劉紅云， 周 強(qiáng)， 李淑梅， 王付娟

(信陽農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院/河南省豫南農(nóng)作物有害生物綠色防控院士工作站， 河南 信陽 464000)

野生大豆(Glycinesoja)屬豆科(Leguminoase)蝶形花亞科(Papilionoideae)大豆屬(Glycine) Soja 亞屬[1]，屬于一年生草本植物，它的種子及根、莖、葉均可入藥。主要分布在東亞中北地區(qū)，包括中國、朝鮮半島、日本列島和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)。在我國，除了青海、新疆和海南外，其余省份均發(fā)現(xiàn)有野生大豆的分布[2]。熊振宇等[3]用20對ISSR引物對野生大豆與栽培大豆及其10份雜種F1進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討野生大豆與栽培大豆之間的遺傳關(guān)系。對野生大豆的遺傳多樣性研究，最早的是形態(tài)學(xué)、同位酶標(biāo)記，李軍等[4]利用聚丙烯酰胺電泳技術(shù)檢測了浙江金華南坡野生大豆種群內(nèi)14個樣本6種同工酶水平上的生化遺傳結(jié)構(gòu)及其變異。李為民等[5]為了研究陜西省不同居群野生大豆的遺傳多樣性，歸納了幾種常見DNA分子標(biāo)記技術(shù)的原理及特點(diǎn)，綜述了不同DNA分子標(biāo)記在野生大豆遺傳多樣性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)重復(fù)性高、簡單可靠，應(yīng)用于研究各種作物的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。嚴(yán)茂粉等[6]利用40對SSR引物對北京地區(qū)的野生大豆天然居群進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析。李為民等[7]利用SSR分子標(biāo)記對陜西省6個野生大豆自然種群和1個栽培大豆種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。王果等[8]以山西省的544份野生大豆為材料，分析了質(zhì)量性狀、數(shù)量性狀及SSR標(biāo)記遺傳多樣性。但對河南省野生大豆遺傳多樣性研究比較少見，尤其是河南省豫南地區(qū)的野生大豆。因此，對河南豫南地區(qū)12份野生大豆材料進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析，旨在分析河南省豫南地區(qū)野生大豆資源的遺傳多樣性分布特點(diǎn)，揭示豫南地區(qū)野生大豆的親緣關(guān)系，為河南省野生大豆種質(zhì)資源的利用與開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

12份野生大豆材料，于2019年10—11月分別在河南省信陽市平橋區(qū)、駐馬店市正陽縣、南陽市桐柏縣3個地點(diǎn)采集，其中信陽市5份、駐馬店市1份、南陽市6份。

1.2 器 材

研缽和研磨棒、1.5 mL離心管、植物組織基因組提取試劑盒、PCR儀、離心機(jī)、垂直板電泳槽、水平電泳儀、照膠儀、微波爐、水浴鍋。

1.3 試 劑

液氮、200 μL RCP tube、DNase-free water、2×Taq酶Mix、20對引物濃度為10 μmol·L-1、瓊脂糖、1%TBE、GelRed、EDTA。

1.4 方 法

1.4.1DNA提取

采用CTAB法，取泡水發(fā)芽的大豆組織(時間2～3周，2～3 cm)100 mg，置于液氮中在研缽里進(jìn)行研磨液體狀，快速盛入1.5 mL離心管中，編號，置于-20 ℃冰箱中保存，使用植物組織基因組提取試劑盒對研磨的樣本進(jìn)行基因組抽提；最終洗脫體積為100 μL；使用Nanodrop測定樣本DNA濃度，將測定濃度后的DNA樣品放置在4 ℃冰箱臨時保存。

1.4.2SSR標(biāo)記

PCR的反應(yīng)體系為：DNA模板4.5 μL(10 μg·L-1)，2×Taq酶 PCR Mix 10 μL，10 μmol·L-1正反引物各1.5 μL，加無菌水至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃下預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃循環(huán)60 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。

表1 12份樣本DNA濃度Table 1 DNA concentration of 12 soybean samples

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳檢測

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，120 V電壓條件下30～40 min電泳，待電泳結(jié)束后在照膠儀器上拍照保存膠圖。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對跑過的膠圖條帶進(jìn)行統(tǒng)計。使用Photoshop軟件對膠圖進(jìn)行修正處理，處理完后再用分析軟件Quality one對圖片進(jìn)行分析，對擴(kuò)增后的每個樣品的片段大小進(jìn)行確定，確定每個樣品的位點(diǎn)和條帶數(shù)。然后根據(jù)每個引物在各樣品上顯示的位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計帶數(shù)，有條帶的標(biāo)為1，無條帶的標(biāo)為0，將數(shù)據(jù)輸入軟件Excel中，創(chuàng)建矩陣，用Popgene 32軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析，然后根據(jù)遺傳相似系數(shù)用Ntsys 1.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

