徐華 梁軍才 郭鋒 吳芳 金潔

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是引發(fā)慢性胃炎、胃潰瘍的重要致病菌，也是引發(fā)黏膜相關淋巴組織淋巴瘤以及胃癌的Ⅰ類致癌因子[1]。有研究指出，多數(shù)上消化道疾病患者存在Hp 感染[2]，施行Hp 根除治療對這些患者有良好療效[3]。目前，Hp 對克拉霉素的耐藥率在15%～20%，且呈上升趨勢[4-6]。因此，采用含克拉霉素的Hp 根除治療方案必須了解地區(qū)人群對克拉霉素的耐藥性。目前，Hp 感染及耐藥性檢測方法有侵入性和非侵入性兩類。經(jīng)典的侵入性檢測為內鏡下采集胃黏膜組織進行Hp 培養(yǎng)及藥敏試驗，這是檢測Hp 感染及耐藥性的“金標準”。然而Hp 培養(yǎng)條件要求高，難度大，檢測時間長，同時因其具有侵入性，兒童、老人以及部分有其他嚴重疾病的患者難以承受。糞便23S rRNA 基因檢測是最受推薦的非侵入性檢測方法[7]。通過非侵入性方法采集患者的糞便樣本，提取核酸后對Hp 23S rRNA 可變區(qū)（V 區(qū)）基因進行擴增及測序分析，可以實現(xiàn)對感染的Hp克拉霉素耐藥率的檢測。本研究以胃黏膜組織培養(yǎng)及藥敏試驗為對照，探討糞便23S rRNA 基因檢測判斷Hp感染及克拉霉素耐藥性的臨床價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年1 至12 月杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院收治的上消化道疾病且需行胃鏡檢查的患者86 例。其中男47 例，女39 例，年齡30～70（52.29±7.35）歲；慢性淺表性胃炎患者36 例，膽汁反流性胃炎患者23 例，慢性淺表性胃炎伴糜爛患者17 例，慢性萎縮性胃炎患者10 例。納入標準：13C 呼氣試驗陽性，1 個月內未服用過抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑或質子泵抑制劑，未接受過Hp 根除治療，無胃黏膜活檢禁忌（凝血功能障礙，服用抗凝藥等）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 樣本采集 胃黏膜組織采樣：患者內鏡檢查時，于胃竇或炎癥病灶附近采集胃黏膜組織一份，置于含腦心浸液（英國OXOID 公司，CM1135，500 g）的保存管中，作好標記，-20 ℃保存。糞便樣本采樣：患者內鏡檢查前1 d 于干凈的蹲便器無水處排便，用取樣勺挖取沒有接觸空氣的糞便3 g 左右，置于含0.9%氯化鈉溶液的保存管中，作好標記，-20 ℃保存。

1.3 胃黏膜組織培養(yǎng)及藥敏試驗 胃黏膜組織常溫解凍后，經(jīng)研磨處理，接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（英國OXOID 公司，CM0935，500 g）上，37 ℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)2～3 d。挑取培養(yǎng)長出的疑似菌落，使用革蘭染色試劑（北京陸橋技術股份有限公司，CM1001，10 ml×4）進行染色后鏡檢，其中革蘭染色為紅色，顯微鏡下觀察細菌呈螺旋狀、S 形或海鷗狀等不規(guī)則狀者再經(jīng)尿素酶（中國海博生物技術有限公司，GS004，20 支）、氧化酶（北京陸橋技術股份有限公司，M-153，20 支）和過氧化氫酶（中國海博生物技術有限公司，HB8650，20 支）試驗驗證后，可判定為Hp 培養(yǎng)陽性。采用平板摻入法對培養(yǎng)的Hp 菌株進行克拉霉素藥敏試驗?？死顾貥藴势焚徸员本┛普股锟萍加邢薰荆⊿17135-1g，純度98%，1 g）。克拉霉素耐藥臨界值為1 μg/ml。

1.4 糞便核酸提取及基因測序 糞便樣本常溫解凍后，采用天根糞便基因組提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司，DP328，50 次）提取核酸。采用巢式PCR 技術進行Hp 23S rRNA 功能V 區(qū)目的片段的擴增。擴增引物見表1。第1 步PCR 擴增以提取的糞便核酸為模板，23S-1F 和23S-1R 為引物，擴增出一段617 bp 基因片段。第2 步PCR 擴增以第1 步擴增產(chǎn)物為模板，23S-2F 和23S-2R 為引物，得到最終目的產(chǎn)物，基因片段長度425 bp。將得到的23S rRNA 目的片段進行Sanger 測序。測序結果與國際標準敏感Hp 菌株U27270（Accession No：U27270）進行比對，分析2142、2143 兩個位點基因突變情況，兩個位點堿基均為腺嘌吟時則判斷為對克拉霉素敏感；任一位點突變?yōu)轼B嘌呤時即判斷為耐藥（圖1）。

