吳燕利 徐賢柱 肖 強＊,

(1江西科技師范大學(xué)有機功能分子研究所，南昌 330013)

(2江西師范大學(xué)生命學(xué)院，南昌 330022)

0 引 言

近年來，納米藥物載體受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，這主要是由于它們能有效地提高小分子藥物在人體內(nèi)的循環(huán)時間、減小其毒副作用，提高療效[1-3]。介孔SiO2是一種具有規(guī)則孔結(jié)構(gòu)的無機納米材料，由于其比表面積較大、孔徑可調(diào)且分布均一、孔體積較大、表面易于修飾、穩(wěn)定性高、生物相容性好等特性，在藥物釋放領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[4-7]。目前，納米藥物載體的研發(fā)主要集中在納米粒子表面修飾靶向性分子，以保證其精準(zhǔn)識別腫瘤細胞[8-9]和開發(fā)新型多功能納米材料[10-12]，將化療藥物分子、熱療試劑、光動力治療試劑以及成像造影劑整合在同一材料上。

稀土離子擁有豐富的能級結(jié)構(gòu)和獨特的4f躍遷特性，稀土摻雜納米發(fā)光材料[13-17]由于發(fā)光效率高、穩(wěn)定性好、對生物體的毒性低、熒光壽命長，是目前普遍看好的生物標(biāo)記材料之一。稀土氧化物具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，是非常好的發(fā)光基質(zhì)。以稀土離子Eu3+、Tb3+、Yb3+/Er3+等為激活離子和以氧化稀土為基質(zhì)的納米材料的研究十分活躍。近年來，陸續(xù)有研究者將這種傳統(tǒng)發(fā)光材料用于生物標(biāo)記[18-25]。以介孔SiO2和稀土氧化物為結(jié)構(gòu)單元的多功能核殼結(jié)構(gòu)納米粒子將介孔SiO2與稀土氧化物納米粒子融合在同一材料中，擁有稀土氧化物熒光納米粒子的優(yōu)良光學(xué)性能和介孔SiO2的高孔容率以及生物相容性好的特質(zhì)，并有效降低了稀土氧化物本身可能產(chǎn)生的細胞毒性，在藥物輸送和熒光成像方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[26-32]。Yang等[30]將Gd2O3∶Yb/Tm納米粒子包裹在空心SiO2的表面制備SiO2@Gd2O3∶Yb/Tm空心膠囊，該空心膠囊既可以用于藥物緩釋又可以用于熒光成像。Song等[31]制備了介孔SiO2包裹的Gd2O3納米粒子并將其成功用于腫瘤細胞的標(biāo)記和鹽酸阿霉素的負載和緩釋。Dai等[32]將長余輝 ZnGa2O4∶Cr3+，Bi3+包裹在 Gd2O3@mSiO2核殼納米粒子的表面制備出長余輝Gd2O3@mSiO2@ZnGa2O4∶Cr3+，Bi3+納米復(fù)合材料，并將其應(yīng)用于藥物緩釋和監(jiān)測。

綜上所述，將介孔SiO2與稀土氧化物熒光納米粒子2種功能基元有效結(jié)合，可以充分發(fā)揮2種材料的優(yōu)勢，在藥物輸送、跟蹤以及腫瘤細胞熒光標(biāo)記等方面有潛在應(yīng)用價值。目前，這方面的研究主要集中在球形核殼粒子的制備，對于棒狀Gd2O3與介孔SiO2復(fù)合材料的研究，目前還未見報道。然而，有研究表明[33-34]，相對于球形粒子，棒狀結(jié)構(gòu)的納米粒子在細胞吞噬實驗中，能更快、更大程度地進入細胞內(nèi)部。我們采用水熱法制備Gd(OH)3∶Eu納米棒，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為模板，通過正硅酸乙酯(TEOS)水解將介孔SiO2包裹在納米棒的表面，煅燒后得到以Gd2O3∶Eu納米棒為內(nèi)核，以介孔SiO2為外殼的多功能核殼納米棒。

1 實驗部分

1.1 儀器和藥品

所用藥品有稀土氯化物(由99.99%的氧化稀土經(jīng)分析純鹽酸溶解，蒸去多余的酸后用蒸餾水配制)、濃氨水(25%)、TEOS(AR)、CTAB(AR)。實驗用水為去離子水。

