肝竇內皮細胞在肝竇阻塞綜合征中的作用：聚焦?jié)撛诘闹委煼椒?/h1>
2021-04-09 07:38:02傅澤宇劉向前任虹
中國組織化學與細胞化學雜志 2021年6期 關鍵詞：氧化應激
傅澤宇，劉向前，任虹
（1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022；2華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學系，武漢 430030；3 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院生物樣本中心，武漢 430022）
肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome， HSOS）是一種潛在威脅生命且死亡率達80%的疾病[1]。HSOS的病因大多與造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation， HSCT)[2]、傳 統(tǒng)放化療[3]、服用含有吡咯里西啶生物堿（pyrrolizi- dine alkaloids， PAs）的中草藥如土三七等有關[4]。HSOS主要是由于肝竇內皮細胞（hepatic sinusoidal endothelial cell， LSEC）的損傷所導致，但確切的發(fā)病機制還不太清楚。目前認為主要與氧化應激、炎癥反應、凝血因素等有關[5-7]，這些因素可導致肝竇阻塞，引起門脈高壓，以及一系列臨床癥狀，最終進展為肝腎功能不全、多器官衰竭和死亡[8]。目前美國FDA批準用于HSOS臨床治療的藥物只有去纖苷（defibrotide， DF）。DF價格昂貴并具有出血風險，因此，開發(fā)新的價格便宜、副作用更小的藥物成為迫切需求[9]。
LSEC是肝臟內高度特化的內皮細胞，具有細胞間連接不緊密、細胞上有窗孔無隔膜、細胞下基膜缺乏等特征，在肝竇腔血液和肝實質之間承擔物質交換、血流調控、內吞作用和免疫調節(jié)等功能[10]。目前認為LSEC的損傷是HSOS發(fā)生發(fā)展的第一步，并參與后續(xù)的病理過程[11]。理解LSEC在HSOS發(fā)病過程中的作用，將有利于以LSEC為靶點針對性地研發(fā)新的防治藥物。本文除綜述LSEC的結構、功能及其在HSOS發(fā)病機制中的作用外，還介紹目前臨床前研究中對HSOS有潛在防治效果的藥物、治療方式，歸納其機制和動物模型療效，希望為將來HSOS防治相關的臨床研究提供參考，并將有潛力的藥物進一步推向臨床。
1 肝竇內皮細胞（LSEC）的結構和功能
1.1 LSEC的解剖特點和選擇性屏障功能
肝臟具有雙重血供，20%～25%血流來自充分氧合的肝動脈，75%～80%來自攜帶胃腸道營養(yǎng)成分的門靜脈。血流經(jīng)過肝板間由LSEC排列成的竇道（肝臟的毛細血管床）流入肝小葉中央靜脈、小葉下靜脈、肝靜脈，最終匯入腔靜脈[10，12]。LSEC雖然只占肝臟總體積的3%，但卻是最主要的肝臟非實質細胞[13-15]。LSEC位于肝臟微循環(huán)和肝實質的交界面，在遠離竇腔的一面通過Disse間隙與肝細胞交流，而在竇腔面直接接觸循環(huán)中的血液細胞和多種物質[16]。LSEC是一種沒有基膜和隔膜的單層扁平細胞，胞質稀薄處含大量窗孔，并成簇排列成篩板，覆蓋內皮表面6%～8%的面積，構成一道選擇性透過屏障，不僅可讓肝實質與血液自由交換營養(yǎng)物質和氧氣，還能使有害物質，如代謝產物和細菌被肝細胞或肝星狀細胞（hepatic stellate cell， HSC）攝取處理[10，12，13，17，18]。根據(jù)物種、年齡和觀察技術的不同，貫穿胞質的窗孔直徑范圍在50～200nm[10，13，19，20]。窗孔的排布模式受所處肝葉的解剖位置影響：越靠近小葉中央?yún)^(qū)域，每個篩板上的窗孔數(shù)量越多直徑越小，而越靠近門脈周圍區(qū)則窗孔數(shù)量越少直徑越大。這種排布特征是由肝竇內氧濃度梯度的差異所造成[13，21]。LSEC的選擇性滲透功能部分由窗孔直徑?jīng)Q定，直徑小于窗孔的小顆粒和氣體能自由通過窗孔，而較大的顆粒則可能通過其變形能力通過（如炎癥細胞）或被代謝分解成小于窗孔直徑的顆粒（如脂質轉運）通過，而其余的則被截留在竇腔內[10，13，22]。窗孔并非是靜態(tài)的結構[23]，其孔徑受多種因素調節(jié)，如血壓、激素、藥物、毒性物質、胞外基質、疾病、衰老和暴露于環(huán)境污染物砷等[10]。而窗孔的多孔性（窗孔面積與內皮細胞總面積的比值）則受酒精、飲食營養(yǎng)成分、禁食狀態(tài)或限制熱量攝入等的影響[14]。這種動態(tài)改變與細胞骨架成分肌動蛋白微絲、微管等結構的活動有關[24，25]。除了窗孔的動態(tài)變化受到調節(jié)外，窗孔的存在也需要旁分泌和自分泌兩種方式來維持[26]。鄰近的肝細胞和肝星狀細胞旁分泌的血管內皮細胞因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）可以刺激LSEC細胞內一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）誘導一氧化氮（nitric oxide， NO）的自分泌，通過NO依賴途徑以及NO非依賴途徑來維持LSEC的正常表型[21，27，28]。另有研究表明，纖維連接蛋白可能也是窗孔維持所必需的信號分子[29]。肝竇內皮細胞不像肺、腎、脾等其他器官中的內皮細胞具有隔膜，這可能與其質膜囊泡相關蛋白（plasmalemma vesicle-associated protein，PLVAP or pv1）的低表達有關[19，30-32]。由PLVAP基因編碼的PLVAP是隔膜的關鍵組成部分，通常以放射狀纖維排布形成同源二聚體的形式錨定在細胞膜上，是隔膜通透性功能的重要承擔者[30，33，34]。雖然包含PLVAP的隔膜并不存在于成年個體的LSEC中，但會在胚胎發(fā)育時期的LSEC中短暫出現(xiàn)，之后又隨著發(fā)育消失[20，35，36]，表明PLVAP在LSEC發(fā)育過程中可能承擔著一些重要功能，如調控胎兒期巨噬細胞到組織的定植過程[37]。
肝竇內皮窗孔還參與淋巴液的生成。各種血漿成分通過LSEC 窗孔過濾進入Disse間隙，形成淋巴液，淋巴液匯入門管區(qū)的小淋巴管道離開肝臟。人體內每天近一半的淋巴液通過此方式產生[38-40]。窗孔給跨內皮的淋巴細胞-肝細胞相互作用（transendothelial hepatocyte-lymphocyte interaction， TEHLI）提供通道。淋巴細胞的胞質突起（偽足）穿過窗孔與肝細胞的微絨毛發(fā)生直接接觸，這一過程介導幼稚T淋巴細胞的激活，對免疫耐受的發(fā)育具有重要意義[41]。
LSEC的屏障功能與其結構和解剖定位密不可分，互相影響。對LSEC結構的研究有助于理解其在機體生理和病理過程中所發(fā)揮的作用。目前對LSEC屏障功能的了解還很有限，有關細胞骨架成分對窗口調控的機制也有待深入，進一步研究隔膜以及PLVAP在肝竇內皮窗孔發(fā)育過程中的作用可能是今后的一個研究方向。
1.2 LSEC的血流調節(jié)作用
進入肝臟的血液壓力在肝竇內被平衡。雖然由于消化作用使肝臟血流出現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化，但正常個體肝靜脈血壓波動卻一直維持在4mmHg以內，這源于肝臟微循環(huán)系統(tǒng)對血管的調控作用[13]。LSEC是肝竇血流的重要調節(jié)器，具有感知血壓和剪切力的變化、維持較低的門靜脈血壓、避免微循環(huán)失調的能力，與肝臟內其他幾種細胞共同保證肝臟微循環(huán)血流的穩(wěn)態(tài)[12，42，43]。肝循環(huán)內的剪切應力被認為是主要的血流調節(jié)的驅動者，它可以通過刺激內皮細胞釋放多種血管活性物質調控血管緊張性[44，45]。正常條件下，LSEC可以生成兩種強力的血管活性因子NO和內皮素1（Endothelin-1， ET-1），分別具有舒張血管和收縮血管的能力[46，47]。通過調控這兩種活性物質調節(jié)血管剪切力，從而降低血壓。這一過程由內皮特異性轉錄因子和抗血管生成因子KLF2 (Kruppel-like factor 2 )的激活介導。在血流剪切力的作用下，KLF2激活內皮細胞內eNOS ，誘導NO的生成；并且KLF2還誘導ET-1的下調[48-51]。另外，LSEC還能分泌一氧化碳（carbon monoxide， CO）以及環(huán)氧合酶（cyclooxygenase， COX）途徑代謝物，如血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列環(huán)素，調控血流[52]。HSC是可收縮的細胞，包繞肝竇外表面，并表達α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）[53，54]。LSEC分泌的這些血管活性因子能以旁分泌的方式作用于鄰近的HSC，維持靜止狀態(tài)，抑制HSC介導的血管收縮從而間接調控肝竇血流[53，55]。研究顯示，LSEC自身能膨大形成入口和出口括約肌調節(jié)血流[56]。LSEC可抑制Kupffer細胞的激活，從而抑制Kupffer細胞激活后引起TXA2釋放所導致的縮血管作用[57，58]?？傊?，肝竇血流穩(wěn)態(tài)的調控受多種細胞組分的影響， LSEC在這一細胞生物學信號級聯(lián)中發(fā)揮著重要作用。但迄今為止，部分觀點只有體外實驗證據(jù)并存有爭議，有待進一步驗證。
1.3 LSEC的內吞作用
