曹羅元，楊 菁，富顯果，董文婿，林應(yīng)華，黃寶英

(寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建寧德 352100)

MiRNAs與靶mRNA的3′UTR(untranslated region)區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)而起作用，使其降解或抑制其表達(dá)，從而導(dǎo)致特定基因的沉默，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育及各種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)功能[1-3]。

膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤；發(fā)病率在我國(guó)泌尿生殖系腫瘤中位列第1，約30%患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。特別是高度惡性或侵犯肌層的膀胱癌采用化學(xué)療法也容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5-6]，尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療策略。采用特異的生物學(xué)標(biāo)記分子進(jìn)行早期診斷和病情評(píng)估是防治膀胱癌的關(guān)鍵，而全基因組分析法為膀胱癌發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)記分子提供了思路，其中miRNAs因其成為標(biāo)記分子的潛力最大，而受到極大的關(guān)注。既往研究表明，miR-143、miR-222和miR-452可作為膀胱癌腫瘤細(xì)胞分級(jí)和非侵襲性診斷的生物學(xué)標(biāo)記分子[7]；miR-325可作為膀胱癌的抑制分子[8]；miR-99a可通過調(diào)控成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3的活性，以抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]；miR-99a可作為一個(gè)有價(jià)值的診斷性生物標(biāo)志分子[10]；miR-96作為膀胱癌患者的治療靶點(diǎn)[11]，以上研究表明miRNA在膀胱癌進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，使miRNAs作為腫瘤標(biāo)記分子成為可能。

PASCUT等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-4258在脂肪變性過程中存在關(guān)聯(lián)性，本課題組在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-4258可抑制轉(zhuǎn)分化過程[13]。既往研究表明細(xì)胞分化過程與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)[14-16]，但關(guān)于miR-4258在膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們對(duì)此進(jìn)行研究，尋找防護(hù)和治療膀胱癌提供新的潛在靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4258在CDH19 3′UTR存在調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)；miR-4258可能通過下調(diào)CDH19的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)了T24細(xì)胞分化，增強(qiáng)了膀胱癌T24細(xì)胞的遷移和侵襲能力。現(xiàn)將研究結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系T24購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。11例癌組織及癌旁正常組織取自寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院膀胱尿路上皮癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，男性7例，女性4例，患者年齡為(57.42±12.67)歲；經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)前告知標(biāo)本用途，并簽訂了知情同意書。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，Rt-qPCR)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；培養(yǎng)基RPMI-1640、胰蛋白酶(Trypsin)、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，脂質(zhì)體2000購(gòu)自Thermo公司，pmirGLO載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司。miRNeasy mini試劑盒均購(gòu)自Qiagen公司。CDH19、E-cadherin和α-SMA抗體均購(gòu)自Abcam公司，所用內(nèi)參和二抗購(gòu)自Santa cruz公司。使用來自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司miR-4258 mimics、miR-4258 inhibitor、陰性對(duì)照(miRNA-ctrl)和實(shí)時(shí)定量PCR引物。

1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞分miR-ctrl對(duì)照組、miR-4258 mimics組和miR-4258 inhibitor組，每組細(xì)胞按1.5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后按照Invitrogen說明書將待轉(zhuǎn)染的miRNA oligomer 與脂質(zhì)體2000 均勻混合后，室溫靜置20 min 后滴入各組細(xì)胞孔板，6 h后換完全培養(yǎng)基液。所有分組細(xì)胞均在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)TargetScan 7.2和miRwalk 2預(yù)測(cè)miR-4258的靶基因，通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶基因驗(yàn)證。CDH19上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCG AACCCAATGGTAGTCTTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；CDH19突變上游引物5′AGCTTTGTTTAAACCCTGGCTCTATGGCTTTGAAAGCCCTA3′，下游引物5′CCGCTCGAGTAGAATGAATCATGGCATCT3′；構(gòu)建野生型質(zhì)粒pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT突變型質(zhì)粒。使用0.5 μg pmirGLO，pmirGLO-3′UTR-CDH19-WT和pmirGLO-3′UTR-CDH19-MUT分別與25 nm的miR-4258 mimics或25 nm的miR-NC共轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞。

1.4 定量PCR檢測(cè)miR-4258差異表達(dá)用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)定量檢測(cè)RNA樣品，將A260 nm/A280 nm比值為1.8～2.1的RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板定量樣本中miR-4258和U6snRNA的表達(dá)量。miR-4258上游引物5′GCATCCCCGCCACCG3′，下游引物5′TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC3′；U6snRNA上游引物5′ATTGGAACGATACAG AGAAGATT3′，下游引物5′GGAACGCTTCACGAATTTG3′。采用TaKaRa SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit，經(jīng)ABI StepOnePlus Real-Time PCR System擴(kuò)增。以U6snRNA為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct各組基因的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，3次結(jié)果取平均值。

