張紅磊 李軍玲 張融雪 郭彥麗 劉靜妍 蘇京平 佟 卉 劉燕清 王勝軍 孫 玥

(天津市農(nóng)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津市農(nóng)作物研究所)，天津 300384)

生物遺傳轉(zhuǎn)化所構(gòu)建的表達(dá)載體中常常插入了便于篩選用的標(biāo)記基因。在遺傳轉(zhuǎn)化之后，植物表達(dá)載體上所有的插入序列一起整合到受體植物染色體基因組中。表達(dá)載體上的選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物能使成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生抗性而存活，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則不能生長。所以此方法能夠從大量的細(xì)胞及組織篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株，是一種比較方便、快速的轉(zhuǎn)基因植物鑒定方法。而目前最常用的選擇標(biāo)記基因主要有2大類：抗生素抗性酶基因和抗除草劑抗性酶基因。抗生素抗性酶基因可產(chǎn)生對某種抗生素有抗性的物質(zhì)，而抗除草劑抗性酶基因可產(chǎn)生對相應(yīng)除草劑有抗性的物質(zhì)。轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞可以在含有抗生素或除草劑的培養(yǎng)基上正常生長。在生物遺傳轉(zhuǎn)化中抗生素抗性酶基因有nptⅡ基因(產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗卡那霉素和新霉素等)、hpt基因(產(chǎn)生潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，抗潮霉素)和gent基因(產(chǎn)生慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗慶大霉素)等。在這些抗生素抗性基因中，潮霉素因高效和低假陽性常被用于多種物種如：植物[1-2]、酵母[3]、真菌[4-5]、動(dòng)物[6]的遺傳轉(zhuǎn)化中。而抗除草劑基因有epsp基因(產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘膦)、bar基因(產(chǎn)生草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗草丁膦或草甘膦)等[7]，這些篩選標(biāo)記雖然常用，但是使用成本較高。ALS是植物和微生物合成支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)的關(guān)鍵酶，動(dòng)物和人沒有該酶，是理想的除草劑靶標(biāo)。通過前期研究發(fā)現(xiàn)水稻ALS基因突變型OsALSS627N對咪唑啉酮類除草劑有良好抗性，所對應(yīng)的咪唑咪酮類除草劑[8]與其相比較便宜，咪唑咪酮類除草劑具有高效、殺草譜廣、高選擇性和對人畜高度安全等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)材料：水稻品種“選1”材料中的ALS基因，1880位點(diǎn)發(fā)生突變，由原有的T變?yōu)镚(已克隆)；生態(tài)型Columbia-0擬南芥。

(2)菌種：大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ALS基因的克隆與鑒定

ALS基因全長為1 935 bp，GC含量高，并且分布極不對稱。沿著ALS的轉(zhuǎn)錄方向，GC含量逐漸降低。在ALS基因的5’末端的500 bp，GC含量高達(dá)76.5%，而3 7末端的300 bp，GC含量則在50%。對于高GC含量或低GC含量的區(qū)域，在做PCR時(shí)不容易擴(kuò)增，再加上ALS基因的上述特點(diǎn)，使得ALS基因的克隆難度進(jìn)一步增加。針對ALS基因難以克隆這一難題，本文設(shè)計(jì)了多對引物。實(shí)驗(yàn)前期采用多對引物進(jìn)行了PCR條件的摸索，但一直沒能擴(kuò)增出目的條帶。所以對ALS基因的克隆采取了套式PCR(又稱巢式PCR)的策略，即在基因的外側(cè)設(shè)計(jì)一對外側(cè)的引物，可擴(kuò)增出長于基因全長的片段，并且完整的目的基因包含在擴(kuò)增的長片段中。第二對引物稱為巢式引物(因?yàn)樗麄冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。期望通過套式PCR來提高ALS基因的特異性擴(kuò)增。

1.2.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建

將用內(nèi)側(cè)引物ALS-F3、ALS-R5進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的2 000 bp左右的目的ALS基因條帶，用凝膠回收試劑盒回收該片段后，將ALS基因克隆到pEASY-T1 Simple vector載體上，得到pT-ALS，質(zhì)粒pT-ALS用Bgl II、Nde I雙酶切后得2 000 bp左右的ALS基因條帶。載體pEXP-35S-TP-PA用Bgl II、NdeI雙酶切(分步酶切)去掉TP后，經(jīng)凝膠電泳切膠回收后，與膠回收的ALS基因通過連接酶連接，得到質(zhì)粒pEXP-35S-ALS-PA。用限制性內(nèi)切酶kpnI和Xba I共同對pEXP-35S-ALS-PA和pCAMBIA 1301載體進(jìn)行雙酶切，將pEXP-35S-ALS-PA雙酶切后的片段表達(dá)盒35S-ALS-PA和pCAMBIA 1 30 1雙酶切后的大片段利用Axygen公司的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并利用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，獲得轉(zhuǎn)化子1301-ALS。將該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌Eha105， 用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.3 擬南芥的轉(zhuǎn)化

擬南芥種子消毒之后在4 ℃下春化3 d。而后將種子鋪于1/2 MS 培養(yǎng)基上(含糖為1%，pH為6.2)。培養(yǎng)條件為(21±1) ℃，光照周期16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)條件為(21±1) ℃。14 d后將長出的幼苗移入營養(yǎng)土內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待擬南芥開花之后用10 mL 5%的蔗糖溶液重懸農(nóng)桿菌菌體，并加0．05%的Silwet L．77溶液對擬南芥進(jìn)行侵染，侵染24 h之后的擬南芥在16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定及純合體的篩選