肝竇內皮細胞表達大量的內吞清除受體（endocytosis receptor），是內吞能力最強的細胞之一[14，59]，主要通過清除受體（scavenger receptor， SR）、甘露糖受體（mannose receptor， MR）以及Fc gamma受體 IIb2（FcγRIIb2） 經(jīng)內吞作用來清除可溶性大分子和小顆粒[13，60]。其中SRs介導氧化和乙?；兔芏戎鞍祝╫xidized and acetylated low-density lipoprotein， oxLDL and acLDL）、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products， AGEs）、廢棄產物（透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、前膠原蛋白氮端前肽）等物質的攝取和降解[10，13，60]。SRs中SR-H的兩種同源受體stabilin-1 和 stabilin-2被認為是發(fā)揮這一功能的主要受體[10，60]。目前認為stabilin-1 和 stabilin-2有部分功能重疊，其中一個基因型缺乏并不會產生明顯的病理改變。與stabilin-2相比，在維持部分陰離子顆粒的清除功能方面，stabilin-1 顯得更不可或缺。但不同程度stabilin基因的缺失會引起轉錄組學的變化，使SR相關的基因下調。當stabilin-1 和 stabilin-2同時缺失時還會造成個體過早死亡以及腎小球纖維化，表明stabilin-1 和 stabilin-2不僅在維持肝臟清除血液有害物質過程中發(fā)揮作用，同時還能保證遠端器官組織的穩(wěn)態(tài)[61-63]。MRs是一種C型凝集素，具有維持免疫和糖蛋白穩(wěn)態(tài)的功能。雖然多種類型的細胞表達MRs，但在肝臟中MRs主要分布于LSEC上。MRs可以有效清除循環(huán)中的多糖蛋白和微生物多糖物質，包括膠原蛋白α鏈、黃體生成素（Luteinizing hormone， LH）、組織纖溶酶原激活物以及溶酶體酶。這種MRs介導的對溶酶體酶的招募有助于維持LSEC較強的溶酶體降解能力[10，13，64-66]。另外，肝臟中MRs的表達也受炎癥刺激和細胞因子調控。IL-1可上調MRs表達從而增強LSEC的內吞作用，而IL-10則會削弱MRs的活性[67，68]。作為肝臟內唯一的Fc γ受體，F(xiàn)cγIIb2介導循環(huán)小分子免疫復合體和部分IgG免疫復合體的清除[10，69，70]。這些受體除了參與LSEC的內吞清除功能，還與LSEC的免疫調節(jié)功能有關。
1.4 LSEC的免疫調控功能
作為肝臟免疫系統(tǒng)的守門員，LSEC還參與固有免疫和適應性免疫應答，這均依賴于其表達的多種受體。其中部分固有免疫應答功能由內吞清除作用介導[14]。LSEC表達的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）除了SR外還包括Toll樣受體（Toll-like receptors， TLRs）家族，使LSEC不僅可識別并清除細菌及其產物，還能分泌炎癥介質和調節(jié)胞外基質（extracellular matrix， ECM）[14，71]。LSEC對體內的TLRs配體有很強的感應能力，極低濃度的脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）（＜100pg/ml）就可促使LSEC分泌促炎介質IL-6[72，73]。LSEC對TLR1～9中的1、2、3、4、6、8、9配體具有不同的免疫反應，對器官特異性穩(wěn)態(tài)有重要的促進作用[74]。作為一種器官常駐抗原呈遞細胞（antigen presenting cell， APC），LSEC具有比部分專職APC，如樹突狀細胞（dendritic cell， DC））還要強的抗原攝取能力[72，75，76]。LSEC能通過其內吞受體參與病毒的清除，在一項腺病毒清除的小鼠模型中，幾乎所有注入體內的腺病毒都能在短時間內被LSEC清除，表明LSEC具有迅速高效的血源性病毒清除能力[14，77]。幾種C型凝集素受體家族成員也能直接攝取病毒，如DCSIGN和LSIGN能與埃博拉病毒和人類免疫缺陷病毒以及冠狀病毒發(fā)生相互作用[78，79]，LSECTIN參與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和丙型肝炎病毒的攝取[80，81]。由于LSEC持續(xù)暴露于來自胃腸道的細菌產物，如果激活正常的免疫應答就會使肝臟免疫系統(tǒng)長期處于激活狀態(tài)，產生有害效應[82]。因此，LSEC在這一過程中可以誘導對LPS耐受并減少白細胞黏附，這些可能與核因子κB的核轉位減少有關[83]。此外，在適應性免疫應答中，LSEC可以通過MR攝取處理可溶性內源性抗原以及口服抗原，并通過組織相容性復合體（major histocompatibility complex， MHC）Ⅰ類分子交叉呈遞給CD8+T細胞，促使CD8+T細胞產生耐受[84-86]。這種免疫耐受由LSEC上的共刺激分子程序性死亡配體1（Programmed death ligand 1， PD-L1）上調所介導[87]。LSEC所介導的這些免疫耐受作用使免疫系統(tǒng)不會對正常無害的抗原作出過激的免疫反應，從而阻止異常的炎癥狀態(tài)和組織損傷。但在面對有害抗原時，LSEC又能使這種耐受作用轉變?yōu)榧せ蠲庖叻磻淖饔?。在高濃度的抗原刺激下，可以誘導CD8+T細胞的這種致耐受作用轉換為誘導效應T細胞的分化作用，從而清除抗原[14，88]。在IL-6轉導信號通路存在的情況下，LSEC能誘導CD8+T細胞迅速分化為效應T細胞，并且使其進一步對炎癥因子作出應答，引發(fā)增強和持續(xù)的效應功能[89]。
LSEC也表達MHCⅡ類分子，向CD4+T細胞呈遞抗原。雖然細胞上共刺激分子水平不高，但能驅使CD4+T細胞分化為調節(jié)性T細胞（regulatory T cell， Treg）而非輔助T細胞（helper T cell， Th）[90，91]。這種LSEC誘導的Treg細胞在誘導免疫耐受方面具有重要作用[92]。LSEC同樣也能誘導部分CD4+T細胞（CD4+胸腺移出細胞）對自身和消化道源性的抗原產生免疫耐受[93]，以及誘導促炎細胞Th1表達抗炎因子IL-10，從而調控肝臟內炎癥免疫反應[94]。LSEC還能調控浸潤的炎癥CD4+T細胞的活性，在IL-10和PD-1作用下抑制CD4+T細胞（Th1和Th17）分泌炎癥因子IFN-γ或IL-17削弱其效應功能[95]。LSEC還能通過白細胞招募作用，調控免疫功能。這種對白細胞的招募一般是通過細胞間黏附分子，如血管黏附蛋白-1（vascular adhesion protein-1， VAP-1） 和stabilin-1介導[96]。此外，肝竇血壓低和剪切力弱的解剖特點也使其不同于傳統(tǒng)血管床選擇素依賴的募集黏附過程， LSEC表達的非典型黏附分子在這一過程中發(fā)揮重要作用[14，42]。LSEC可以通過激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）依賴的信號通路調控ECM沉積和通過肝內趨化因子濃度梯度來招募和留滯Kupffer細胞和淋巴細胞，從而調控免疫細胞在肝臟的分布[97]?？傊赑RR的表達和對免疫細胞獨特的誘導調控作用下，LSEC在維護肝臟固有和適應免疫應答的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了關鍵作用。
2 肝竇內皮細胞和肝竇阻塞綜合征
2.1 HSOS的診斷
HSOS又稱肝小靜脈堵塞?。╲eno-occlusive disease， VOD），是一種以造血干細胞移植調理療法、常規(guī)放療和化療，以及使用含有PAs的食物或藥材等事件為病因的威脅生命的臨床疾病[4，98，99]。不同的致病因素會不同程度地造成LSEC的激活和損傷，引起LSEC脫落、竇道堵塞、缺血壞死、炎癥和纖維化等一系列病理改變甚至竇后性門脈高壓[8，99，100]。黃疸、腹水、肝區(qū)疼痛、體液潴留等臨床表現(xiàn)是目前診斷該病的重要依據(jù)（表1）[100-102]。相比此前的診斷標準，雖然歐洲血液和骨髓移植學會（European Society for Blood and Marrow Transplantation， EBMT）和南京診斷標準加入了影像學技術（超聲、 CT、 MRI）輔助診斷，但鑒于沒有更具特異性的方法，因此肝組織活檢 (病理學檢查) 仍然是診斷的金標準[101-104]。研究表明：內皮激活、應激指數(shù)（Endothelial Activation and Stress Index， EASIX）和透明質酸等生物標志物都能有效評估患者罹患HSOS的風險，為HSOS早 期防治提供很好的指導作用[105，106]。
表1 HSOS的診斷標準[100-102]Tab.1 Diagnostic criteria for VOD/HSOS
2.2 LSEC 在HSOS病理機制中的作用
Deleve L等人在大鼠模型上復現(xiàn)了HSOS的病理特征[107]，并進行了一系列的相關機制研究，顯示疾病發(fā)生發(fā)展基本過程如下： LSEC因多種因素受損并激活，形態(tài)變?yōu)閳A盤狀，窗孔破壞，細胞間縫隙變大，紅細胞穿過縫隙進入Disse間隙，并使LSEC剝落。脫落的LSEC堵塞竇腔，肝內淤血。由于竇道堵塞，使得組織缺血缺氧，肝細胞壞死。壞死的組織釋放多種因子，引起炎癥浸潤，進一步加重組織損傷，甚至可致纖維化[7，108]。雖然大量研究表明LSEC在HSOS病理過程中起著重要作用，但確切的機制仍未闡明，以下是目前提出的可能機制。
2.2.1 LSEC的激活與損傷
LSEC的激活與損傷被認為是整個HSOS發(fā)病過程的第一步，不同致病因素以不同的作用方式介導了LSEC的損傷[109]。HSCT相關的HSOS，除了調理治療對LSEC造成損傷外，移植過程本身就可通過同種異體反應導致LSEC的損傷[110]。體外實驗中，自體HSCT (auto-HSCT) 的內皮細胞損傷標志物在14 d時就達到最大峰值，而在同種異體HSCT（allo-HSCT）中14 d后持續(xù)上漲至21 d形成峰值[111]。說明allo-HSCT中所致的內皮細胞損傷更持久。多中心臨床實驗分析也證明allo-HSCT相關的HSOS（8%）發(fā)病率比auto-HSCT（3%）更高[112]。放射治療的電離輻射也能誘導LSEC凋亡和破壞脫落[113]。多種細胞毒性化療藥物或其代謝激活后的有毒產物均可損傷LSEC[3，6，114-117]。奧沙利鉑（Oxaliplatin）誘導的小鼠模型中，奧沙利鉑介導了LSEC的老化，導致內皮細胞的破壞[3]。這種損傷在臨床上也得到證實[118]。此外，Deleve等人證實：與肝細胞相比，化療藥物咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪更易損傷LSEC[114-116]。攝入含PAs的中草藥或被其污染的食物后，PAs在體內的代謝物脫氫吡咯生物堿（DHPAs）可造成LSEC損傷[119，120]。
