姚莎莎，盤如剛，甘春芳

0引言

青光眼是常見的致盲眼病，目前主要采用青光眼濾過手術(shù)治療[1]。但手術(shù)操作會(huì)促進(jìn)手術(shù)周圍組織中成纖維細(xì)胞的增生，致使濾過通道閉合，導(dǎo)致青光眼濾過手術(shù)失敗，據(jù)統(tǒng)計(jì)青光眼濾過手術(shù)2a后失敗率高達(dá)20%[2-3]。目前，常用抗代謝藥物抑制青光眼濾過術(shù)后手術(shù)周圍組織的自我修復(fù)，但這些藥物具有一定的毒副作用，因此尋找毒副作用小且高效的治療方法和藥物是目前研究的熱點(diǎn)[4-5]。RNA干擾技術(shù)是目前較為先進(jìn)的技術(shù)之一，是利用配對(duì)的小片段RNA植入細(xì)胞達(dá)到阻止同源基因表達(dá)的技術(shù)[6]。可以利用RNA干擾技術(shù)抑制成纖維細(xì)胞增生相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低患者術(shù)后手術(shù)失敗率。熱休克蛋白47(heat shock protein47，HSP47)屬于熱休克蛋白家族，參與組織器官纖維化的生理病理過程[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常人群，膠原異常增生性疾病患者的HSP47陽性表達(dá)水平異常升高，如病理性瘢痕、梭形細(xì)胞脂肪瘤等[8]。而青光眼濾過手術(shù)后Tenon囊的愈合與病理性瘢痕有極大的相似之處，因此，推測(cè)HSP47與青光眼濾過手術(shù)后Tenon囊的愈合有著一定的關(guān)聯(lián)。本文將探究HSP47 siRNA對(duì)體外培養(yǎng)人眼Tenon囊成纖維(HTCF)細(xì)胞生物學(xué)行為及TGF-β1表達(dá)水平影響，以期為臨床防控青光眼濾過手術(shù)治療失敗提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要細(xì)胞人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器Lipofectamine 2000(貨號(hào)：11668-027，批號(hào)：062018)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；Trizol試劑(貨號(hào)：15596026，批號(hào)：18T1905)購(gòu)自美國(guó)Sigma；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Bcl-2抗體(貨號(hào)：sc-56015；批號(hào)：20190603)、Bax抗體(貨號(hào)：sc-70407；批號(hào)：20190606)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze Biotechnology；HSP47抗體(貨號(hào)：ab242006)、Ki67抗體(貨號(hào)：ab205718)、N-cadherin抗體(貨號(hào)：ab18203；批號(hào)：20190814)、E-cadherin抗體(貨號(hào)：ab194982；批號(hào)：20191011)購(gòu)自美國(guó)Abcam；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning Coseter；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：BX50)購(gòu)自日本Olympus；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Attune NxT)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代取出保存在液氮罐中的HTCF細(xì)胞，置于37℃的恒溫水浴中解凍，放入離心機(jī)中以1000r/min離心5min，使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合到約90%時(shí)，去除舊的培養(yǎng)液使用PBS沖洗，消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HSP47 siRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則選擇堿基序列，正義鏈：5’-ACCTCGCCACACTGGGATGAG AAATTTCAAGAGAATTTCTCATCCCAGTGTGGCTT-3’反義鏈：5’-CAAAAAGCCACACTGGGATGAGAAATTTCTCTTGAAATTTCTCACCCAGTGTGGCG-3。通過合成核苷酸序列的稀釋，核苷酸的退火，目的基因與載體的連接，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒的抽提步驟構(gòu)建HSP47 siRNA重組質(zhì)粒并通過酶切鑒定和測(cè)序鑒定對(duì)重組的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.2.3重組質(zhì)粒及分組轉(zhuǎn)染前將HTCF細(xì)胞在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長(zhǎng)匯合至90%～95%，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度達(dá)標(biāo)后，經(jīng)Lipofectamine 2000試劑盒將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HTCF細(xì)胞，并分為：空白對(duì)照組、空載體組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組根據(jù)HSP47基因序列設(shè)計(jì)并合成干擾siRNA序列，構(gòu)建載體并導(dǎo)入HTCF細(xì)胞中；空載體組導(dǎo)入空白載體。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)HSP47 mRNA水平取上述培養(yǎng)的HTCF細(xì)胞，使用恒溫離心機(jī)在4℃的恒溫條件下離心10min，后加入Trizol溶液提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA鏈，再以cDNA鏈為模板，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算HSP47 mRNA的相對(duì)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)取上述培養(yǎng)的HTCF細(xì)胞，使用恒溫離心機(jī)在4℃的恒溫條件下離心10min，后加入裂解液裂解后提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后混入Loading Buffer緩沖液，水浴變性10min。電泳分離提取的蛋白樣品，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜，浸于5%脫脂奶粉中室溫下孵育2h，再加入一抗液(1∶1000)中，4℃下孵育過夜。接著加入二抗液(1∶8000)中，37℃孵育1h，最后暗室曝光顯影。計(jì)算目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值比值，表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖取上述培養(yǎng)的HTCF細(xì)胞，制備1×105/mL單細(xì)胞懸液接種于六孔板，正常培養(yǎng)2wk，顯微鏡下觀察是否有肉眼可見的克隆形成，再滴加結(jié)晶紫染液染色并拍照，計(jì)算克隆形成率(克隆數(shù)/所種細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡取上述培養(yǎng)的HTCF細(xì)胞，以1 000r/min離心5min，充分混勻100μL Binding Buffer、5μL Annexin V-FITC和5μL PI，懸浮細(xì)胞；室溫避光孵育15min后，再次加入400μL的Binding Buffer混勻后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/所種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.8 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲以5μg matrigel均勻包被Transwell小室，調(diào)整細(xì)胞量2×105個(gè)/孔接種于上室，下室添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24h，去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞，固定于多聚甲醛中，結(jié)晶紫染色后，隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)染色細(xì)胞(侵襲細(xì)胞)數(shù)目平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.9劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移取上述培養(yǎng)的HTCF細(xì)胞，制備1×105/mL單細(xì)胞懸液接種于六孔板，正常培養(yǎng)24h，用1mL槍頭垂直于培養(yǎng)孔中央劃線，100倍顯微鏡下拍照并測(cè)量0h“劃痕”寬度，繼續(xù)培養(yǎng)24h后再次拍照并測(cè)量“劃痕”寬度，細(xì)胞愈合率=(0h“劃痕”寬度-24h“劃痕”寬度)/0h“劃痕”寬度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1 HSP47 siRNA對(duì)HTCF細(xì)胞中HSP47表達(dá)的影響由RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)可以看出，相比空白對(duì)照組，空載體組HSP47 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.484，P=0.645；t=0.753，P=0.480)；相比空載體組，轉(zhuǎn)染組HSP47 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(t=6.133，P<0.001；t=5.017，P<0.001)，見圖1和表1。