1.5 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)CDH19、E-cadherin和α-SMA的表達(dá)T24細(xì)胞按分組干預(yù)培養(yǎng)72 h，提取各組總蛋白，經(jīng)BCA定量后，取細(xì)胞裂解蛋白10 μg，經(jīng)10 g/L SDS-PAGE 凝膠電泳2 h，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)轉(zhuǎn)膜(200 mA，1 h)； 50 g/L脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，分別加入E-cadherin、α-SMA、CDH19和磷酸甘油醛脫氫酶抗體，4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；洗膜后加電化學(xué)發(fā)光劑(electrochemiluminescence，ECL)顯影，將PVDF 膜放入Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，3次結(jié)果取平均值。所得免疫印跡通過Image J軟件獲得各實(shí)驗(yàn)組與內(nèi)參灰度值的比值。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)小室細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)各組細(xì)胞接種前進(jìn)行饑餓培養(yǎng)12 h，將Transwell小室(已鋪Matrigel膠)室溫水化后將膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基200 μL/室接種于Transwell小室上室，細(xì)胞終濃度為1×104個(gè)/室；向下室加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)24 h，后取出Transwell小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞1 g/L結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)各個(gè)小室細(xì)胞數(shù)。

1.7 明膠酶譜法測(cè)定MMP-2活性各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集各組同體積培養(yǎng)液濃縮后，在10%的聚丙烯酰胺凝膠(含0.1 %明膠)電泳分離蛋白，體積分?jǐn)?shù)為2.5%的TritonX-100洗30 min 2次，后將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育48 h。經(jīng)染色液染色，甲醇脫色后，顯示出透亮帶，采用Image J分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-4258靶基因預(yù)測(cè)和驗(yàn)證在線生物信息預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-4258的靶基因，提示miR-4258潛在的作用靶基因是CHD19(圖1A)。CDH19是位于18號(hào)染色體上，編碼一種鈣依賴細(xì)胞-細(xì)胞黏附糖蛋白，是Ⅱ型鈣黏蛋白基因，鈣黏蛋白的丟失可能與癌癥的形成有關(guān)。

我們通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶基因驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組質(zhì)粒和miR-4258 mimics共轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞時(shí)，CDH19-3′UTR-WT野生型組的熒光素酶活性較對(duì)照組顯著下降(圖1B)，而突變型組熒光素酶活性無明顯變化。說明CDH19是miR-4258的直接靶點(diǎn)，miR-4258通過直接與CDH19的3′UTR上的序列結(jié)合，抑制CDH19的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)控CDH19蛋白的表達(dá)；且RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-4258在膀胱癌及癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為(6.63±1.49)和(2.79±0.68)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.711，P<0.01，圖1D)。

2.2 miR-4258對(duì)T24細(xì)胞分化的作用Western blot檢測(cè) miR-4258 mimics和inhibitor對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的作用，發(fā)現(xiàn)與miR-ctrl組相比miR-4258 mimics組中的E-cadherin和CDH19蛋白表達(dá)量顯著降低，而α-SMA的表達(dá)明顯下調(diào)(圖2)。E-cadherin在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)維持上皮細(xì)胞黏性和極性具有重要的作用。α-SMA作為間質(zhì)細(xì)胞特征分子，是判斷間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志蛋白。既往研究表明上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程與上皮細(xì)胞的腫瘤密切相關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4258的差異表達(dá)和T24細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)，可能通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而發(fā)揮在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控作用。

A:Western blot檢測(cè)E-cadherin的蛋白表達(dá)水平；B:Western blot檢測(cè)CDH19和α-SMA的蛋白表達(dá)水平；C：E-cadherin、CDH19和α-SMA的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。與miR-ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 miR-4258對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響膀胱癌T24細(xì)胞是高度轉(zhuǎn)移性的細(xì)胞，為了探究miR-4258是否影響T24細(xì)胞侵襲能力，本研究通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與miR-ctrl組相比，miR-4258 mimics 組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增加[(82±6.81)vs.(60±5.57)，P<0.01]；miR-4258 inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少[(42±4.58)vs.(60±5.57)，P<0.01]，而miR-ctrl組和正常處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

A：Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫，×100)；B:實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞遷移數(shù)量。與miR-ctrl組比較，*P<0.05,** P<0.01。