采用FEI公司Quanta200F場發(fā)射掃描電鏡(SEM,15 kV)和TecnaiG20場發(fā)射高分辨透射電鏡(TEM，200 kV)觀察產(chǎn)物的形貌；利用BRUKER D8 Focous X射線衍射儀表征產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)，Cu Kα輻射，λ=0.154 06 nm，電壓40 kV，電流30.0 mA，掃描范圍2θ=10°～80°；通過Perkin-Elmer C99957紅外光譜儀用溴化鉀壓片對樣品進行成分分析，測試范圍500～4 000 cm-1；采用Microtrac NPA152粒度分析儀測量樣品的粒徑分布；采用BELSORP-mini Ⅱ型比表面積及微孔孔隙儀分析樣品的孔性能，并通過Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法計算表面積；采用Hitachi F4600熒光光譜儀測試樣品的激發(fā)和發(fā)射光譜；采用NM120-Analyst磁共振成像測試儀對樣品進行磁共振成像表征；采用Olympus FV1000共聚焦顯微鏡觀察細胞的熒光成像；采用ELX-800型酶標(biāo)儀測定MTT(四甲基偶氮唑藍)吸光值。

1.2 Gd2O3∶Eu@mSiO2多功能核殼納米棒的制備

核殼復(fù)合物的制備流程圖如圖1所示。

圖1 Gd2O3∶Eu@mSiO2合成流程圖Fig.1 Fabrication process of Gd2O3∶Eu@mSiO2

1.2.1 Gd(OH)3∶Eu納米棒的制備

采用水熱法制備Gd(OH)3∶Eu納米棒。在燒杯中加入 GdCl3(0.05 mol·L-1，38 mL)和 EuCl3(0.05 mol·L-1，2 mL)，邊攪拌邊加入氨水至 pH=9，將得到的混合物攪拌均勻，轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，然后置于180℃烘箱中保溫10 h，自然冷卻至室溫，最后得到白色渾濁溶液。離心分離得到白色沉淀物Gd(OH)3∶Eu，用乙醇和水反復(fù)洗滌沉淀，產(chǎn)品放入80℃烘箱中烘干。

1.2.2 Gd(OH)3∶Eu@SiO2-CTAB的制備

在250 mL圓底燒瓶中加入100 mg的Gd(OH)3∶Eu納米棒，80 mL乙醇、10 mL水和100 mg CTAB，超聲分散10 min后，邊攪拌邊逐滴加入200μL TEOS和0.5 mL濃氨水，繼續(xù)攪拌12 h。將混合物離心分離，得到白色沉淀物。用無水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌、沉淀3次后置于80℃烘箱中干燥。

1.2.3 Gd2O3∶Eu@mSiO2的制備

將干燥的Gd(OH)3∶Eu@SiO2-CTAB樣品轉(zhuǎn)移到坩堝中，在馬弗爐中800℃下煅燒3 h，冷卻后得到Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品。

1.3 細胞熒光成像

在無菌條件下，將NCI-H460肺癌細胞接種于共聚焦專用的培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌細胞3次，再加入培養(yǎng)基稀釋的Gd2O3∶Eu@mSiO2溶液(100 μg·mL-1，100μL)，繼續(xù)孵育4 h，用PBS緩沖液洗掉未結(jié)合的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒，于共聚焦顯微鏡下觀察細胞的熒光圖像。

1.4 細胞活力測試

用NCI-H460肺癌細胞測定樣品的細胞毒性。NCI-H460以5×104mL-1的細胞濃度接種于96孔板上，每孔100μL，在體積分數(shù)5%的CO2、37℃中孵育24 h，待細胞貼壁后，棄去原有培養(yǎng)基，向孔中加入200 μL不同濃度(0、25、50、100、200 μg·mL-1)的Gd2O3∶Eu@mSiO2培養(yǎng)基分散液，每個濃度樣本設(shè)平行的8個副孔。再將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后向每孔中加入現(xiàn)配的MTT溶液(5 mg·mL-1，20μL)，培養(yǎng)4 h，待MTT還原為藍紫色結(jié)晶甲臜，移去上清液，然后向每個孔中加入200μL DMSO(二甲基亞砜)，使藍紫色甲臜完全溶解，搖勻后使用酶標(biāo)儀測定溶液在490 nm的吸光度(A)值，細胞的存活率按如下公式計算：Cell viability=(Asample/Acontrol)×100%，其中Asample為各孔在490 nm的吸光度，Acontrol為空白對照組在490 nm的吸光度。

1.5 布洛芬的吸附和釋放實驗

100 mg Gd2O3∶Eu3+@mSiO2樣品加入到布洛芬(IBU)的正己烷溶液(10 mL，50 mg·mL-1)中，將此混合液在密封條件下30℃攪拌24 h，之后離心分離裝載了IBU的樣品，用正己烷清洗3次，洗去樣品表面吸附的IBU(只保留樣品孔道中的IBU)，之后在60℃干燥12 h，裝載了IBU的樣品命名為IBU-Gd2O3∶Eu3+@mSiO2，采用熱重(TG)分析來確定IBU的負載量。

