樊善繼 徐家墀 胡澤成 崔 鶯 譚宇星 蔣伍玖

(1南華大學附屬第一醫(yī)院乳甲外科，衡陽 421001)

(2衡陽師范學院化學與材料科學學院，衡陽 421008)

惡性腫瘤已嚴重影響并危害人類的健康水平與生命，而癌癥的轉移和耐藥是臨床上腫瘤治療面臨的最棘手的問題。盡管世界各國在癌癥的預防、診斷以及治療方面的研究已投入大量的財力和人力，但癌癥的發(fā)病率和死亡率仍呈逐年上升的趨勢。金屬配合物順鉑和其它的鉑類抗腫瘤藥物在多種腫瘤臨床化療方案中被廣泛應用[1]，然而由于鉑類抗腫瘤藥物長期使用，其弊端也日益凸顯，主要臨床表現(xiàn)為毒副作用和獲得性耐藥[2-5]，這些弊端嚴重制約了鉑類藥物的療效。因此，新型金屬抗腫瘤配合物的設計開發(fā)具有重大的理論和實際意義。

有機錫配合物在結構上具有多樣性，易于改變配體的配位類型來調控其體外抗癌活性[6-8]，基于以上考慮，通過改變配體的類型，我們設計、合成了2個未見文獻報道的有機錫配合物，測試了它們在體外的抗腫瘤活性以及研究了配合物與DNA的相互作用，為彌補臨床鉑類藥物不足、為腫瘤疾病的治療及開發(fā)新的金屬抗腫瘤藥物提供重要的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

IR用日本島津Prestige-21紅外光譜儀(4 000～400 cm-1，KBr壓片)測定。1H、13C 和119Sn NMR 用Bruker AVANCE-500核磁共振儀測定。元素分析用PE-2400（Ⅱ）元素分析儀測定。晶體結構用Bruker SMART APEX Ⅱ CCD單晶衍射儀測定。紫外可見(UV-Vis)光譜用日本島津公司UV-2550型紫外-可見光譜儀測定。HRMS用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL(ESI源)測定。熒光光譜用日本日立F-7000熒光光譜儀測定。熱重分析(TGA)用德國NETZSCH TG 209 F3熱重分析儀進行。熔點用北京泰克X-4雙目體視顯微熔點測定儀測定(溫度計未經(jīng)校正)。

二對氯芐基二氯化錫參考文獻[6]方法合成，配體參考文獻[9]方法合成。溴化乙錠(EB)、小牛胸腺DNA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。其它試劑均為分析純，溶劑參考文獻[10]方法純化，水為超純水。Tris-HCl(0.01 mol·L-1)緩沖溶液通過稱取一定量Tris用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液調至pH=7.40，使用前配制。小牛胸腺DNA的純度通過比較260和280 nm處的吸光度來確定(A260/A280=1.8～1.9)，用所需pH值條件下緩沖溶液配制，濃度通過測定260 nm處的吸光度計算而得(ε260=6 600 L·mol-1·cm-1)，其儲備液置于4℃保存。EB溶液通過稱取適量EB固體，用pH=7.40的Tris-HCl(0.01 mol·L-1)緩沖溶液配制。

1.2 配合物的合成

配合物的合成路線如圖1所示。具體過程如下：在50 mL圓底燒瓶中加入1 mmol對甲基苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸(L1)或苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸(L2)、1 mmol二對氯芐基二氯化錫、20 mL甲醇，攪拌回流3 h。冷卻，過濾，通過控制溶劑揮發(fā)法得到淡黃色晶體C1或C2。

圖1 配合物C1和C2的合成線路圖Fig.1 Synthesis of complexes C1 and C2

配合物C1：產(chǎn)率51.1%。m.p.173～175℃(dec)。元素分析(C24H22Cl2N2O4Sn)實測值(括號內(nèi)為計算值，%)：C，48.71(48.69)；H，3.73(3.75)；N，4.72(4.73)。UV-Vis(VDMSO∶VH2O=1∶1)：λmax=350 nm。IR(KBr,cm-1)：3 474，3 063，3 013，2 918，2 841，2 774，1 661，1 597，1 491，1 466，1 443，1 391，1 281，1 258，1 179，1 157，1 090，1 001，827，816，802，748，735，691，644，631，598，488，473，449。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.94(d，J=7.8 Hz，2H)，7.51(d，J=7.2 Hz，2H)，7.36(d，J=8.1 Hz，2H)，7.22～7.27(m，3H)，6.80～6.82(m，4H)，3.67(s，2H)，2.45(s，3H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ 174.53，167.28，144.75，139.17，133.22，132.45，130.98，130.95，130.90，129.51，129.29，128.80，128.67，127.46，126.66，38.19，21.92。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-445.95。HRMS(ESI)m/z：C23H19Cl2N2O3Sn+[M-CH3OH+H]+計算值560.978 9，實測值560.978 0。