2.2沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞增殖影響由克隆形成實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)可以看出，相比空白對(duì)照組，空載體組克隆形成率和Ki67蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.034，P=0.341；t=0.351，P=0.737)；相比空載體組，轉(zhuǎn)染組克隆形成率和Ki67蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(t=9.072，P<0.001；t=11.938，P<0.001)，見圖2，表2。

圖1 HSP47 siRNA對(duì)HTCF細(xì)胞中HSP47蛋白表達(dá)的影響。

圖2 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞增殖影響 A：克隆形成實(shí)驗(yàn)拍照(×100)；B：增殖相關(guān)蛋白Ki67表達(dá)情況。

圖3 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞凋亡影響 A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B：凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)情況。

表1 HSP47 siRNA對(duì)HTCF細(xì)胞中HSP47表達(dá)的影響

表2 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞增殖影響

表3 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞凋亡影響

2.3沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞凋亡影響由流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)可以看出，各組細(xì)胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3，表3。

2.4沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞侵襲及遷移影響由劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)可以看出，相比空白對(duì)照組，空載體組細(xì)胞愈合率(t=0.375，P=0.721)、E-cadherin(t=0.470，P=0.655)和N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平(t=0.773，P=0.469)、單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目(t=0.561，P=0.595)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相比空載體組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞愈合率(t=3.197，P=0.019)、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平(t=3.382，P=0.015)、單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目(t=4.854，P=0.003)均顯著降低，E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(t=5.639，P=0.001)，見圖4，表4。

圖4 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞侵襲遷移影響 A：劃痕實(shí)驗(yàn)拍照?qǐng)D(×100)；B：遷移相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)情況；C：Transwell小室檢測(cè)結(jié)果(×400)。