關于LSEC損傷的具體過程，一項野百合堿（monocrotaline， MCT）誘導的大鼠HSOS模型實驗做了詳細闡述[11]：PAs被攝入體內后，經(jīng)胃腸道吸收和門靜脈系統(tǒng)轉運至肝臟；在細胞色素P450單氧酶（cytochrome P450 monooxygenases， CYPs），尤其是CYP3A4的催化作用下，PAs被代謝激活為DHPAs；DHPAs可以與細胞的DNA、蛋白質、谷胱甘肽（glutathione， GSH）等物質發(fā)生反應，尤其是與細胞內的蛋白質形成PPAs，被認為是造成細胞損傷的主要原因[109，119，120]。GSH是一種細胞內抗氧化應激的物質，在肝臟的解毒功能中具有重要作用[121]。正常情況下除了與細胞蛋白結合形成PPAs，DHPAs也能在谷胱甘肽的作用下形成無毒的吡咯-谷胱甘肽復合物，是肝臟中重要的解毒方式[122，123]。與肝細胞相比，LSEC中的GSH基礎水平較低，PAs代謝激活方式可能不同[114，123]，使LSEC成為肝臟中最先受損的細胞。由于肝腺泡3區(qū)（中央靜脈周圍區(qū)）相比其他區(qū)域的P450表達水平更高而GSH水平更低，因此損傷一般從該區(qū)開始[124]。這些毒性PPAs可以與LSEC內的F肌動蛋白共價結合，導致細胞內的F肌動蛋白解聚，進而誘導細胞內基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的表達和活性增加，以及細胞變?yōu)閳A盤狀。而上調的MMPs可降解細胞與Disse間隙間的ECM，降低內皮與Disse間隙連接的牢固度，促使LSEC脫落[11，117，119]。在HSOS中， NO對肝臟及LSEC具有保護作用。肝臟內NO主要來源于LSEC，但MCT可導致NO生成減少，從而誘導MMP活性上調，加劇內皮破壞，加重HSOS[125，126]。GSH則可抑制MMP活性，對肝竇內皮完整性具有保護作用[127]。大量研究顯示：GSH水平的降低、NO生成的減少和MMP活性的上調，是導致LSEC損傷脫落并引發(fā)HSOS的重要因素。
2.2.2 LSEC在凝血系統(tǒng)激活中的作用
血液成分進入內皮周圍Disse間隙，可引起肝竇狹窄和血管阻力升高，導致血流變緩；內皮的損害會暴露內皮下組織，導致組織因子（tissue factor， TF）釋放，引發(fā)血小板聚集和凝血級聯(lián)激活；損傷組織釋放多種細胞因子，可介導損傷和參與凝血；脫落的內皮會阻塞肝竇，導致血流瘀滯[100，117，128，129]；這些因素從理論上講均可導致肝竇內的血栓形成[19，130]。但是多年來這一理論并沒有獲得足夠證據(jù)的支持，臨床也未將HSOS定義為血栓性疾病[108，117]。值得注意的是，在HSOS的發(fā)生發(fā)展過程中存在肝臟血管系統(tǒng)的凝血-纖溶失衡，表現(xiàn)出高凝、低纖溶狀態(tài)[131，132]；而且近期還有研究發(fā)現(xiàn)HSOS可導致血栓形成[133-135]。LSEC的損傷會導致凝血途徑相關因子的上調，血小板聚集，甚至肝竇內血栓形成[129]。在HSOS患者體內，已檢測到內皮損傷標志物（如血栓調節(jié)蛋白和P選擇素）與凝血途徑激活標志物（如凝血酶原片段1+2和凝血酶-抗凝血酶復合物）的升高，抗凝血物質（如蛋白C、蛋白S和抗凝血酶）的下降，纖溶作用抑制劑（如PAI-1）的增加，以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor， vWF）、TF和凝血級聯(lián)下游信號分子（如VIII因子、X因子及其激活態(tài)受體）的上調，從而增加血小板黏附和凝血激活的幾率[3，7，100，108，136]。除了從血液發(fā)現(xiàn)凝血系統(tǒng)激活外，使用基因微陣列技術也同樣檢測到凝血系統(tǒng)相關基因（如vWF）的上調[137，138]。無論凝血相關物質的變化是原發(fā)性還是繼發(fā)性，均共同促成了凝血-纖溶平衡的失調。近年來，更多HSOS機制研究集中在血小板聚集的作用，由于LSEC的破壞脫落，血小板聚集在Disse間隙，即外滲性血小板聚集（extravasated platelet aggregation， EPA）[133，139]。這些血小板可被肝細胞吞噬并發(fā)生相互作用，但具體病理改變及其作用機制尚不清楚。使用磷酸二酯酶III抑制劑抗LSEC損傷和抗EPA能減輕HSOS，說明血小板聚集可能具有重要作用[139，140]。臨床上采用抗凝治療，如肝素、華法林等取得一定的治療效果，從側面反映了高凝狀態(tài)在疾病機制中的作用[101，137]。雖然目前凝血級聯(lián)的激活在HSOS中的具體作用還不清楚，但LSEC的損傷促進了其激活，因此，同時具有保護內皮細胞和抗凝性質的藥物可能會對患者更有療效[19]。
2.2.3 LSEC在炎癥反應中的作用。
HSOS中有肝臟炎癥細胞浸潤，炎癥反應早期可能與LSEC失去正常表型后所表達黏附分子的變化有關，晚期可能由于組織廣泛損傷而導致炎癥浸潤[19，141]。放射、化療和調理治療藥物除損傷內皮細胞外還會對其表型產生直接影響，上調其黏附分子ICAM-1及VCAM-1[2]。而損傷組織周圍細胞釋放的多種細胞因子又會誘導LSEC的炎癥通路NF-κB的激活和多種黏附分子（如ICAM-1， E-selectin）和趨化因子（如IL-8）的表達上調，通過招募白細胞，誘導其浸潤和血管滲出，加重組織炎癥損傷[14，19]。動物實驗表明：HSOS中趨化因子CXCL1（相當于人體內的IL-8）血漿水平上升、CXCL1及CXCL2表達上調、肝臟中MPO活性增強、CD11b和Gr-1陽性免疫細胞計數(shù)增加，證實疾病發(fā)生過程中白細胞的招募和白細胞浸潤[3，142，143]。研究還發(fā)現(xiàn)：經(jīng)典炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達增加[3，141，142，144，145]。動物模型和臨床實驗微陣列技術分析均發(fā)現(xiàn)IL-6和STAT3的表達上調，表明IL-6/JAK/STAT3通路可能參與了HSOS發(fā)生發(fā)展[3，138]。HSOS中經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB的激活，可能與其上游TLRs或熱休克蛋白60（heat shock protein 60， HSP60）的上調對其激活有關[141-143，145]。大量研究顯示：炎癥反應參與HSOS的病理過程，LSEC的組織損傷導致局部炎癥反應，而局部炎癥反應加劇組織損傷，形成一個正反饋環(huán)，使HSOS不斷惡化。
2.2.4 LSEC在氧化應激中的作用
LSEC對氧化應激非常敏感，前文所提及的多種病因對LSEC的損傷絕大部分都是由氧化應激介導的[146]。除PAs外，奧沙利鉑、咪唑硫嘌呤、達卡巴嗪等化療藥物同樣可以造成LSEC內GSH的含量減少[6，114，116]。氧化應激被認為是這類肝毒性物質造成LSEC損傷中細胞縫隙形成的直接原因[146]。除氧化應激對LSEC的直接損傷外，氧化應激損傷的組織也會釋放大量自由基（如超氧化物）造成LSEC的損傷[19]。在HSOS動物模型中能檢測到大量活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）的產生，ROS可以攻擊多種生物分子（如蛋白質、DNA或脂質）從而生成丙二醛（malondialdehyde， MDA）和4-羥基壬烯酸（4-Hydroxynonenal， HNE）等產物[147]。為了減輕氧化應激損傷，肝臟內兩種重要的抗氧化劑GSH和超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase， SOD）被大量消耗，其中GSH被ROS氧化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）[147]。反應導致肝組織中氧化應激指標ROS、MDA和 4-HNE的升高，而抗氧化劑GSH、SOD及相關酶大量減少[141，142，147，148]。HSOS中的氧化應激損傷可能主要抑制了NRF2抗氧化應激通路，在MCT誘導的HSOS模型中NRF2及其下游的多個基因，包括GCLC、GCLM、TXN1和NQO1等表達下調[141，147]。 而其余與氧化應激相關的基因包括Mt1， HO1和SOD3則表達上調[3]。臨床微陣列技術分析也發(fā)現(xiàn)氧化應激相關基因上調[138]，氧化還原系統(tǒng)的失衡導致LSEC壞死、組織損傷、脂質過氧化、蛋白降解等系列反應[6]，在HSOS發(fā)展中起著重要作用。
2.2.5 LSEC在肝臟纖維化中的作用
HSOS發(fā)展后期，部分中央靜脈附近區(qū)域肝竇纖維化，阻塞加重[108]。HSC介導肝臟纖維化的發(fā)生，而LSEC具有維持HSC靜止的作用，目前認為這種作用可能與LSEC表達的轉錄因子鋅指E盒結合同源序列 (zinc finger E-box-binding homeobox， Zeb)2的作用相關。LSEC的損傷則削弱了這種保護作用，從而導致纖維化[100，107，149]，其機制可能是作用于調控纖維化的基因TGF-β / Smad，從而引起LSEC表達大量α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和原膠原Ⅰ型。動物模型中發(fā)現(xiàn)相應的TGF-β、原膠原Ⅰ型、磷酸化Smad3及其下游基因上調，α-SMA也存在上調趨勢[3，144]。LSEC損傷后，正常表型丟失，導致大量ECM產生并沉積在肝竇內，促進纖維化；且LSEC旁分泌脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein， A-FABP）作用于HSC，通過激活JNK通路促進其生成TGF-β，從而促進纖維化[150，151]。動物模型中發(fā)現(xiàn)3種膠原基因表達上調，長期炎癥可能導致肝臟內膠原沉積形成纖維化[3]。炎癥和纖維化可能相互促進，形成炎癥-纖維化正反饋循環(huán)介導損傷[144]。在臨床實驗中發(fā)現(xiàn)多種與編碼ECM、纖維化形成因子等相關纖維化基因的激活[138]?？傊琇SEC的損傷對纖維化抑制作用減弱，其表型的變化引起局部炎癥和纖維化，而炎癥和纖維化的正反饋機制導致纖維化加重，進一步加重竇道內的阻塞。