配合物C2：產(chǎn)率70.7%。m.p.142～144℃。元素分析(C60H52Cl4N4O8Sn2)實測值(括號內(nèi)為計算值，%)：C，53.89(53.93)；H，3.93(3.92)；N，4.21(4.19)。UV-Vis(VDMSO∶VH2O=1∶1)：λmax=246，341 nm。IR(KBr，cm-1)：3 414，3 084，3 057，2 945，2 886，1 630，1 601，1 587，1 483，1 435，1 389，1 287，1 252，1 169，1 090，1 001，829，802，729，714，689，648，633，592，488，469。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ 7.95(d，J=8.1 Hz，2H)，7.54～7.57(m，1H)，7.50(s，5H)，7.45(t，J=7.6 Hz，2H)，6.95～6.99(m，8H)，3.25(s，4H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ 175.84,167.12,148.29,134.80，132.65，131.60,131.30,131.19,130.24,129.53，128.96，128.79，128.70，128.37，127.62，33.45。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ -640.41。 HRMS(ESI)m/z：C29H23Cl2N2O3Sn+[M-CH3OH+H]+計算值 637.010 2，實測值 637.010 9；C58H45Cl4N4O6Sn2+[2M-2CH3OH+H]+計算值1 273.009 6，實測值1 273.018 2。

表1 配合物C1和C2的晶體學數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of complexes C1 and C2

1.3 晶體結構測定

采用經(jīng)石墨單色化的Mo Kα射線(λ=0.071 073 nm)，以φ～ω掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和多重掃描吸收校正。晶體結構由直接法解出，全部非氫原子坐標在差值Fourier合成中陸續(xù)確定，理論加氫法給出氫原子在晶胞中的位置坐標。對氫原子和非氫原子分別采用各向同性和各向異性熱參數(shù)進行全矩陣最小二乘法修正，全部結構分析計算工作采用SHELX-97程序系統(tǒng)完成[11]。

CCDC：2039991，C1；2039990，C2。

1.4 配合物對細胞的毒性作用

將待測藥物溶于少量DMSO，用水稀釋至所需濃度，保持最終DMSO體積分數(shù)小于0.1%。NCI-H460、HepG2、MCF7細胞株取自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)，NCI-H460、HepG2、MCF7細胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640(GIBICO公司)培養(yǎng)基，在CO2體積分數(shù)5%、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行體外培養(yǎng)。體外抗癌藥敏試驗是通過MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法測定。數(shù)據(jù)處理使用Graph Pad Prism version 7.0程序，化合物的IC50通過程序中具有S形劑量響應的非線性回歸模型進行擬合得到。

1.5 紫外光譜研究

將配合物溶于DMSO以配制1 mmol·L-1儲備液。在5 mL容量瓶中分別加入配合物溶液(50μmol·L-1)及不同濃度的 ct-DNA(0～80 μmol·L-1)，用Tris-HCl緩沖溶液定容，混勻，25℃下放置3.0 h，以不同濃度的ct-DNA溶液為參比，分別掃描230～600 nm范圍內(nèi)的紫外可見光譜。

1.6 熒光淬滅作用

用DMSO將配合物配制成1 mmol·L-1儲備液。在5 mL容量瓶中分別加入ct-DNA、EB及不同濃度的配合物溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容，混勻，25℃下放置3.5 h，分別掃描熒光光譜，激發(fā)波長為258 nm，測定540～700 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5.0 nm。

1.7 粘度測定

使用烏氏粘度計進行粘度測量，整個測量實驗在溫度恒定為(25.00±0.02)℃的超級恒溫水浴槽中進行。以DMSO為溶劑配制配合物的1 mmol·L-1儲備液，向烏氏粘度計中加入ct-DNA(50μmol·L-1)及不同濃度的配合物溶液(0～50 μmol·L-1)，用Tris-HCl緩沖溶液定容，混合均勻后分別測定該溶液流經(jīng)毛細管所需的時間，測量時間用精確度為0.01 s的電子秒表，每次加液后平均測量時間3次，取平均值。按照公式η=(t-t0)/t0計算相對粘度，式中t0為Tris-HCl緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需時間，t為ct-DNA和配合物的混合溶液流經(jīng)毛細管所需時間，η0為沒有加入配合物時ct-DNA溶液的相對粘度。以(η/η0)1/3對ccomplex/cDNA作圖，得到不同濃度配合物對ct-DNA粘度的影響。

