 LncRNA WT1-AS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默MDA-MB-231細(xì)胞LncRNA WT1-AS表達(dá)后，細(xì)胞在24 h時(shí)的遷移率顯著下降（Vector:（52.0±2.7）%,Si-WT1-AS:（35.6±2.9）%;P=0.002），見(jiàn)圖3。表明下調(diào)LncRNA WT1-AS可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力。

2.4 LncRNA WT1-AS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT的影響

Western blot結(jié)果顯示，沉默MDA-MB-231細(xì)胞LncRNA WT1-AS表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)量顯著上調(diào)（P=0.000），N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)量顯著下調(diào)（P=0.000），見(jiàn)圖4。說(shuō)明下調(diào)LncRNA WT1-AS抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的EMT能力。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA WT1-AS對(duì)MDAMB-231細(xì)胞侵襲能力的影響 (×200)Figure 2 Effect of LncRNA WT1-AS on invasion ability of MDA-MB-231 cells detected by Transwell assay (×200)

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA WT1-AS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響（×100）Figure 3 Effect of LncRNA WT1-AS on invasion ability of MDA-MB-231 cells detected by wound healing assay (×100)

3 討論

圖4 Western blot檢測(cè)LncRNA WT1-AS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)的影響Figure 4 Effect of LncRNA WT1-AS on E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and Snail expression in MDAMB-231 cells detected by Western blot

TNBC是乳腺癌中預(yù)后最差的亞型，其中位生存期很少超過(guò)18月[9]。只有30%～45%的TNBC患者可以達(dá)到與其他乳腺癌亞型相同的病理完全緩解和生存率[10]。目前，仍然沒(méi)有有效的靶點(diǎn)治療TNBC。LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要作用。眾多LncRNA在腫瘤中發(fā)生失調(diào)，它們可能是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，WT1-AS在人胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲受到抑制[11-12]。此外，過(guò)表達(dá)WT1-AS抑制了宮頸癌細(xì)胞的凋亡、遷移、侵襲[12]。目前關(guān)于WT1-AS在TNBC中的表達(dá)及其發(fā)生發(fā)展中的作用未見(jiàn)報(bào)道。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WT1-AS在MDAMB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-468等TNBC細(xì)胞中表達(dá)升高。沉默WT1-AS后，通過(guò)Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到抑制。這說(shuō)明WT1-AS具有促進(jìn)TNBC細(xì)胞MDA-MB-231侵襲與遷移的能力。

EMT是一種高度保守的細(xì)胞程序，調(diào)控極化上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可運(yùn)動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞間的黏附性降低，極性喪失，基質(zhì)重塑。EMT與腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展、腫瘤干細(xì)胞、遷移、腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)、侵襲及藥物抵抗相關(guān)[12]。E-cadherin、N-cadherin是跨膜黏附糖蛋白，EMT的進(jìn)程中出現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)上調(diào)，此外，Vimentin和Snail亦是EMT發(fā)生的兩個(gè)標(biāo)志物[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默WT1-AS后，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)下調(diào)。說(shuō)明沉默WT1-AS逆轉(zhuǎn)了MDA-MB-231細(xì)胞EMT的過(guò)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)WT1-AS在TNBC細(xì)胞的侵襲遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并發(fā)現(xiàn)WT1-AS通過(guò)調(diào)控EMT促進(jìn)TNBC細(xì)胞的侵襲遷移。這提示了調(diào)控WT1-AS也許是治療TNBC可能的手段之一，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。