表4 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞侵襲遷移影響

圖5 沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平影響。

2.5沉默HSP47對(duì)HTCF細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平影響三組TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.982，P=0.006)。相比空白對(duì)照組(0.78±0.15)，空載體組TGF-β1蛋白(0.81±0.10)相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.323,P=0.758)；相比空載體組，轉(zhuǎn)染組TGF-β1蛋白(0.37±0.09)相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=4.732,P=0.003)，見圖5。

3討論

青光眼濾過手術(shù)失敗的機(jī)制較為復(fù)雜，其中HTCF細(xì)胞的過度增殖是重要因素之一[9]。Ki67是一種常見的調(diào)控細(xì)胞增殖的蛋白，可維持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，并促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，其表達(dá)水平越高細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)[10-11]。本研究通過克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP47 siRNA可以抑制HTCF細(xì)胞的增殖。為了探究其機(jī)制，本研究進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Ki67的水平發(fā)現(xiàn)，相比空載體組，轉(zhuǎn)染組克隆形成率和Ki67蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低。說明HSP47 siRNA可以通過抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制HTCF細(xì)胞的增殖。

HTCF屬于結(jié)膜下結(jié)締組織，在受到手術(shù)創(chuàng)傷刺激下成纖維細(xì)胞就會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)分化而形成肌成纖維細(xì)胞，激活了整個(gè)瘢痕反應(yīng)[12]。其中細(xì)胞的凋亡就會(huì)促進(jìn)整個(gè)反應(yīng)，細(xì)胞的凋亡受到相關(guān)基因的調(diào)控，如Bcl-2家族蛋白，該家族中主要包括：Bcl-2蛋白和Bax蛋白，其中Bcl-2是一種抗凋亡基因，Bax是一種凋亡基因，Bcl-2/Bax平衡的變化是促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP47 siRNA對(duì)細(xì)胞的凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)水平并沒有影響。說明沉默HSP47確實(shí)對(duì)HTCF細(xì)胞的凋亡無影響。

細(xì)胞外基質(zhì)中瘢痕組織的過多聚集也是導(dǎo)致青光眼濾過手術(shù)失敗的重要因素之一[15]。HTCF細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中瘢痕組織的聚集，故抑制HTCF細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力可以一定程度上防止細(xì)胞外基質(zhì)中瘢痕組織的聚集。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchyml transition，EMT)是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的重要機(jī)制[16]，上皮細(xì)胞暫時(shí)極性的喪失將導(dǎo)致細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)能力[17-18]。同時(shí)，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)對(duì)于細(xì)胞連接、維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)有重要作用，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，將增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[19-20]。本研究中，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到了顯著的抑制。隨后采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高。說明HSP47 siRNA可以通過調(diào)控HTCF細(xì)胞的EMT過程實(shí)現(xiàn)抑制其運(yùn)動(dòng)能力，故沉默HSP47表達(dá)可減少細(xì)胞外基質(zhì)中瘢痕組織的過多聚集。

TGF-β1是一種多肽類生長(zhǎng)因子，是目前為止研究最為廣泛的纖維化因子[21]。TGF-β1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，同時(shí)還能誘使成纖維細(xì)胞的分化，促進(jìn)前膠原的合成。青光眼濾過手術(shù)后，若手術(shù)周圍瘢痕組織的過多聚集，將引起手術(shù)區(qū)域瘢痕性愈合，最終導(dǎo)致手術(shù)失敗[22-23]。本研究檢測(cè)了HTCF細(xì)胞中的TGF-β1含量水平發(fā)現(xiàn)，相比空載體組，轉(zhuǎn)染組TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低。說明沉默HSP47可以有效抑制TGF-β1蛋白的表達(dá)，防止手術(shù)后區(qū)域瘢痕性愈合導(dǎo)致手術(shù)失敗。這可能是因?yàn)镠SP47 siRNA抑制了TGF-β1促進(jìn)膠原合成的作用，緩解了細(xì)胞外基質(zhì)中瘢痕組織的聚集。Zhu等[24]研究表明：通過RNA干擾技術(shù)可以有效抑制TGF-β1的合成，抑制HTCF細(xì)胞的增殖和成纖維細(xì)胞的形成，本研究得出的結(jié)論與其相一致。

綜上所述，HSP47 siRNA可以抑制TGF-β1促進(jìn)HTCF細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，但對(duì)HTCF細(xì)胞的凋亡無明顯影響。