2 結果與討論

2.1 譜學研究

配合物C1、C2分子中均有甲醇分子參與配位，因而分別在其紅外光譜的3 474、3 414 cm-1處出現(xiàn)羥基的特征吸收；2個配合物在1 597、1 597 cm-1處的吸收峰歸屬為酰腙(C＝N—N＝C)鍵的特征吸收[12]。此外，C1、C2 配位鍵的特征峰 ν(Sn—O)、ν(Sn—N)和 ν(Sn—C)分別位于 598、488、473 cm-1和592、488、469 cm-1處，與文獻[6,13-15]報道的類似化合物的出峰位置一致，由此表明2個目標配合物的生成，并且從各個基團的出峰位置可以看出，合成的2個對氯芐基錫配合物具有相似的最簡結構單元。

在1H NMR譜中，配合物C1和C2各組峰的積分面積之比與預期結構的各組質子數(shù)相對吻合[16]。從譜圖中可以看到，配合物C1和C2中芳環(huán)上氫質子的出峰位置分別在 δ=6.82～7.95和 δ=6.95～7.96。在配合物C1中，對甲基苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸配體上甲基氫質子在δ=2.45處呈現(xiàn)一個單峰，對氯芐基上亞甲基氫質子在δ=3.67處呈現(xiàn)一個單峰。而在配合物C2中，對氯芐基上亞甲基氫質子在δ=3.25處則呈現(xiàn)出一種特殊的峰形，該峰由一個正常的單峰和一對小衛(wèi)星峰組成，究其原因，這是由于119Sn-H耦合的結果[17]。2個配合物的氫質子出峰基本保持一致，說明2個配合物具有相似的最簡結構單元。

在13C NMR譜中，配合物C1和C2各組峰與理論推測結構碳原子數(shù)相吻合[16]。配合物C1的特征峰為對甲基苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸配體上甲基碳原子在δ=21.92處的出峰，對氯芐基上亞甲基碳原子在δ=38.19處的出峰；相應地在配合物C2中，特征峰為對氯芐基上亞甲基碳原子在δ=33.45處的出峰。2個配合物中其他特征峰羧基碳、酰肼碳以及亞氨基碳的出峰位置也均一一對應，這與X射線單晶衍射結果一致。

在119Sn NMR譜中，C1和C2分別在δ為-445.95和-640.41處呈現(xiàn)一個單峰，表明2個配合物中均僅存在一種單一的有機錫化合物。

2.2 晶體結構

配合物C1、C2的主要鍵長和鍵角數(shù)據(jù)列于表2，分子結構見圖2、3。配合物C1中僅有一個錫核，該中心錫原子Sn1與來自配體中的2個氧原子O1和O2、1個亞氨基氮原子N2、1個配位甲醇氧原子O4、1個對氯芐基中的亞甲基碳原子C17以及1個氯原子Cl1配位，形成六配位的八面體構型。O1、O2、N2、C17占據(jù)了赤道平面的4個位置，O4和Cl1則占據(jù)了該平面兩側的軸向位置，軸向O4—Sn1—Cl1鍵角為 168.54(5)°，與 180°相比偏離了 21.46°，且赤道平面的4個原子與中心錫原子的鍵長不等(Sn1—O1 0.210 17(17)nm；Sn1—O2 0.211 32(16)nm；Sn1—N2 0.216 60(18)nm；Sn1—C17 0.213 7(3)nm)，且鍵角也不相等(∠O1—Sn1—N2 72.97(6)°；∠N2—Sn1—O2 74.66(6)°；∠O2—Sn1—C17 105.37(10)°；∠C17—Sn1—O1 104.18(9)°)。因此，該配合物中心錫原子為六配位畸變八面體構型。

圖2 配合物C1的橢球率30%的分子結構圖Fig.2 Molecular structure of complex C1 with 30% probability ellipsoids

表2 配合物C1和C2的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complexes C1 and C2

圖3 配合物C2的橢球率30%的分子結構圖Fig.3 Molecular structure of complex C2 with 30% probability ellipsoids