綜上所述，HSOS的發(fā)展是由LSEC的激活損傷、凝血系統(tǒng)的激活、炎癥反應、氧化應激和纖維化等機制共同導致的，LSEC在HSOS的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。
3 HSOS的預防和治療
3.1 目前的預防和治療藥物
3.1.1 預防
臨床試用于預防HSOS的藥物包括：抗凝血酶、前列腺素E1、己酮可可堿肝素、肝素和熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid， UDCA）和去纖苷（defibrotide， DF）。其中抗凝血酶、前列腺素E1和己酮可可堿已證實沒有效果，甚至有嚴重的副作用[152]。肝素和低分子肝素對預防HSOS的效果尚存爭議，而且存在出血的可能，使其應用范圍受限[153-155]。研究表明UDCA能調控炎癥細胞因子的表達和分泌，起到保護肝臟的作用[100]，但對HSOS的預防作用仍存爭議[156-159]。近期一項循證醫(yī)學研究對14項臨床隨機對照（randomized controlled trial， RCT）實驗分析顯示：整體上UDCA能降低HSOS的發(fā)病，但證據(jù)質量較低[160]。有研究表明UDCA預防給藥可以有效降低造血干細胞移植抗宿主的發(fā)病率并增加生存率，而且可以降低血清膽紅素水平[161]，表明對于造血干細胞移植相關的HSOS患者，使用UDCA可能有益。一項三期開放性RCT已經(jīng)證明DF對HSOS的預防性作用，該研究納入28家醫(yī)院和醫(yī)學中心的365名病人，證明了DF能有效減少HSOS的發(fā)生，而且不良事件的發(fā)生率同對照組沒有明顯差異[162]。DF也被英國血液學標準委員會（British Committee for the Standards in Haematology， BCSH）和英國血液骨髓移植協(xié)會(British Society of Blood and Marrow Transplantation， BSBMT)推薦用于造血干細胞移植后的HSOS的預防及治療[163]。
3.1.2 治療
高劑量的糖皮質激素治療造血干細胞移植后HSOS獲得了英國指南推薦，并且在多個小樣本臨床病例分析中發(fā)現(xiàn)糖皮質激素單獨使用及與DF聯(lián)用均有一定療效，但由于存在感染風險，因此應謹慎使用[163-166]。經(jīng)頸靜脈肝內門腔靜脈分流術（transjugular intrahepatic portosystemic shunt， TIPS）療效不一，對病人的預后作用有待進一步研究。肝移植雖然是有效的治療手段，但應當作為危重HSOS以及其他治療手段無效的終末手段。而t-PA則因為效果不佳和出血并發(fā)癥不推薦使用[101，167]。目前被廣泛認可的治療手段之一是對癥支持治療。首先應當注意的是水鹽平衡的管理，必要時可使用利尿劑。盡量緩解病人的不適癥狀，如可能造成病人呼吸困難的大量腹水和胸腔積液，及時通過穿刺和氧療緩解癥狀。面對病情進展至腎衰竭和無法控制體液潴留的病人，可采用透析治療。若病情進一步惡化可轉移至重癥監(jiān)護室治療[100，101，152，168]。對于較為嚴重的病例，支持治療難以阻止病情惡化，DF可能是唯一有效的治療手段。
目前，DF是唯一被FDA批準的且證明能有效治療HSOS的藥物[169]。DF是一種來源于哺乳動物組織的單鏈脫氧寡核苷酸混合物，臨床研究表明其具有抗血栓形成、抗炎、抗缺血、保護內皮細胞和纖溶的作用[170]。上世紀DF就已被發(fā)現(xiàn)能用于治療HSOS[171]，近二十年開展的多項研究逐漸確定DF用于治療HSOS的有效性。早期開展的多中心隨機臨床試驗，對DF的使用劑量25和40mg/kg/day進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種劑量在治療HSOS時，完全緩解率、HSCT術后100天生存率和不良事件的發(fā)生率沒有明顯差異，但考慮25mg/kg/day的不良事件發(fā)生率可能會更低，因此該劑量成為了DF治療的推薦劑量[172]。近年一項多中心臨床研究亦顯示：該劑量可提高生存率[173]。三期臨床實驗發(fā)現(xiàn)DF對合并多器官衰竭（multiple-organ failure， MOF）的病人療效和生存率方面都展現(xiàn)出良好結果。HSCT后100 d生存率在DF組和對照組分別為38.2%和25%；100 d完全緩解率分別為25.5%和12.5%；不良事件主要有出血和低血壓且發(fā)生率與對照組沒有明顯差異，病人對DF具有較好的耐受性[174]。多中心和臨床觀察研究也支持DF對危重HSOS的治療效果[173，175]。另外，近期一項大樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)：DF能明顯提高兒童以及早期治療患者的生存率[176]。雖然DF的治療效果已經(jīng)非常明確，但其治療的機制依然不清楚，需進一步研究。
3.2 未來可期待的療法
由于有效治療HSOS藥物的匱乏，探尋治療HSOS的藥物成為熱點，但大部分只在動物模型上驗證有效，仍缺乏臨床數(shù)據(jù)。
3.2.1 兒茶素
兒茶素是一種廣泛分布于多種可食用植物（如茶葉、咖啡豆、水果）中具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和逆轉內皮細胞功能不全等功能的多酚類物質，屬于黃酮類化合物[141]。兒茶素具有多種異構體，其中(-)-表兒茶素（EPI）和(+)-兒茶素較為常見，二者均具有抗炎抗氧化應激等多種功能；目前的研究發(fā)現(xiàn)EPI和(+)-兒茶素水合物（catechin hydrate， CAT）在動物模型上對HSOS具有保護作用[131，141]。在體研究發(fā)現(xiàn)：CAT (40 mg/kg) 能減輕MCT誘導的HSOS大鼠的LSEC損傷、肝組織損傷以及降低MMP-9的表達，恢復因凝血-纖溶平衡失調所致的凝血功能紊亂；可誘導肝臟中Nrf2抗氧化應激通路上調，減輕氧化應激損傷；MCT誘導的大鼠肝組織GCLC、GCLM、NQO1下調和HO-1上調均可被CAT逆轉且相關氧化應激指標明顯改善。體外實驗發(fā)現(xiàn)：CAT處理能增強原代人類LSEC（human hepatic sinusoidal endothelial cell， HHSEC）在MCT處理下的存活率和抗氧化應激能力，其機制可能是通過與Keap1蛋白上的Nrf2結合位點相互作用，從而促使Nrf2的解離和轉錄激活[131]。
HSOS大鼠模型中，EPI (40mg/kg) 具有類似的作用，包括：改善MCT導致的肝功能損傷、降低內皮損傷和MMP9的表達、恢復升高的氧化應激標志物以及下調的Nrf2下游通路基因表達。分子對接分析發(fā)現(xiàn)相互作用位點同樣是Keap1蛋白與Nrf2的結合位點，但所參與的氨基酸略有不同。EPI對HSOS的治療作用在早期（24 h）是由Nrf2通路介導的。在Nrf2敲除小鼠中，EPI對HSOS早期（24 h）無效，但在晚期（48 h）則能觀察到這種保護作用；HSOS晚期階段，EPI的作用是通過阻斷IκB/NF-κB系統(tǒng)的激活、減少炎癥細胞浸潤及炎癥介質的釋放從而緩解損傷的。而且NF-κB通路是由HSP60蛋白的釋放激活的，而EPI也能抑制其從線粒體釋放至循環(huán)中。因此目前認為EPI可以通過抑制氧化應激和炎癥通路的激活從而起到保護作用[141]。目前對EPI的作用機制探究的更清楚，因此EPI可能比CAT更有臨床應用前景。另外兒茶素其余異構體是否同樣對HSOS具有類似的保護作用也是值得研究的方向。
3.2.2 索拉菲尼和瑞格拉菲尼
索拉菲尼（Sorafenib）和瑞格拉菲尼（Regorafenib）為臨床僅有的由美國FDA批準的肝細胞肝癌靶向藥物[177]。二者均為口服多重激酶抑制劑，且都能作用于血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）和 血 小板源性生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor， PDGFR），具有良好的抗血管生成和抗腫瘤作用[177，178]。目前在動物模型中發(fā)現(xiàn)這兩者均能抑制HSOS的發(fā)展[179，180]。
在MCT誘導的HSOS動物模型中，預防性索拉菲尼給藥能減輕肝組織病變和肝功能損害[179]。雖然索拉菲尼不能改善LSEC早期細胞骨架解聚引起的形態(tài)改變，但能維持LSEC和Disse間隙的附著并延緩LSEC的脫落，從而緩解晚期竇道的阻塞。通過免疫組織化學也能確定索拉菲尼能減輕MCT對LSEC的損傷，而且肝臟MMP-9的活性受到抑制；索拉菲尼可能是通過抑制VEGF/JNK/MMP-9通路減輕HSOS；另外索拉菲尼可以提高肝切除生存率，因此索拉菲尼可能更適合那些需要圍手術期化療和準備肝癌肝切除的病人，例如：結直腸癌肝轉移（colorectal liver metastasis， CRLM）并需要奧沙利鉑化療具有罹患HSOS高風險的患者[179]，但由于二期臨床研究發(fā)現(xiàn)：索拉菲尼與奧沙利鉑聯(lián)用并不能明顯提升轉移性結直腸癌患者的無進展生存時間和生存率，因此索拉菲尼應用受限[181]。在動物模型中，瑞格拉菲尼具有減輕肝臟病理損傷、減輕LSEC損傷、減輕肝切除后HSOS加劇的病理損傷和提升肝切除存活率等作用，但作用機制可能是抑制胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）/MMP-9相關信號通路的激活[180]。瑞格拉菲尼作為新藥，比索拉菲尼具有更強的抑制血管生成、細胞增殖、促進凋亡和抗腫瘤的作用[177]。臨床研究表明，與標準療法瑞格拉菲尼相比，能顯著改善轉移性結直腸癌患者的生存率和疾病無惡化期[182]。因此瑞格拉菲尼可能對CRLM相關化療患者更有應用前景。
3.2.3 磷酸二酯酶III抑制劑