將IBU-Gd2O3∶Eu3+@mSiO2樣品轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，浸泡于10 mL PBS緩沖溶液中(pH=7.4)，37℃緩慢振蕩，每隔一定的時間離心一次，用移液槍移取1 mL上層清液，立即用等量的新鮮PBS代替。用紫外可見分光光度計測定上清液在221 nm處的吸光度，計算IBU的釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM及TEM的表征

采用SEM和TEM對粒子的形貌進行觀察，如圖2和圖3所示。Gd(OH)3∶Eu由尺寸均勻、分散性良好的納米棒組成，納米棒的長度～400 nm，直徑～100 nm(圖 2)。

圖2 Gd(OH)3∶Eu的SEM圖Fig.2 SEM images of Gd(OH)3∶Eu

圖3 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的TEM圖Fig.3 TEM images of Gd2O3∶Eu@mSiO2

由圖3可知，制備的Gd2O3∶Eu@mSiO2為典型的核殼結(jié)構(gòu)，核層Gd2O3∶Eu繼承了其前驅(qū)體Gd(OH)3∶Eu的棒狀形貌，尺寸也基本保持一致，殼層的厚度大約是30 nm，介孔均勻地分布在殼層表面。

2.2 XRD分析

分別對前驅(qū)物和經(jīng)過800℃煅燒后的產(chǎn)物進行XRD分析，如圖4所示。由圖4a可見，前驅(qū)體樣品XRD圖和Gd(OH)3的標(biāo)準(zhǔn)圖(PDF No.38-1042)完全一致，而且沒有雜質(zhì)峰，說明所得到的樣品為六方相的Gd(OH)3∶Eu。經(jīng)過800℃煅燒后得到的樣品XRD圖和Gd2O3標(biāo)準(zhǔn)卡片(PDF No.12-0797)基本一致，未觀察到SiO2的峰(圖4b)，說明介孔硅為無定形結(jié)構(gòu)，煅燒后所得樣品為Gd2O3∶Eu@mSiO2。

圖4 (a)Gd(OH)3∶Eu和(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2的XRD圖Fig.4 XRD patterns of(a)Gd(OH)3∶Eu and(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.3 FTIR分析

為了進一步證實IBU分子已成功負載到Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒中，對樣品進行了詳細的FTIR光譜研究(圖5)，包括對純IBU分子(曲線a)和IBU負載產(chǎn)物(曲線b)的譜圖分析。在曲線a中，1 720、2 965(2 884)、1 516(1 450)和1 421 cm-1處的吸收帶歸屬于IBU分子的—COOH、C—Hx鍵、四元碳原子和—OH的彎曲振動，可以確定為IBU的結(jié)構(gòu)。在曲線b中，除了在1 720～1 421 cm-1處的幾個吸收峰(圖中星號處)可以歸屬于IBU分子外，1 080和796 cm-1處的強吸收峰分別歸屬于Si—O—Si的不對稱拉伸和對稱拉伸彎曲，965 cm-1處的峰值對應(yīng)于Si—OH對稱拉伸彎曲，這些峰值表明IBU分子已成功負載在Gd2O3∶Eu@mSiO2中。

圖5 (a)IBU和(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of(a)IBU and(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.4 BET比表面積

Gd2O3∶Eu@mSiO2的N2吸附-脫附等溫線如圖6所示，為典型的Ⅵ型吸附-解吸等溫線，表明Gd2O3∶Eu@mSiO2擁有介孔結(jié)構(gòu)，孔徑主要分布在1.74 nm左右，這與TEM中觀察到的結(jié)果是一致的。通過BET方法計算得到其表面積為192 m2·g-1。

圖6 Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的N2吸附-脫附等溫線及孔徑分布圖(插圖)Fig.6 N2adsorption-desorption isotherm and pore size distribution(inset)of Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.5 熒光性質(zhì)

圖7為Gd2O3∶Eu@mSiO2在室溫下測得的激發(fā)(左)和發(fā)射(右)光譜，以613 nm為監(jiān)測波長，測得的激發(fā)光譜中的最強激發(fā)峰位于254 nm，然后以254 nm為激發(fā)光波長測得其發(fā)射光譜，其591 nm處的發(fā)射峰對應(yīng)于5D0→7F1躍遷，613和627 nm處2個強峰都對應(yīng)Eu3+的5D0→7F2的磁偶極躍遷，654 nm處發(fā)射峰對應(yīng)5D0→7F3躍遷發(fā)射的紅光。其中613 nm處的發(fā)射峰最強，顯示出以橙紅色為主的發(fā)光特征。

圖7 Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的激發(fā)(左)和發(fā)射(右)光譜Fig.7 Excitation(left)and emission(right)spectra of Gd2O3∶Eu@mSiO2

對IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的發(fā)光強度與IBU釋放量的相關(guān)性進行研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)光強度與釋放量有很強的相關(guān)性。如圖8所示，對比負載前后的發(fā)射光譜曲線可知，負載的IBU嚴重淬滅了Eu3+的發(fā)光，藥物中具有高頻聲子振動的有機基團對藥物的發(fā)光有明顯的抑制作用。圖9為Eu3+的發(fā)光強度與IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品中IBU的釋放量之間的關(guān)系曲線，隨著IBU的不斷釋放，樣品發(fā)光強度逐漸增大。IBU的釋放會減弱淬滅效應(yīng)，進而增強藥物載體體系的發(fā)光強度[35-36]。這一趨勢表明，該功能材料在釋放過程中可通過光致發(fā)光強度跟蹤或監(jiān)測。

圖8 (a)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2 和(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2的發(fā)射光譜Fig.8 Emission spectra of(a)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2and(b)Gd2O3∶Eu@SiO2

圖9 IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的發(fā)光強度與IBU釋放量的關(guān)系Fig.9 Emission intensity of Eu3+in IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2 as a function of the cumulatively released IBU

為了研究Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒對細胞的熒光標(biāo)記效果，我們將核殼納米棒與NCI-H460肺癌細胞共孵。圖10為質(zhì)量濃度為100μg·mL-1的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的培養(yǎng)基分散液作用NCI-H460肺癌細胞4 h后，在405 nm激發(fā)下的熒光顯微照片。結(jié)合明場和暗場中的成像，可以看出紅色熒光是由Gd2O3Eu@mSiO2核殼納米棒發(fā)出的，這表明Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒能穿透細胞膜，成功標(biāo)記NCI-H460肺癌細胞。

圖10 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒與肺癌細胞共孵后的共聚焦熒光顯微照片F(xiàn)ig.10 Confocal fluorescence photomicrographs of NCI-H460 cell incubated with Gd2O3∶Eu@mSiO2core-shell nanorods

2.6 藥物負載和緩釋

選擇IBU作為模型藥物研究Gd2O3∶Eu@mSiO2體系的藥物負載和緩釋行為，首先通過TG分析來確定樣品對IBU的負載量，如圖11所示，負載前和負載后的失重相差10.25%，可知IBU的負載量為10.25%。

圖11 (a)Gd2O3∶Eu@mSiO2 和(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的TG曲線Fig.11 TG curves of(a)Gd2O3∶Eu@mSiO2and(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2

圖12為IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2在pH=7.4的PBS緩沖溶液中的累積藥物釋放行為，由圖可知，該系統(tǒng)中的IBU在剛開始時被較迅速地釋放，這可能是核殼納米棒表面吸附的IBU被快速釋放，在12 h內(nèi)釋放達到了54.8%，接下來更緩慢的釋放行為可能是由于介孔SiO2孔道中的IBU被緩慢地釋放。結(jié)果表明，該Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒具有明顯的緩釋功能。

圖12 IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2在PBS緩沖體系中的釋放曲線Fig.12 Cumulative IBU release profile of IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2in PBS buffer solution

2.7 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的生物相容性

材料的生物相容性對于其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用非常重要。采用MTT法研究Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒對NCI-H460肺癌細胞的毒性，其結(jié)果如圖 13 所示。在 0～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，將 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒與肺癌細胞共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)核殼納米棒對吸光度值的影響很小，在所有劑量下，NCI-H460細胞都保持較高的活性(>90%)。結(jié)果表明，合成的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒具有良好的生物相容性。本研究中提出的核殼雙功能納米棒是未來生物醫(yī)學(xué)工程中潛在的多功能生物材料。

圖13 不同濃度Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒作用于NCI-H460肺癌細胞24 h后的細胞相對活力圖Fig.13 In vitro cells relative viabilities of NCI-H460 lung cancer cells after incubating with different concentrations of Gd2O3∶Eu@mSiO2 core-shell nanorods for 24 h

3 結(jié) 論

綜上所述，我們通過簡單的水熱法和正硅酸乙酯水解法制備了一種新穎的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼雙功能(熒光和介孔)納米棒。結(jié)果表明，Gd2O3∶Eu@mSiO2具有明確的棒狀核殼結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的發(fā)光性能。以IBU作為模型藥物研究其藥物釋放行為，結(jié)果證明可以根據(jù)Gd2O3∶Eu@mSiO2藥物傳輸體系的發(fā)光強度的變化來跟蹤和監(jiān)測藥物的釋放過程。載藥量和釋放度研究表明，該體系具有良好的吸附和持續(xù)釋放性能。因此，合成的Gd2O3∶Eu@mSiO2在熒光成像、藥物緩釋和藥物追蹤等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。