利用20對引物對豫南地區(qū)12份野生大豆基因組進(jìn)行擴(kuò)增，如表2所示，20對引物總共擴(kuò)增了360條帶，擴(kuò)增帶數(shù)最多的為42條(Satt 654)，如圖1所示；擴(kuò)增帶數(shù)最少的為8條(Satt 022)。20個位點(diǎn)共檢測到63個等位基因變異，平均每個位點(diǎn)擴(kuò)增3.1個等位基因。結(jié)果如圖2所示，并且20對SSR引物都表現(xiàn)出多態(tài)性，等位變異有隨著取樣范圍的縮小逐漸減少的趨勢。

表2 20對引物擴(kuò)增的結(jié)果Table 2 Amplification results of 20 pairs of primers

2.2 野生大豆的遺傳相似性分析

12份野生大豆的遺傳相似性如表3，每份材料的遺傳相似性變化范圍為0.590 9～0.954 5，平均為0.797 1，其中，XY 2與XY 4的遺傳相似性最高，為0.954 5，說明XY 2與XY 4的親緣關(guān)系較近；TB 2與TB 3的遺傳相似性最低，為0.590 9，說明TB 2與TB 3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，雖然地理位置相同，但親緣關(guān)系不同，可能是種群間出現(xiàn)了變異。

表3 12份材料的遺傳相似系數(shù)Table 3 Genetic similarity coefficient of 12 soybean materials

2.3 野生大豆的聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立的12份材料的樹狀聚類圖(圖3)。根據(jù)聚類圖，可以將這些材料分三大類。第一大類包括10份，分別為TB 6、TB 5、TB 4、XY 5、XY 3、XY 2、XY 4、ZY、XY 1、TB 1，又可分為2個亞類；第1亞類包括2份，分別為TB 6、TB 5；第2亞類包括8份，分別是TB 4、XY 5、XY 3、XY 2、XY 4、ZY、XY 1、TB 1。第二大類1份TB 3；第三大類1份TB 2。12份材料的遺傳距離都小于0.12，說明材料之間有較近的親緣關(guān)系。從聚類結(jié)果可以看出，SSR分子標(biāo)記與材料的地理來源并沒有明顯的相關(guān)性。

3 討 論

李建東等[9]利用40對引物對遼寧省30份野生大豆進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果表明，中部平原遺傳多樣性指數(shù)最高，其次為東部山地，西部丘陵最低，從聚類結(jié)果看到SSR分子標(biāo)記的結(jié)果與品種的地理來源沒有相關(guān)性。本研究對12份材料聚類分析，聚類結(jié)果分為三大類，三大類又分為2個亞類，從聚類結(jié)果看到，SSR分子標(biāo)記與材料的地理來源并沒有明顯的相關(guān)性。有可能是材料的地理距離太近，環(huán)境因素相似。

利用SSR分子標(biāo)記野生大豆種質(zhì)資源多樣性分析，得出12份野生大豆在分子水平上發(fā)生了一定的遺傳變化，野生大豆親緣關(guān)系與材料生長的地理環(huán)境、表型性狀等具有一定的相關(guān)性，同一區(qū)域收集到的野生大豆也表現(xiàn)出遺傳分化。與程春明等[10]對江西野生大豆的遺傳多樣性分析的結(jié)論一致。進(jìn)一步了解豫南地區(qū)野生大豆種質(zhì)資源的遺傳規(guī)律及進(jìn)化，也進(jìn)一步為野生大豆雜交育種及生理栽培研究等提供指導(dǎo)。由此可見，在豫南地區(qū)，積極發(fā)掘野生大豆，分析和研究利用其特性，拓寬大豆育種遺傳基礎(chǔ)是十分必要的。

4 結(jié) 論

本研究利用20對引物對12份野生大豆材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，20對引物對12份野生大豆共擴(kuò)增63個等位基因，平均每對引物擴(kuò)增3.1個等位基因。說明豫南地區(qū)具有較高的的遺傳多樣性，并且該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，有利于喜溫作物生長?；?0對SSR引物PCR結(jié)果的聚類分析能將12份材料分類出來，得知各材料之間親緣關(guān)系較近，SSR分子標(biāo)記與材料的地理來源并沒有明顯的相關(guān)性，進(jìn)而證實(shí)SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析中有很高的準(zhǔn)確性。由于當(dāng)時只是在豫南地區(qū)選擇3個點(diǎn)進(jìn)行收集野生大豆，一些野生大豆資源豐富的鄉(xiāng)鎮(zhèn)可能收集不夠全面，只有部分野生大豆的多樣性，結(jié)論僅供參考。今后將擴(kuò)大收集野生大豆的地區(qū)，豐富野生大豆的資源，有針對性地進(jìn)行研究，拓寬大豆育種的遺傳基礎(chǔ)。