奧普力農（Olprinone， OLP）和西洛他唑（Cilostazol， CZ）是兩種特異性的磷酸二酯酶抑制劑，據(jù)報道有抑制HSOS的作用[140，183]。動物模型中，OLP預防給藥可以通過誘導HO-1表達、激活Akt通路，從而促進LSEC的保護作用而抑制HSOS的發(fā)展，實驗中表現(xiàn)為RECA-1蛋白表達維持在一定水平以及抑制HSOS特征性病理改變和血清肝酶的上升。而且OLP可提升肝切除后個體的存活率，可能也是治療CRLM的潛在藥物[183]。Takashi等人認為血小板在血管腔外的Disse間隙中聚集是介導HSOS損傷的重要因素，因此研究了具有內皮保護作用和抗血小板聚集功能的磷酸二酯酶抑制劑CZ對HSOS的效果。實驗結果表明：CZ預給藥有效減輕組織病理改變，減少EPA形成，同時可能抑制內皮細胞的損傷和血小板激活而導致其標志物PAI-1的表達下調，起到有效預防HSOS的作用[140]。但目前為止這兩種藥物均無相關HSOS臨床實驗數(shù)據(jù)，且與多種誘導該病的化療藥物之間的相互作用仍不清楚，尚待進一步研究。
3.2.4 重組人血栓調節(jié)蛋白 (rTM)
重組人血栓調節(jié)蛋白(recombinant human throm- bomodulin， rTM) 是一種臨床全新的治療彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）的藥物，可通過結合凝血酶阻止凝血。由于DIC病理機制與HSOS較為類似，因此有了將rTM用于治療HSOS的嘗試[184]。大鼠模型中，rTM預防給藥可能通過減少循環(huán)中的高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein 1， HMGB1）從而抑制相關通路的激活，減輕HSOS癥狀和組織損傷，保護LSEC，抑制中性粒細胞的累積和氧化應激。而且rTM也能減輕肝切除手術誘導的HSOS惡化，提高術后生存率，也有CRLM應用前景[185]。而在小鼠模型中，利用流式細胞術發(fā)現(xiàn)rTM能下調MCT處理后的LSEC細胞損傷相關基因以及維持編碼eNOS的基因表達從而保護LSEC[186]。而且同一課題組的另一篇文章發(fā)現(xiàn)rTM能上調肝組織eNOS的表達，下調PAI-1水平。rTM預給藥通過抑制EPA和抑制LSEC的脫落和破壞從而對抗HSOS的發(fā)展[187]。在體外實驗中rTM也被證明具有對內皮細胞的保護作用，這種作用可能是通過血栓調節(jié)蛋白第五表皮生長因子樣結構域的C環(huán)（C Loop of fifth epidermal growth factor-like domain of thrombomodulin， TME5C）作用于細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體15 (G protein-coupled receptor 15， GPR15)介導的[186，188]。此外，一項 41例使用rTM治療HSOS的臨床樣本與DF治療效果比較的臨床實驗證明rTM的治療效果與DF相近[184]。這讓rTM成為繼DF后最有希望成為治療HSOS的常規(guī)臨床藥物。
3.2.5 甘草素和甘草苷
甘草素和甘草苷是傳統(tǒng)中草藥甘草的兩種主要活性成分，研究表明甘草素能通過恢復肝臟GSH含量抵御藥物誘導的肝損傷，并且甘草素和甘草苷可以減輕環(huán)磷酰胺誘導的小鼠LSECs損傷和炎癥損傷[189，190]。目前的動物研究表明：甘草素和甘草苷可以通過減少HSP60下調其下游的TLR4 / NFκB炎癥通路，以及通過作用于Nrf2和keap1蛋白結合位點促進其解離誘導Nrf2核轉位激活上調Nrf2下游抗氧化應激通路。在這兩條通路的共同作用下減輕肝臟炎癥損傷和氧化應激損傷從而削弱HSOS病情[143，147]。由于甘草素和甘草苷具有較高的安全性，因此非常有潛力用于臨床HSOS治療，但仍缺乏臨床研究數(shù)據(jù)。
3.2.6 其他藥物
其他對HSOS有保護作用的藥物作用機制研究大多與抗氧化應激、抗炎癥損傷、保護LSEC、下調MMP-9等作用有關[126，142，145，191-196]。當然也有一些其他通路的參與，如凝血-纖溶相關通路、PI3K和MAPKs 等[142，145]（具體藥物及其作用機制見表2）。也有關于血液成分療效的研究，如人臍帶源性內皮集落形成細胞（human umbilical cord-derived endothelial colony forming cells， hUC-ECFCs）可以在趨化因子的驅動下遷移至損傷部位增殖分化為功能內皮細胞修復組織損傷從而減輕HSOS[197]。還有實驗證明血小板對HSOS有防治作用，給予TPO或TPO激動劑能增加肝內血小板數(shù)量，能保護LSEC、下調MMP-9表達從而減輕肝臟損傷，這可能是因為充足數(shù)量的血小板會封住HSOS產生的內皮縫隙，阻止血液成分進一步進入Disse間隙介導的損傷[198]。與此前EPA參與介導了HSOS損傷的理論一致[133，139]。GSH和MMP抑制劑對HSOS的保護作用雖然很早就被發(fā)現(xiàn)，但始終沒有在臨床得到很好的驗證[126，195]。
表2 預防和治療HSOS臨床前研究的藥物Tab.2 Drugs of preclinical research for prevention and treatment of HSOS
4 總結與展望
本文綜述了LSEC的功能及在HSOS發(fā)病機制中的作用，總結了近年來發(fā)現(xiàn)的有希望防治HSOS的相關方法。由于FDA唯一批準的臨床藥物DF價格昂貴和不易獲得，難以大范圍應用于臨床，因此迫切需要尋找治療HSOS的臨床新藥。闡明HSOS的發(fā)病機制有利于制定治療策略和開展新藥研究。迄今發(fā)現(xiàn)的藥物雖然大部分尚未開展臨床應用研究，但在HSOS動物模型中取得了良好的治療效果。這些藥物對HSOS的保護作用多與抗氧化應激、抗炎、內皮保護以及抑制MMP等機制有關，以LSEC為靶點、有針對性地研發(fā)HSOS防治新藥仍是今后的方向。
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傅澤宇，劉向前，任虹
（1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022；2華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學系，武漢 430030；3 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院生物樣本中心，武漢 430022）
肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome， HSOS）是一種潛在威脅生命且死亡率達80%的疾病[1]。HSOS的病因大多與造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation， HSCT)[2]、傳 統(tǒng)放化療[3]、服用含有吡咯里西啶生物堿（pyrrolizi- dine alkaloids， PAs）的中草藥如土三七等有關[4]。HSOS主要是由于肝竇內皮細胞（hepatic sinusoidal endothelial cell， LSEC）的損傷所導致，但確切的發(fā)病機制還不太清楚。目前認為主要與氧化應激、炎癥反應、凝血因素等有關[5-7]，這些因素可導致肝竇阻塞，引起門脈高壓，以及一系列臨床癥狀，最終進展為肝腎功能不全、多器官衰竭和死亡[8]。目前美國FDA批準用于HSOS臨床治療的藥物只有去纖苷（defibrotide， DF）。DF價格昂貴并具有出血風險，因此，開發(fā)新的價格便宜、副作用更小的藥物成為迫切需求[9]。
LSEC是肝臟內高度特化的內皮細胞，具有細胞間連接不緊密、細胞上有窗孔無隔膜、細胞下基膜缺乏等特征，在肝竇腔血液和肝實質之間承擔物質交換、血流調控、內吞作用和免疫調節(jié)等功能[10]。目前認為LSEC的損傷是HSOS發(fā)生發(fā)展的第一步，并參與后續(xù)的病理過程[11]。理解LSEC在HSOS發(fā)病過程中的作用，將有利于以LSEC為靶點針對性地研發(fā)新的防治藥物。本文除綜述LSEC的結構、功能及其在HSOS發(fā)病機制中的作用外，還介紹目前臨床前研究中對HSOS有潛在防治效果的藥物、治療方式，歸納其機制和動物模型療效，希望為將來HSOS防治相關的臨床研究提供參考，并將有潛力的藥物進一步推向臨床。
1 肝竇內皮細胞（LSEC）的結構和功能
1.1 LSEC的解剖特點和選擇性屏障功能
肝臟具有雙重血供，20%～25%血流來自充分氧合的肝動脈，75%～80%來自攜帶胃腸道營養(yǎng)成分的門靜脈。血流經(jīng)過肝板間由LSEC排列成的竇道（肝臟的毛細血管床）流入肝小葉中央靜脈、小葉下靜脈、肝靜脈，最終匯入腔靜脈[10，12]。LSEC雖然只占肝臟總體積的3%，但卻是最主要的肝臟非實質細胞[13-15]。LSEC位于肝臟微循環(huán)和肝實質的交界面，在遠離竇腔的一面通過Disse間隙與肝細胞交流，而在竇腔面直接接觸循環(huán)中的血液細胞和多種物質[16]。LSEC是一種沒有基膜和隔膜的單層扁平細胞，胞質稀薄處含大量窗孔，并成簇排列成篩板，覆蓋內皮表面6%～8%的面積，構成一道選擇性透過屏障，不僅可讓肝實質與血液自由交換營養(yǎng)物質和氧氣，還能使有害物質，如代謝產物和細菌被肝細胞或肝星狀細胞（hepatic stellate cell， HSC）攝取處理[10，12，13，17，18]。根據(jù)物種、年齡和觀察技術的不同，貫穿胞質的窗孔直徑范圍在50～200nm[10，13，19，20]。窗孔的排布模式受所處肝葉的解剖位置影響：越靠近小葉中央?yún)^(qū)域，每個篩板上的窗孔數(shù)量越多直徑越小，而越靠近門脈周圍區(qū)則窗孔數(shù)量越少直徑越大。這種排布特征是由肝竇內氧濃度梯度的差異所造成[13，21]。LSEC的選擇性滲透功能部分由窗孔直徑?jīng)Q定，直徑小于窗孔的小顆粒和氣體能自由通過窗孔，而較大的顆粒則可能通過其變形能力通過（如炎癥細胞）或被代謝分解成小于窗孔直徑的顆粒（如脂質轉運）通過，而其余的則被截留在竇腔內[10，13，22]。窗孔并非是靜態(tài)的結構[23]，其孔徑受多種因素調節(jié)，如血壓、激素、藥物、毒性物質、胞外基質、疾病、衰老和暴露于環(huán)境污染物砷等[10]。而窗孔的多孔性（窗孔面積與內皮細胞總面積的比值）則受酒精、飲食營養(yǎng)成分、禁食狀態(tài)或限制熱量攝入等的影響[14]。