表1 Hp 23S rRNA 及16S rRNA 基因的擴增引物

圖1 糞便23S rRNA 基因檢測突變情況（2142、2143 位點）

1.5 16S rRNA 高通量測序 采用核酸定量儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，Qubit 2.0）對提取的糞便樣本核酸濃度進行定量分析，采用生物分析儀（美國Agilent Technologies 公司，Agilent 2100）對核酸分子完整性進行評價。質檢合格的樣本采用引物16S-F 和16S-R 擴增Hp 16S rRNA V3-V4 區(qū)。擴增產(chǎn)物經(jīng)磁珠純化后，采用帶測序接頭的引物進行再次擴增。擴增產(chǎn)物再次經(jīng)磁珠純化、文庫濃度及質量檢測合格后，采用Illumina Miseq 高通量測序平臺進行測序。測序后的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾后得到有效的測序數(shù)據(jù)。之后，對有效數(shù)據(jù)進行操作分類單元聚類和物種注釋分類分析，可得到樣本中各物種的豐度分布情況。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。一致性分析采用Kappa 檢驗，Kappa 值≤0.20 說明一致性強度較差，0.20＜Kappa 值≤0.40 說明一致性強度一般，0.40＜Kappa 值≤0.60 說明一致性強度中等，0.60＜Kappa 值≤0.80 說明一致性強度較強，0.80＜Kappa 值＜1.00 說明一致性強度強。

2 結果

2.1 胃黏膜組織培養(yǎng)與糞便23S rRNA 基因檢測Hp陽性率及克拉霉素耐藥率比較 本研究共收集86 份胃黏膜樣本，胃黏膜組織培養(yǎng)及糞便23S rRNA 基因檢測Hp 陽性率及克拉霉素耐藥率比較見表2。糞便23S rRNA基因檢測第1 步PCR 擴增陽性52 份，擴增率為60.47%；第2 步PCR 擴增陽性68 份，擴增率為79.07%。糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp 的陽性率高于胃黏膜組織培養(yǎng)法的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 胃黏膜組織培養(yǎng)與糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp 及對克拉霉素耐藥的靈敏度和特異度比較 胃黏膜組織培養(yǎng)的56 份Hp 陽性樣本中，糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp54 份，其靈敏度為96.43%（54/56）；胃黏膜組織培養(yǎng)的30 份Hp 陰性樣本中，糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp16 份，其特異度為53.33%（16/30）；見表3。糞便23S rRNA 基因檢測與藥敏試驗檢出對克拉霉素耐藥Hp 的比較見表4。藥敏試驗結果對克拉霉素耐藥的13 株Hp 中，糞便23S rRNA 基因檢測檢出12 株耐藥，檢測的靈敏度為92.31%（12/13）。藥敏試驗結果對克拉霉素敏感的41 株Hp 中，糞便23S rRNA 基因檢測檢出32 株敏感，特異度為78.05%（32/41）。以進行藥敏試驗的54 株Hp 為對照，糞便23S rRNA 基因檢測結果與其一致的有44 株，對克拉霉素耐藥結果檢測的一致率為81.48%（44/54），Kappa 值為0.581，提示兩種檢測方法一致性中等。

表2 胃黏膜組織培養(yǎng)及糞便23S rRNA 基因檢測Hp 陽性率及耐藥率比較[例（%）]

2.3 糞便23S rRNA 基因檢測假陰性樣本16S rRNA 高通量測序驗證 針對2 份糞便23S rRNA 擴增失敗的核酸樣本進行16S rRNA 高通量測序。2 份糞便樣本Top10 微生物組成見表5。結果顯示普氏菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）以及糞桿菌屬（Faecalibacterium）在糞便菌群中豐度較高，這3 種菌屬的總豐度達到了糞便菌群總豐度的50%以上。在這2 例患者的糞便樣本中均檢出了螺桿菌屬（Helicobacter），但其在糞便菌群中豐度相對較低，分別為0.72%和0.81%。

表3 胃黏膜組織培養(yǎng)與糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp 結果比較（例）

表4 藥敏試驗與糞便23S rRNA 基因檢測對克拉霉素耐藥的檢測結果比較（例）

表5 糞便23S rRNA 基因檢測假陰性的糞便樣本中TOP 10微生物組成（%）

3 討論

本研究招募上消化道疾病患者行胃鏡檢查，采集胃黏膜標本進行胃黏膜組織培養(yǎng)及藥敏試驗的同時，收集糞便樣本進行糞便23S rRNA 基因擴增及測序，探討糞便23S rRNA 基因檢測Hp 感染及克拉霉素耐藥性的臨床價值。