分子鑒定所用的引物為35：GAGGACCTAACAGAACTCGCCG，GUS-R：TCGCGATCCAGACTGAATGCC 。獲得的T0代的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子消毒后鋪種在的MS培養(yǎng)基(含有潮酶素抗性)上。將經(jīng)抗性篩選長成的植株，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR，收取PCR陽性植株的種子。T1代種子單棵收取陽性植株的種子。同理收T2代種子。單棵收取的T2代種子，選取T3代的種子鋪種在培養(yǎng)基上(含有潮酶素抗性)，如果均為抗性苗，則為純合體植株。收取純合體植株種子，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的獲得及鑒定

本實(shí)驗(yàn)室首先將“選1”ALS構(gòu)建到pCAMBIA 1301上，之后提取pCAMBIA 1301-ALS質(zhì)粒，再將其質(zhì)粒對農(nóng)桿菌Gv3101進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功得到了Gv3101．pCAMBIA 1301-ALS菌株，之后用浸花法對擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)化后收種。用潮霉素從T0ALS擬南芥種子中重新篩選得到10個(gè)株系，提取其DNA，用引物(35SF：GAGGACCTAACAGAACTCGCCG，GUS-R：TCGCGATCCAGACTGAATGCC)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

泳道M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量15 000 bp；泳道1：WT；泳道2：pCAMBIA 1301-ALS質(zhì)粒。

泳道3：T0ALS1；泳道4：T0ALS2；泳道5：T0ALS3；泳道6：T0ALS4。

泳道7：T0ALS5；泳道8：T0ALS6；泳道9：T0ALS7；泳道10：T0ALS8。

泳道11：T0ALS9；泳道12：T0ALS10。

結(jié)果表明，10個(gè)株系除了T0ALS7均得到了正確的條帶。則T0ALS1-6、8-10均為轉(zhuǎn)基因株系。利用潮霉素(30 mg/L)對以上9個(gè)株系繼續(xù)進(jìn)行純合體植株的篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 潮霉素篩選結(jié)果

選取抗性比例接近3∶1的進(jìn)行純合體的篩選實(shí)驗(yàn)，得到6株純合體株系(標(biāo)記為5-2、5-4、5-5、5-9、6-1、6-4和6-9)，用于后續(xù)除草劑篩選質(zhì)量濃度的摸索。

2.2 擬南芥純合體株系的咪唑啉酮類除草劑甲氧咪草煙篩選濃度摸索

圖1材料中的ALS基因具有咪唑啉酮類除草劑的抗性，對于得到純合體株系可以用甲氧咪草煙(咪唑啉酮類除草劑)進(jìn)行測定，除草劑的質(zhì)量濃度初步設(shè)定為0、0.25、0.5、0.75、1 mg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別對WT株系和純合體株系進(jìn)行處理，處理結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，WT與純合體株系在0 mg/L條件下生長正常，WT與純合體株系于0.25 mg/L處理下出現(xiàn)了顯著明顯的生長抑制，當(dāng)處理質(zhì)量濃度更高時(shí)WT與純合體株系均生長抑制，推測處理質(zhì)量濃度太高導(dǎo)致WT與純合體株系不生長，所以降低處理質(zhì)量濃度繼續(xù)進(jìn)行除草劑質(zhì)量濃度摸索實(shí)驗(yàn)。

圖2 純合體株系擬南芥7 d的除草劑處理結(jié)果

降低除草劑的質(zhì)量濃度繼續(xù)對純合體株系進(jìn)行除草劑處理，本次設(shè)計(jì)的除草劑質(zhì)量濃度為0、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L處理7 d，結(jié)果如圖3所示。

圖3 純合體株系擬南芥7 d的除草劑處理結(jié)果

由圖4可見，WT與純合體株系在0mg/L條件下生長正常，當(dāng)處理質(zhì)量濃度為0.005 mg/L時(shí)下WT與純合體株系的生長均受到一定抑制，但對WT和純合體株系的抑制程度的差異達(dá)到極顯著水平，當(dāng)處理質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時(shí)對WT抑制程度比對純合體株系抑制程度更明顯達(dá)到極顯著水平。而當(dāng)質(zhì)量濃度更高時(shí)對WT的抑制更為明顯，但WT和純合體株系的抑制程度差異達(dá)到極顯著水平，從圖2、4中可以確定甲氧咪草煙的篩選質(zhì)量濃度為0.01 mg/L。

圖4 除草劑濃度對擬南芥根長的影響

2.3 咪唑啉酮類除草劑甲氧咪草煙對轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選

利用甲氧咪草煙對T0ALS1-6、8-10等9個(gè)株系進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，其篩選質(zhì)量濃度為0.01 mg/L，結(jié)果如表2所示。

表2 甲氧咪草煙篩選結(jié)果

與潮霉素篩選結(jié)果相比，甲氧咪草煙篩選出的陽性率基本與其持平，因此OsALSS627N可以作為篩選標(biāo)記來篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色鑒定

因1301載體上有GUS基因，所以可以對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS染色鑒定，以確定甲氧咪草煙篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果如圖5所示。

圖5 GUS染色鑒定

由圖5可知T5和T6這2個(gè)純合體株系均有GUS染色結(jié)果，而WT未染上顏色，這說明這甲氧咪草煙篩選出的這2個(gè)株系確為轉(zhuǎn)基因擬南芥。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)咪唑啉酮類除草劑甲氧咪草煙的質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時(shí)，就能夠有效篩選出陽性轉(zhuǎn)基因植株，而潮霉素所需的質(zhì)量濃度為30 mg/L，所以O(shè)sALSS627N可以作為擬南芥轉(zhuǎn)化中的篩選標(biāo)記。對于此篩選標(biāo)記能夠作為其他植物的篩選標(biāo)記以及篩選質(zhì)量濃度，需要進(jìn)一步研究。另外，該標(biāo)記也有其局限性，就是對本身具有咪唑啉酮類除草劑抗性植物是無效的。