配合物C2中含有2個錫原子，為雙錫核分子，2個錫原子Sn1、Sn2的配位模式相同，但鍵參數(shù)略有差異。配合物C2分子中心存在1個Sn2O2平面中心四元環(huán)，四元環(huán)由羧基氧原子以μ3-橋聯(lián)配位Sn原子，且與2個錫原子的鍵長不等。與配合物C1不同的是配合物C2的中心錫原子Sn1、Sn2均采用七配位五角雙錐構型，這種配位模式與大多數(shù)文獻中報道的有機錫化合物類似[18-19]。

2.3 熱穩(wěn)定性研究

為了研究配合物的熱穩(wěn)定性，在空氣氛下，加熱速度為20 ℃·min-1，氣體流速為20 mL·min-1，在40～800℃范圍內(nèi)對配合物進行TG測試。如圖4和5所示，隨溫度的升高，配合物C1和C2發(fā)生相似的失重過程。在初始階段40～200℃，配合物C1失重為 5.4%(理論值：5.4%)，C2 為 5.2%(理論值：4.8%)，分別對應配合物失去配位的甲醇分子；配合物C1、C2的中間失重階段均相對模糊，在200～800℃范圍內(nèi)失重，對應配合物分子失去配體及烴基R，最終穩(wěn)定在約 25.4%(C1)和 22.3%(C2)，殘余物與 SnO2的計算含量25.5%(C1)及22.6%(C2)吻合。上述TGA結果表明配合物C1、C2分別在173、142℃之前可穩(wěn)定存在。

圖4 配合物C1的TGA曲線Fig.4 TGA curves of complex C1

圖5 配合物C2的TGA曲線Fig.5 TGA curves of complex C2

2.4 體外抗癌活性研究

細胞活性的實驗采用MTT法?；驹頌榛罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在570 nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(OD)，來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強，藥物毒性越小。

本實驗以臨床上應用的抗癌藥物卡鉑(carboplatin)為對照品，測定了配合物C1、C2對NCI-H460(人肺癌細胞)、HepG2(人肝癌細胞)和 MCF7(人乳腺癌細胞)體外抗腫瘤活性。實驗結果見表3。從表中數(shù)據(jù)可知，配合物 C1、C2對NCI-H460、HepG2和MCF7三種癌細胞均有一定的抑制活性，但是配合物C2對3種癌細胞相對更為敏感，其IC50值均比配合物C1對癌細胞的要小。從表3及圖6中數(shù)據(jù)還可以看出，配合物C2對NCI-H460和MCF7兩種癌細胞的 IC50值分別為(6.37±0.17)μmol·L-1和(5.33±0.28)μmol·L-1，均小于 carboplatin 對該細胞的 IC50值，說明配合物C2對NCI-H460和MCF7兩種癌細胞的抑制效果優(yōu)于carboplatin。通過晶體結構分析發(fā)現(xiàn)，C1和C2之間的分子結構差異為與錫原子相連接的烴基R數(shù)目與配體苯環(huán)上的甲基取代基?；谠撚^察結果，推測可能的結構-活性關系如下：與錫原子相連接的烴基R數(shù)目對配合物的抗癌活性有重大影響，二烴基錫配合物的抗癌活性強于單烴基錫配合物；另一方面，二對氯芐基錫配合物具有抗癌活性。因此，可以考慮將C2進一步化學優(yōu)化作為抗癌藥物的候選化合物。

表3 配合物C1、C2和卡鉑對癌細胞的體外抑制活性Table 3 Inhibitory activity of complexes C1,C2 and carboplatin on cancer cells in vitro

圖6 配合物C1、C2和卡鉑對癌細胞的體外抑制活性柱狀圖Fig.6 Histogram of inhibitory activity of complexes C1,C2 and carboplatin on cancer cells in vitro

2.5 配合物與DNA作用的紫外光譜研究

為了準確表達配合物與DNA相互作用的強度，可以根據(jù)以下公式求得兩者間的結合常數(shù)(Kb)[20]：

式中，εA、εF、εB分別為任意DNA濃度(cDNA)下溶液的摩爾消光系數(shù)、自由配合物的摩爾消光系數(shù)、配合物被DNA完全鍵合時的摩爾消光系數(shù)。根據(jù)方程式線性擬合，通過斜率和截距計算出配合物C2的結合常數(shù) Kb為 1.3×104L·mol-1；并且該結合常數(shù)值與文獻[21-22]報道的類似配合物與DNA作用的結合常數(shù)大小相近，表明配合物C2與DNA的作用較強。