常規(guī)Hp 培養(yǎng)陽性率在40%左右[3，5]，經(jīng)13C 呼氣檢驗陽性的患者Hp 培養(yǎng)陽性率有所提高。本研究中經(jīng)13C 呼氣檢驗陽性患者，胃黏膜組織培養(yǎng)陽性率為65.12%（56/86），而糞便23S rRNA 基因檢測的陽性率為79.07%（68/86），顯著高于胃黏膜組織培養(yǎng)。Luo 等[8]的研究結果中，糞便23S rRNA 基因檢測Hp 陽性率可達到80%以上，指出通過非侵入方法采集糞便樣本進行Hp 檢測具有較高的陽性率。胃黏膜組織培養(yǎng)陽性率受到培養(yǎng)條件、取樣部位以及胃內其他微生物污染等多方面因素的影響。有研究指出，單部位胃黏膜取樣培養(yǎng)陽性率較低，多部位胃黏膜聯(lián)合取樣可以提高陽性率，胃竇小彎和胃體組織聯(lián)合采樣培養(yǎng)陽性率甚至可以達到90%以上[9]。另一方面，胃黏膜組織中的其他細菌，例如變形桿菌等，因其具有遷徙生長性，培養(yǎng)過程中菌苔不斷擴展[10]，極容易造成培養(yǎng)平板污染，從而無法分離出Hp，降低培養(yǎng)陽性率。糞便23S rRNA 基因檢測通過設計特異性引物，從待檢測樣本中特異性檢出目的基因片段，降低其他雜菌影響。同時巢式PCR 技術的二次擴增能夠提高目的基因片段濃度，檢出含量相對較低的Hp，提高陽性率。秦召等[11]采用巢式PCR 技術檢測小麥中的Alternaria alternata，DNA 最低檢測濃度可達50 pg/μl。然而糞便中微生物種類豐富、成分復雜，當Hp 相對豐度極低時，可能會抑制后續(xù)反應[12]，影響糞便23S rRNA基因檢測的靈敏度。本研究中有2 例患者胃黏膜組織培養(yǎng)陽性，糞便23S rRNA 基因擴增陰性。補充16S rRNA高通量測序后發(fā)現(xiàn)，這兩份糞便樣本中均檢出了Hp，然而相對豐度均低于1%。

大環(huán)內酯類抗生素能結合在Hp 23S 亞基上，抑制細菌肽鏈延伸及蛋白合成。當23S rRNA V 區(qū)基因發(fā)生突變時，與大環(huán)內酯類抗生素結合部位結構改變可能導致結合力降低，減弱抗生素抗菌效果，產(chǎn)生耐藥。目前已檢測出的23S rRNA V 區(qū)基因突變位點有A2142C、A2142G、A2143G、A2144 G、T2183 C、T2182C、A1821G、G2224A、C2245T、T2289C、G1826A、T1830C、G1940A等[13-14]。A2142G/C、A2143G 是最常見的突變，且被認為是與克拉霉素耐藥相關的突變[15]，其中任一位點突變即可判斷為耐藥。本研究中，糞便23S rRNA 基因測序總突變率為32.35%（22/68），其中13.64%（3/22）為A2142G突變，86.36%（19/22）為A2143G 突變，突變以A2143G突變?yōu)橹?，與國內克拉霉素突變位點一致[16]。Hp 藥敏試驗的耐藥率為23.21%（13/56），高于江浙地區(qū)耐藥率[4-6]。糞便23S rRNA 基因測序的耐藥率高于藥敏試驗的耐藥率，耐藥一致率為81.48%（44/54）。環(huán)境因素、藥物外排作用、核糖體蛋白修飾、相關代謝酶失活等因素均可能會影響耐藥基因與表型的一致性。Chen 等[17]研究的111 株Hp 23S rRNA 基因測序結果與表型之間有95%的一致性。而季雪良等[18]的研究中測序組克拉霉素耐藥率高達52.17%，顯著高于藥敏組，指出可能有其他基因同時作用，影響Hp 對抗生素的耐藥性。因此，相較于藥敏試驗，糞便23S rRNA 基因檢測擁有較高的靈敏度，但可能出現(xiàn)耐藥假陽性，降低檢測方法特異度。

通過糞便23S rRNA 基因檢出可以檢出Hp 感染情況，其陽性率高于常規(guī)胃黏膜組織培養(yǎng)，具有較高的靈敏度。同時，筆者檢測出了與克拉霉素相關的A2142G與A2143G 突變，與藥敏結果相比，靈敏度較高，但特異度相對較低。由于糞便23S rRNA 基因檢測檢出Hp 有較高的陽性率，而且對檢出具有克拉霉素耐藥基因的Hp 也有較高的靈敏度，因此可用于對胃鏡檢查不耐受患者，或13C 呼氣試驗陽性而胃黏膜組織培養(yǎng)陰性患者的Hp 感染以及克拉霉素耐藥性判斷。