這種動態(tài)改變與細胞骨架成分肌動蛋白微絲、微管等結構的活動有關[24，25]。除了窗孔的動態(tài)變化受到調節(jié)外，窗孔的存在也需要旁分泌和自分泌兩種方式來維持[26]。鄰近的肝細胞和肝星狀細胞旁分泌的血管內皮細胞因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）可以刺激LSEC細胞內一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）誘導一氧化氮（nitric oxide， NO）的自分泌，通過NO依賴途徑以及NO非依賴途徑來維持LSEC的正常表型[21，27，28]。另有研究表明，纖維連接蛋白可能也是窗孔維持所必需的信號分子[29]。肝竇內皮細胞不像肺、腎、脾等其他器官中的內皮細胞具有隔膜，這可能與其質膜囊泡相關蛋白（plasmalemma vesicle-associated protein，PLVAP or pv1）的低表達有關[19，30-32]。由PLVAP基因編碼的PLVAP是隔膜的關鍵組成部分，通常以放射狀纖維排布形成同源二聚體的形式錨定在細胞膜上，是隔膜通透性功能的重要承擔者[30，33，34]。雖然包含PLVAP的隔膜并不存在于成年個體的LSEC中，但會在胚胎發(fā)育時期的LSEC中短暫出現(xiàn)，之后又隨著發(fā)育消失[20，35，36]，表明PLVAP在LSEC發(fā)育過程中可能承擔著一些重要功能，如調控胎兒期巨噬細胞到組織的定植過程[37]。
肝竇內皮窗孔還參與淋巴液的生成。各種血漿成分通過LSEC 窗孔過濾進入Disse間隙，形成淋巴液，淋巴液匯入門管區(qū)的小淋巴管道離開肝臟。人體內每天近一半的淋巴液通過此方式產生[38-40]。窗孔給跨內皮的淋巴細胞-肝細胞相互作用（transendothelial hepatocyte-lymphocyte interaction， TEHLI）提供通道。淋巴細胞的胞質突起（偽足）穿過窗孔與肝細胞的微絨毛發(fā)生直接接觸，這一過程介導幼稚T淋巴細胞的激活，對免疫耐受的發(fā)育具有重要意義[41]。
LSEC的屏障功能與其結構和解剖定位密不可分，互相影響。對LSEC結構的研究有助于理解其在機體生理和病理過程中所發(fā)揮的作用。目前對LSEC屏障功能的了解還很有限，有關細胞骨架成分對窗口調控的機制也有待深入，進一步研究隔膜以及PLVAP在肝竇內皮窗孔發(fā)育過程中的作用可能是今后的一個研究方向。
1.2 LSEC的血流調節(jié)作用
進入肝臟的血液壓力在肝竇內被平衡。雖然由于消化作用使肝臟血流出現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化，但正常個體肝靜脈血壓波動卻一直維持在4mmHg以內，這源于肝臟微循環(huán)系統(tǒng)對血管的調控作用[13]。LSEC是肝竇血流的重要調節(jié)器，具有感知血壓和剪切力的變化、維持較低的門靜脈血壓、避免微循環(huán)失調的能力，與肝臟內其他幾種細胞共同保證肝臟微循環(huán)血流的穩(wěn)態(tài)[12，42，43]。肝循環(huán)內的剪切應力被認為是主要的血流調節(jié)的驅動者，它可以通過刺激內皮細胞釋放多種血管活性物質調控血管緊張性[44，45]。正常條件下，LSEC可以生成兩種強力的血管活性因子NO和內皮素1（Endothelin-1， ET-1），分別具有舒張血管和收縮血管的能力[46，47]。通過調控這兩種活性物質調節(jié)血管剪切力，從而降低血壓。這一過程由內皮特異性轉錄因子和抗血管生成因子KLF2 (Kruppel-like factor 2 )的激活介導。在血流剪切力的作用下，KLF2激活內皮細胞內eNOS ，誘導NO的生成；并且KLF2還誘導ET-1的下調[48-51]。另外，LSEC還能分泌一氧化碳（carbon monoxide， CO）以及環(huán)氧合酶（cyclooxygenase， COX）途徑代謝物，如血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）和前列環(huán)素，調控血流[52]。HSC是可收縮的細胞，包繞肝竇外表面，并表達α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）[53，54]。LSEC分泌的這些血管活性因子能以旁分泌的方式作用于鄰近的HSC，維持靜止狀態(tài)，抑制HSC介導的血管收縮從而間接調控肝竇血流[53，55]。研究顯示，LSEC自身能膨大形成入口和出口括約肌調節(jié)血流[56]。LSEC可抑制Kupffer細胞的激活，從而抑制Kupffer細胞激活后引起TXA2釋放所導致的縮血管作用[57，58]?？傊?，肝竇血流穩(wěn)態(tài)的調控受多種細胞組分的影響， LSEC在這一細胞生物學信號級聯(lián)中發(fā)揮著重要作用。但迄今為止，部分觀點只有體外實驗證據(jù)并存有爭議，有待進一步驗證。
1.3 LSEC的內吞作用
肝竇內皮細胞表達大量的內吞清除受體（endocytosis receptor），是內吞能力最強的細胞之一[14，59]，主要通過清除受體（scavenger receptor， SR）、甘露糖受體（mannose receptor， MR）以及Fc gamma受體 IIb2（FcγRIIb2） 經(jīng)內吞作用來清除可溶性大分子和小顆粒[13，60]。其中SRs介導氧化和乙?；兔芏戎鞍祝╫xidized and acetylated low-density lipoprotein， oxLDL and acLDL）、晚期糖基化終產物（advanced glycation end products， AGEs）、廢棄產物（透明質酸、肝素、硫酸軟骨素、前膠原蛋白氮端前肽）等物質的攝取和降解[10，13，60]。SRs中SR-H的兩種同源受體stabilin-1 和 stabilin-2被認為是發(fā)揮這一功能的主要受體[10，60]。目前認為stabilin-1 和 stabilin-2有部分功能重疊，其中一個基因型缺乏并不會產生明顯的病理改變。與stabilin-2相比，在維持部分陰離子顆粒的清除功能方面，stabilin-1 顯得更不可或缺。但不同程度stabilin基因的缺失會引起轉錄組學的變化，使SR相關的基因下調。當stabilin-1 和 stabilin-2同時缺失時還會造成個體過早死亡以及腎小球纖維化，表明stabilin-1 和 stabilin-2不僅在維持肝臟清除血液有害物質過程中發(fā)揮作用，同時還能保證遠端器官組織的穩(wěn)態(tài)[61-63]。MRs是一種C型凝集素，具有維持免疫和糖蛋白穩(wěn)態(tài)的功能。雖然多種類型的細胞表達MRs，但在肝臟中MRs主要分布于LSEC上。MRs可以有效清除循環(huán)中的多糖蛋白和微生物多糖物質，包括膠原蛋白α鏈、黃體生成素（Luteinizing hormone， LH）、組織纖溶酶原激活物以及溶酶體酶。這種MRs介導的對溶酶體酶的招募有助于維持LSEC較強的溶酶體降解能力[10，13，64-66]。另外，肝臟中MRs的表達也受炎癥刺激和細胞因子調控。IL-1可上調MRs表達從而增強LSEC的內吞作用，而IL-10則會削弱MRs的活性[67，68]。作為肝臟內唯一的Fc γ受體，F(xiàn)cγIIb2介導循環(huán)小分子免疫復合體和部分IgG免疫復合體的清除[10，69，70]。這些受體除了參與LSEC的內吞清除功能，還與LSEC的免疫調節(jié)功能有關。
1.4 LSEC的免疫調控功能
作為肝臟免疫系統(tǒng)的守門員，LSEC還參與固有免疫和適應性免疫應答，這均依賴于其表達的多種受體。其中部分固有免疫應答功能由內吞清除作用介導[14]。LSEC表達的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）除了SR外還包括Toll樣受體（Toll-like receptors， TLRs）家族，使LSEC不僅可識別并清除細菌及其產物，還能分泌炎癥介質和調節(jié)胞外基質（extracellular matrix， ECM）[14，71]。LSEC對體內的TLRs配體有很強的感應能力，極低濃度的脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）（＜100pg/ml）就可促使LSEC分泌促炎介質IL-6[72，73]。LSEC對TLR1～9中的1、2、3、4、6、8、9配體具有不同的免疫反應，對器官特異性穩(wěn)態(tài)有重要的促進作用[74]。作為一種器官常駐抗原呈遞細胞（antigen presenting cell， APC），LSEC具有比部分專職APC，如樹突狀細胞（dendritic cell， DC））還要強的抗原攝取能力[72，75，76]。LSEC能通過其內吞受體參與病毒的清除，在一項腺病毒清除的小鼠模型中，幾乎所有注入體內的腺病毒都能在短時間內被LSEC清除，表明LSEC具有迅速高效的血源性病毒清除能力[14，77]。幾種C型凝集素受體家族成員也能直接攝取病毒，如DCSIGN和LSIGN能與埃博拉病毒和人類免疫缺陷病毒以及冠狀病毒發(fā)生相互作用[78，79]，LSECTIN參與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒和丙型肝炎病毒的攝取[80，81]。由于LSEC持續(xù)暴露于來自胃腸道的細菌產物，如果激活正常的免疫應答就會使肝臟免疫系統(tǒng)長期處于激活狀態(tài)，產生有害效應[82]。因此，LSEC在這一過程中可以誘導對LPS耐受并減少白細胞黏附，這些可能與核因子κB的核轉位減少有關[83]。此外，在適應性免疫應答中，LSEC可以通過MR攝取處理可溶性內源性抗原以及口服抗原，并通過組織相容性復合體（major histocompatibility complex， MHC）Ⅰ類分子交叉呈遞給CD8+T細胞，促使CD8+T細胞產生耐受[84-86]。這種免疫耐受由LSEC上的共刺激分子程序性死亡配體1（Programmed death ligand 1， PD-L1）上調所介導[87]。LSEC所介導的這些免疫耐受作用使免疫系統(tǒng)不會對正常無害的抗原作出過激的免疫反應，從而阻止異常的炎癥狀態(tài)和組織損傷。但在面對有害抗原時，LSEC又能使這種耐受作用轉變?yōu)榧せ蠲庖叻磻淖饔?。在高濃度的抗原刺激下，可以誘導CD8+T細胞的這種致耐受作用轉換為誘導效應T細胞的分化作用，從而清除抗原[14，88]。在IL-6轉導信號通路存在的情況下，LSEC能誘導CD8+T細胞迅速分化為效應T細胞，并且使其進一步對炎癥因子作出應答，引發(fā)增強和持續(xù)的效應功能[89]。