從圖7中可以看出，當配合物C2與DNA發(fā)生作用時，它們的紫外光譜吸收峰表現(xiàn)出了減色和紅移現(xiàn)象，減色率為30.86%，紅移5 nm，減色越明顯表明配合物與DNA相互作用越強[24]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是配合物通過插入作用與DNA結合后與堿基對發(fā)生π電子堆積，配體的π*空軌道與DNA堿基對的π軌道發(fā)生偶合導致能級下降，偶合后的π*軌道部分填充電子，使其π-π*躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應。上述結果表明配合物C2可能通過插入作用與雙鏈ct-DNA結合。

圖7 配合物C2與DNA相互作用的UV-Vis譜圖Fig.7 UV-Vis spectra of C2 upon addition of ct-DNA

2.6 配合物與DNA-EB作用的熒光光譜研究

經(jīng)典熒光探針EB自身的熒光強度很弱，但它能專一性地平行插入到DNA雙螺旋內(nèi)部的堿基對之間，使熒光強度顯著增強。當EB分子從DNA雙螺旋中脫出時，熒光強度又顯著降低。如果共存于DNA-EB體系中的化合物分子也能與DNA發(fā)生類似于EB的插入作用，那么這個化合物分子就會競爭EB與DNA的結合位點，使DNA-EB體系的熒光減弱。因此，利用DNA-EB體系的熒光猝滅程度可以說明化合物與DNA相互作用的方式和強度。

圖8為不同濃度的配合物C2對DNA-EB復合體系熒光光譜的影響。從圖上可以看出，隨著配合物C2濃度的增加，DNA-EB復合物體系的熒光逐漸猝滅，說明配合物C2與DNA作用后，同EB競爭DNA的結合位點使EB從DNA分子中游離出來，由此可進一步說明它們與DNA發(fā)生了插入作用，該結論與紫外光譜的測試結果一致。

圖8 配合物C2與EB-DNA體系相互作用的熒光光譜圖Fig.8 Effects of complex C2 on fluorescent spectra of EB-DNA system

為了定量地研究配合物與DNA的結合能力，采用經(jīng)典 Stern-Volmer方程[23]：I0/I=1+KSVccomplex，由曲線擬合推斷其作用屬于靜態(tài)猝滅，計算出配合物C2與DNA作用的猝滅常數(shù)KSV為5.9×104L·mol-1，比文獻[25-26]報道的結合常數(shù)大，其大小定量地反映出配合物與DNA插入作用的能力，通過比較結合常數(shù)可以看出配合物C2與DNA存在較強的插入作用。

2.7 粘度實驗

粘度測定是檢測配合物與DNA結合方式最有效的方法之一。當平面小分子以插入方式與DNA作用時，DNA相鄰堿基對的距離會變大，以容納插入該分子，并導致DNA雙螺旋長度增加，從而增大溶液的粘度[24]。當小分子以部分插入方式進入堿基對時，常產(chǎn)生DNA雙鏈的扭結，導致溶液粘度下降。而當化合物分子以溝面或靜電方式與DNA作用時，則DNA溶液粘度變化不大，據(jù)此可區(qū)分不同的鍵合模式。

圖9是DNA在不同濃度配合物C2或配體L2溶液存在下粘度的變化趨勢，實心三角形所連曲線是L2與ct-DNA作用后的相對粘度變化曲線，實心圓所連曲線是配合物C2與ct-DNA作用后的相對粘度變化曲線。從圖中可以看出，加入配合物C2后，DNA的相對粘度總體上都是隨著配合物濃度的增大呈現(xiàn)上升的趨勢，并且上升趨勢比L2強烈，說明配合物以插入的方式與DNA結合。

圖9 不同濃度配合物C2和配體L2對ct-DNA相對粘度的影響Fig.9 Effect of various concentrations of complex C2 and ligand L2 on relative viscosity of ct-DNA

3 結 論

二對氯芐基二氯化錫分別與對甲基苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸及苯甲酰肼縮苯甲酰甲酸反應，合成了2個對氯芐基錫配合物C1和C2。結構分析表明，C1為單錫核分子，中心錫原子為六配位八面體構型；C2為雙錫核分子，2個中心錫原子均形成七配位畸變五角雙錐構型。熱分析結果表明，在空氣氛下，配合物C1在173℃、C2在142℃以下可穩(wěn)定存在。抗癌活性結果表明配合物C2對NCI-H460和MCF7兩種癌細胞的抑制效果優(yōu)于卡鉑。利用紫外可見吸收光譜、熒光猝滅光譜以及粘度法研究了配合物C2與ct-DNA之間的相互作用，結果表明配合物以插入模式與DNA結合。

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