2.4 miR-4258對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2酶活性的影響基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起到了關(guān)鍵作用?；|(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)基因是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，屬于明膠酶，涉及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，是最重要的抗腫瘤靶標(biāo)。明膠酶譜法是一種簡(jiǎn)單而有效的檢測(cè)蛋白水解酶的方法。本研究采用明膠酶譜法測(cè)定miR-4258對(duì)T24細(xì)胞MMP2酶活性的影響，結(jié)果顯示，miR-4258 mimics組MMP2酶活性較miR-ctrl組顯著提高，而miR-4258 inhibitor組MMP2酶活性較miR-ctrl組明顯降低，說明miR-4258表達(dá)水平影響了MMP2活性(圖4)。

A：明膠酶譜法測(cè)定各組細(xì)胞MMP2酶活性；B:MMP2相對(duì)酶活性；與miR-ctrl組比較，

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，miRNAs可能成為腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)[17-19]，如尿液中miR-96與miR-183可作為膀胱上皮癌的腫瘤標(biāo)記物[20]。BRAICU等[21]研究表明miRNAs將作為膀胱癌預(yù)后的關(guān)鍵分子，該團(tuán)隊(duì)在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為生物標(biāo)志物或靶向治療策略的開發(fā)時(shí)機(jī)或已成熟。因此，腫瘤細(xì)胞特異miRNA的差異表達(dá)將為腫瘤早期診斷帶來巨大的便利與突破[22-24]。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，伴隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞的黏性不斷下降，而侵襲轉(zhuǎn)移能力不斷增強(qiáng)[25]。以上研究說明，miRNAs在膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用，可作為膀胱癌潛在生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本課題組選取當(dāng)前癌癥治療方案-基因靶向治療中的miRNA進(jìn)行研究，我們通過RT-qPCR檢測(cè)膀胱上皮癌組織及癌旁正常組織的miR-4258表達(dá)情況。結(jié)果表明，miR-4258在膀胱上皮癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.711，P<0.01)。為進(jìn)一步研究miR-4258在膀胱癌中的具體作用及調(diào)控機(jī)制，我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-4258的靶基因并采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；結(jié)果顯示，CDH19是miR-4258的靶基因。隨后，我們采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了miR-4258對(duì)細(xì)胞分化和侵襲的影響，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-4258 mimics、inhibitor和miR-ctrl分別轉(zhuǎn)染至膀胱癌T24細(xì)胞中，檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明與miR-ctrl相比，miR-4258 mimics組CDH19和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，而α-SMA的表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)；說明miR-4258的過表達(dá)促進(jìn)了T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，而既往研究表明細(xì)胞分化過程與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)[14-16]。通過侵襲實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)MMP2酶活性探討miR-4258對(duì)膀胱癌生物學(xué)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-4258 mimics組MMP2的活性較miR-ctrl組顯著提高(P<0.01)，同時(shí)T24細(xì)胞的侵襲能力也得到明顯增強(qiáng)。

CDH19是鈣依賴性細(xì)胞黏附糖蛋白，鈣黏蛋白的丟失可能與癌癥的形成有關(guān)，CDH19在惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)程中具有重要的作用[26]。我們發(fā)現(xiàn)在T24細(xì)胞中，miR-4258通過靶向負(fù)調(diào)控CDH19的表達(dá)水平，miR-4258的差異表達(dá)能夠顯著影響CDH19 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，來調(diào)控T24細(xì)胞的分化、侵襲。同時(shí)miR-4258 mimics也增強(qiáng)了T24細(xì)胞的遷移能力，并提高了MMP2的酶活性。MMP2是降解上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中所生成的細(xì)胞外基質(zhì)的主要分子，它通過血管和淋巴系統(tǒng)在膀胱癌的腫瘤侵襲和末端轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，miR-4258在膀胱上皮癌組織中顯著高表達(dá)，上調(diào)miR-4258表達(dá)促進(jìn)了T24細(xì)胞的分化和侵襲能力，其調(diào)控方式可能是miR-4258靶向調(diào)控CDH19的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮在膀胱癌T24細(xì)胞分化和侵襲過程中的調(diào)控作用；提示miR-4258在膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。后續(xù)我們將在組織學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證CDH19的差異表達(dá)，比較膀胱癌組織和癌旁組織間CDH19的表達(dá)水平，以及miR-4258的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，繼續(xù)探究miR-4258作為膀胱癌生物學(xué)分子標(biāo)記的可能性，為臨床實(shí)踐中膀胱癌的診療提供科學(xué)依據(jù)與實(shí)踐基礎(chǔ)。