LSEC也表達MHCⅡ類分子，向CD4+T細胞呈遞抗原。雖然細胞上共刺激分子水平不高，但能驅使CD4+T細胞分化為調節(jié)性T細胞（regulatory T cell， Treg）而非輔助T細胞（helper T cell， Th）[90，91]。這種LSEC誘導的Treg細胞在誘導免疫耐受方面具有重要作用[92]。LSEC同樣也能誘導部分CD4+T細胞（CD4+胸腺移出細胞）對自身和消化道源性的抗原產生免疫耐受[93]，以及誘導促炎細胞Th1表達抗炎因子IL-10，從而調控肝臟內炎癥免疫反應[94]。LSEC還能調控浸潤的炎癥CD4+T細胞的活性，在IL-10和PD-1作用下抑制CD4+T細胞（Th1和Th17）分泌炎癥因子IFN-γ或IL-17削弱其效應功能[95]。LSEC還能通過白細胞招募作用，調控免疫功能。這種對白細胞的招募一般是通過細胞間黏附分子，如血管黏附蛋白-1（vascular adhesion protein-1， VAP-1） 和stabilin-1介導[96]。此外，肝竇血壓低和剪切力弱的解剖特點也使其不同于傳統(tǒng)血管床選擇素依賴的募集黏附過程， LSEC表達的非典型黏附分子在這一過程中發(fā)揮重要作用[14，42]。LSEC可以通過激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）依賴的信號通路調控ECM沉積和通過肝內趨化因子濃度梯度來招募和留滯Kupffer細胞和淋巴細胞，從而調控免疫細胞在肝臟的分布[97]?？傊赑RR的表達和對免疫細胞獨特的誘導調控作用下，LSEC在維護肝臟固有和適應免疫應答的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了關鍵作用。
2 肝竇內皮細胞和肝竇阻塞綜合征
2.1 HSOS的診斷
HSOS又稱肝小靜脈堵塞?。╲eno-occlusive disease， VOD），是一種以造血干細胞移植調理療法、常規(guī)放療和化療，以及使用含有PAs的食物或藥材等事件為病因的威脅生命的臨床疾病[4，98，99]。不同的致病因素會不同程度地造成LSEC的激活和損傷，引起LSEC脫落、竇道堵塞、缺血壞死、炎癥和纖維化等一系列病理改變甚至竇后性門脈高壓[8，99，100]。黃疸、腹水、肝區(qū)疼痛、體液潴留等臨床表現(xiàn)是目前診斷該病的重要依據(jù)（表1）[100-102]。相比此前的診斷標準，雖然歐洲血液和骨髓移植學會（European Society for Blood and Marrow Transplantation， EBMT）和南京診斷標準加入了影像學技術（超聲、 CT、 MRI）輔助診斷，但鑒于沒有更具特異性的方法，因此肝組織活檢 (病理學檢查) 仍然是診斷的金標準[101-104]。研究表明：內皮激活、應激指數(shù)（Endothelial Activation and Stress Index， EASIX）和透明質酸等生物標志物都能有效評估患者罹患HSOS的風險，為HSOS早 期防治提供很好的指導作用[105，106]。
表1 HSOS的診斷標準[100-102]Tab.1 Diagnostic criteria for VOD/HSOS
2.2 LSEC 在HSOS病理機制中的作用
Deleve L等人在大鼠模型上復現(xiàn)了HSOS的病理特征[107]，并進行了一系列的相關機制研究，顯示疾病發(fā)生發(fā)展基本過程如下： LSEC因多種因素受損并激活，形態(tài)變?yōu)閳A盤狀，窗孔破壞，細胞間縫隙變大，紅細胞穿過縫隙進入Disse間隙，并使LSEC剝落。脫落的LSEC堵塞竇腔，肝內淤血。由于竇道堵塞，使得組織缺血缺氧，肝細胞壞死。壞死的組織釋放多種因子，引起炎癥浸潤，進一步加重組織損傷，甚至可致纖維化[7，108]。雖然大量研究表明LSEC在HSOS病理過程中起著重要作用，但確切的機制仍未闡明，以下是目前提出的可能機制。
2.2.1 LSEC的激活與損傷
LSEC的激活與損傷被認為是整個HSOS發(fā)病過程的第一步，不同致病因素以不同的作用方式介導了LSEC的損傷[109]。HSCT相關的HSOS，除了調理治療對LSEC造成損傷外，移植過程本身就可通過同種異體反應導致LSEC的損傷[110]。體外實驗中，自體HSCT (auto-HSCT) 的內皮細胞損傷標志物在14 d時就達到最大峰值，而在同種異體HSCT（allo-HSCT）中14 d后持續(xù)上漲至21 d形成峰值[111]。說明allo-HSCT中所致的內皮細胞損傷更持久。多中心臨床實驗分析也證明allo-HSCT相關的HSOS（8%）發(fā)病率比auto-HSCT（3%）更高[112]。放射治療的電離輻射也能誘導LSEC凋亡和破壞脫落[113]。多種細胞毒性化療藥物或其代謝激活后的有毒產物均可損傷LSEC[3，6，114-117]。奧沙利鉑（Oxaliplatin）誘導的小鼠模型中，奧沙利鉑介導了LSEC的老化，導致內皮細胞的破壞[3]。這種損傷在臨床上也得到證實[118]。此外，Deleve等人證實：與肝細胞相比，化療藥物咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪更易損傷LSEC[114-116]。攝入含PAs的中草藥或被其污染的食物后，PAs在體內的代謝物脫氫吡咯生物堿（DHPAs）可造成LSEC損傷[119，120]。
關于LSEC損傷的具體過程，一項野百合堿（monocrotaline， MCT）誘導的大鼠HSOS模型實驗做了詳細闡述[11]：PAs被攝入體內后，經(jīng)胃腸道吸收和門靜脈系統(tǒng)轉運至肝臟；在細胞色素P450單氧酶（cytochrome P450 monooxygenases， CYPs），尤其是CYP3A4的催化作用下，PAs被代謝激活為DHPAs；DHPAs可以與細胞的DNA、蛋白質、谷胱甘肽（glutathione， GSH）等物質發(fā)生反應，尤其是與細胞內的蛋白質形成PPAs，被認為是造成細胞損傷的主要原因[109，119，120]。GSH是一種細胞內抗氧化應激的物質，在肝臟的解毒功能中具有重要作用[121]。正常情況下除了與細胞蛋白結合形成PPAs，DHPAs也能在谷胱甘肽的作用下形成無毒的吡咯-谷胱甘肽復合物，是肝臟中重要的解毒方式[122，123]。與肝細胞相比，LSEC中的GSH基礎水平較低，PAs代謝激活方式可能不同[114，123]，使LSEC成為肝臟中最先受損的細胞。由于肝腺泡3區(qū)（中央靜脈周圍區(qū)）相比其他區(qū)域的P450表達水平更高而GSH水平更低，因此損傷一般從該區(qū)開始[124]。這些毒性PPAs可以與LSEC內的F肌動蛋白共價結合，導致細胞內的F肌動蛋白解聚，進而誘導細胞內基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的表達和活性增加，以及細胞變?yōu)閳A盤狀。而上調的MMPs可降解細胞與Disse間隙間的ECM，降低內皮與Disse間隙連接的牢固度，促使LSEC脫落[11，117，119]。在HSOS中， NO對肝臟及LSEC具有保護作用。肝臟內NO主要來源于LSEC，但MCT可導致NO生成減少，從而誘導MMP活性上調，加劇內皮破壞，加重HSOS[125，126]。GSH則可抑制MMP活性，對肝竇內皮完整性具有保護作用[127]。大量研究顯示：GSH水平的降低、NO生成的減少和MMP活性的上調，是導致LSEC損傷脫落并引發(fā)HSOS的重要因素。
2.2.2 LSEC在凝血系統(tǒng)激活中的作用
血液成分進入內皮周圍Disse間隙，可引起肝竇狹窄和血管阻力升高，導致血流變緩；內皮的損害會暴露內皮下組織，導致組織因子（tissue factor， TF）釋放，引發(fā)血小板聚集和凝血級聯(lián)激活；損傷組織釋放多種細胞因子，可介導損傷和參與凝血；脫落的內皮會阻塞肝竇，導致血流瘀滯[100，117，128，129]；這些因素從理論上講均可導致肝竇內的血栓形成[19，130]。但是多年來這一理論并沒有獲得足夠證據(jù)的支持，臨床也未將HSOS定義為血栓性疾病[108，117]。值得注意的是，在HSOS的發(fā)生發(fā)展過程中存在肝臟血管系統(tǒng)的凝血-纖溶失衡，表現(xiàn)出高凝、低纖溶狀態(tài)[131，132]；而且近期還有研究發(fā)現(xiàn)HSOS可導致血栓形成[133-135]。LSEC的損傷會導致凝血途徑相關因子的上調，血小板聚集，甚至肝竇內血栓形成[129]。在HSOS患者體內，已檢測到內皮損傷標志物（如血栓調節(jié)蛋白和P選擇素）與凝血途徑激活標志物（如凝血酶原片段1+2和凝血酶-抗凝血酶復合物）的升高，抗凝血物質（如蛋白C、蛋白S和抗凝血酶）的下降，纖溶作用抑制劑（如PAI-1）的增加，以及血管性血友病因子（von Willebrand Factor， vWF）、TF和凝血級聯(lián)下游信號分子（如VIII因子、X因子及其激活態(tài)受體）的上調，從而增加血小板黏附和凝血激活的幾率[3，7，100，108，136]。除了從血液發(fā)現(xiàn)凝血系統(tǒng)激活外，使用基因微陣列技術也同樣檢測到凝血系統(tǒng)相關基因（如vWF）的上調[137，138]。無論凝血相關物質的變化是原發(fā)性還是繼發(fā)性，均共同促成了凝血-纖溶平衡的失調。近年來，更多HSOS機制研究集中在血小板聚集的作用，由于LSEC的破壞脫落，血小板聚集在Disse間隙，即外滲性血小板聚集（extravasated platelet aggregation， EPA）[133，139]。這些血小板可被肝細胞吞噬并發(fā)生相互作用，但具體病理改變及其作用機制尚不清楚。使用磷酸二酯酶III抑制劑抗LSEC損傷和抗EPA能減輕HSOS，說明血小板聚集可能具有重要作用[139，140]。臨床上采用抗凝治療，如肝素、華法林等取得一定的治療效果，從側面反映了高凝狀態(tài)在疾病機制中的作用[101，137]。雖然目前凝血級聯(lián)的激活在HSOS中的具體作用還不清楚，但LSEC的損傷促進了其激活，因此，同時具有保護內皮細胞和抗凝性質的藥物可能會對患者更有療效[19]。
2.2.3 LSEC在炎癥反應中的作用。
HSOS中有肝臟炎癥細胞浸潤，炎癥反應早期可能與LSEC失去正常表型后所表達黏附分子的變化有關，晚期可能由于組織廣泛損傷而導致炎癥浸潤[19，141]。放射、化療和調理治療藥物除損傷內皮細胞外還會對其表型產生直接影響，上調其黏附分子ICAM-1及VCAM-1[2]。而損傷組織周圍細胞釋放的多種細胞因子又會誘導LSEC的炎癥通路NF-κB的激活和多種黏附分子（如ICAM-1， E-selectin）和趨化因子（如IL-8）的表達上調，通過招募白細胞，誘導其浸潤和血管滲出，加重組織炎癥損傷[14，19]。動物實驗表明：HSOS中趨化因子CXCL1（相當于人體內的IL-8）血漿水平上升、CXCL1及CXCL2表達上調、肝臟中MPO活性增強、CD11b和Gr-1陽性免疫細胞計數(shù)增加，證實疾病發(fā)生過程中白細胞的招募和白細胞浸潤[3，142，143]。研究還發(fā)現(xiàn)：經(jīng)典炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達增加[3，141，142，144，145]。動物模型和臨床實驗微陣列技術分析均發(fā)現(xiàn)IL-6和STAT3的表達上調，表明IL-6/JAK/STAT3通路可能參與了HSOS發(fā)生發(fā)展[3，138]。HSOS中經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB的激活，可能與其上游TLRs或熱休克蛋白60（heat shock protein 60， HSP60）的上調對其激活有關[141-143，145]。大量研究顯示：炎癥反應參與HSOS的病理過程，LSEC的組織損傷導致局部炎癥反應，而局部炎癥反應加劇組織損傷，形成一個正反饋環(huán)，使HSOS不斷惡化。
2.2.4 LSEC在氧化應激中的作用
LSEC對氧化應激非常敏感，前文所提及的多種病因對LSEC的損傷絕大部分都是由氧化應激介導的[146]。除PAs外，奧沙利鉑、咪唑硫嘌呤、達卡巴嗪等化療藥物同樣可以造成LSEC內GSH的含量減少[6，114，116]。氧化應激被認為是這類肝毒性物質造成LSEC損傷中細胞縫隙形成的直接原因[146]。除氧化應激對LSEC的直接損傷外，氧化應激損傷的組織也會釋放大量自由基（如超氧化物）造成LSEC的損傷[19]。在HSOS動物模型中能檢測到大量活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）的產生，ROS可以攻擊多種生物分子（如蛋白質、DNA或脂質）從而生成丙二醛（malondialdehyde， MDA）和4-羥基壬烯酸（4-Hydroxynonenal， HNE）等產物[147]。為了減輕氧化應激損傷，肝臟內兩種重要的抗氧化劑GSH和超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase， SOD）被大量消耗，其中GSH被ROS氧化生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）[147]。反應導致肝組織中氧化應激指標ROS、MDA和 4-HNE的升高，而抗氧化劑GSH、SOD及相關酶大量減少[141，142，147，148]。HSOS中的氧化應激損傷可能主要抑制了NRF2抗氧化應激通路，在MCT誘導的HSOS模型中NRF2及其下游的多個基因，包括GCLC、GCLM、TXN1和NQO1等表達下調[141，147]。 而其余與氧化應激相關的基因包括Mt1， HO1和SOD3則表達上調[3]。臨床微陣列技術分析也發(fā)現(xiàn)氧化應激相關基因上調[138]，氧化還原系統(tǒng)的失衡導致LSEC壞死、組織損傷、脂質過氧化、蛋白降解等系列反應[6]，在HSOS發(fā)展中起著重要作用。
2.2.5 LSEC在肝臟纖維化中的作用
HSOS發(fā)展后期，部分中央靜脈附近區(qū)域肝竇纖維化，阻塞加重[108]。HSC介導肝臟纖維化的發(fā)生，而LSEC具有維持HSC靜止的作用，目前認為這種作用可能與LSEC表達的轉錄因子鋅指E盒結合同源序列 (zinc finger E-box-binding homeobox， Zeb)2的作用相關。LSEC的損傷則削弱了這種保護作用，從而導致纖維化[100，107，149]，其機制可能是作用于調控纖維化的基因TGF-β / Smad，從而引起LSEC表達大量α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和原膠原Ⅰ型。動物模型中發(fā)現(xiàn)相應的TGF-β、原膠原Ⅰ型、磷酸化Smad3及其下游基因上調，α-SMA也存在上調趨勢[3，144]。LSEC損傷后，正常表型丟失，導致大量ECM產生并沉積在肝竇內，促進纖維化；且LSEC旁分泌脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein， A-FABP）作用于HSC，通過激活JNK通路促進其生成TGF-β，從而促進纖維化[150，151]。動物模型中發(fā)現(xiàn)3種膠原基因表達上調，長期炎癥可能導致肝臟內膠原沉積形成纖維化[3]。炎癥和纖維化可能相互促進，形成炎癥-纖維化正反饋循環(huán)介導損傷[144]。在臨床實驗中發(fā)現(xiàn)多種與編碼ECM、纖維化形成因子等相關纖維化基因的激活[138]?？傊琇SEC的損傷對纖維化抑制作用減弱，其表型的變化引起局部炎癥和纖維化，而炎癥和纖維化的正反饋機制導致纖維化加重，進一步加重竇道內的阻塞。
綜上所述，HSOS的發(fā)展是由LSEC的激活損傷、凝血系統(tǒng)的激活、炎癥反應、氧化應激和纖維化等機制共同導致的，LSEC在HSOS的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。
3 HSOS的預防和治療
3.1 目前的預防和治療藥物
3.1.1 預防
臨床試用于預防HSOS的藥物包括：抗凝血酶、前列腺素E1、己酮可可堿肝素、肝素和熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid， UDCA）和去纖苷（defibrotide， DF）。其中抗凝血酶、前列腺素E1和己酮可可堿已證實沒有效果，甚至有嚴重的副作用[152]。肝素和低分子肝素對預防HSOS的效果尚存爭議，而且存在出血的可能，使其應用范圍受限[153-155]。研究表明UDCA能調控炎癥細胞因子的表達和分泌，起到保護肝臟的作用[100]，但對HSOS的預防作用仍存爭議[156-159]。近期一項循證醫(yī)學研究對14項臨床隨機對照（randomized controlled trial， RCT）實驗分析顯示：整體上UDCA能降低HSOS的發(fā)病，但證據(jù)質量較低[160]。有研究表明UDCA預防給藥可以有效降低造血干細胞移植抗宿主的發(fā)病率并增加生存率，而且可以降低血清膽紅素水平[161]，表明對于造血干細胞移植相關的HSOS患者，使用UDCA可能有益。一項三期開放性RCT已經(jīng)證明DF對HSOS的預防性作用，該研究納入28家醫(yī)院和醫(yī)學中心的365名病人，證明了DF能有效減少HSOS的發(fā)生，而且不良事件的發(fā)生率同對照組沒有明顯差異[162]。DF也被英國血液學標準委員會（British Committee for the Standards in Haematology， BCSH）和英國血液骨髓移植協(xié)會(British Society of Blood and Marrow Transplantation， BSBMT)推薦用于造血干細胞移植后的HSOS的預防及治療[163]。
3.1.2 治療
高劑量的糖皮質激素治療造血干細胞移植后HSOS獲得了英國指南推薦，并且在多個小樣本臨床病例分析中發(fā)現(xiàn)糖皮質激素單獨使用及與DF聯(lián)用均有一定療效，但由于存在感染風險，因此應謹慎使用[163-166]。經(jīng)頸靜脈肝內門腔靜脈分流術（transjugular intrahepatic portosystemic shunt， TIPS）療效不一，對病人的預后作用有待進一步研究。肝移植雖然是有效的治療手段，但應當作為危重HSOS以及其他治療手段無效的終末手段。而t-PA則因為效果不佳和出血并發(fā)癥不推薦使用[101，167]。目前被廣泛認可的治療手段之一是對癥支持治療。首先應當注意的是水鹽平衡的管理，必要時可使用利尿劑。盡量緩解病人的不適癥狀，如可能造成病人呼吸困難的大量腹水和胸腔積液，及時通過穿刺和氧療緩解癥狀。面對病情進展至腎衰竭和無法控制體液潴留的病人，可采用透析治療。若病情進一步惡化可轉移至重癥監(jiān)護室治療[100，101，152，168]。對于較為嚴重的病例，支持治療難以阻止病情惡化，DF可能是唯一有效的治療手段。
目前，DF是唯一被FDA批準的且證明能有效治療HSOS的藥物[169]。DF是一種來源于哺乳動物組織的單鏈脫氧寡核苷酸混合物，臨床研究表明其具有抗血栓形成、抗炎、抗缺血、保護內皮細胞和纖溶的作用[170]。上世紀DF就已被發(fā)現(xiàn)能用于治療HSOS[171]，近二十年開展的多項研究逐漸確定DF用于治療HSOS的有效性。早期開展的多中心隨機臨床試驗，對DF的使用劑量25和40mg/kg/day進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種劑量在治療HSOS時，完全緩解率、HSCT術后100天生存率和不良事件的發(fā)生率沒有明顯差異，但考慮25mg/kg/day的不良事件發(fā)生率可能會更低，因此該劑量成為了DF治療的推薦劑量[172]。近年一項多中心臨床研究亦顯示：該劑量可提高生存率[173]。三期臨床實驗發(fā)現(xiàn)DF對合并多器官衰竭（multiple-organ failure， MOF）的病人療效和生存率方面都展現(xiàn)出良好結果。HSCT后100 d生存率在DF組和對照組分別為38.2%和25%；100 d完全緩解率分別為25.5%和12.5%；不良事件主要有出血和低血壓且發(fā)生率與對照組沒有明顯差異，病人對DF具有較好的耐受性[174]。多中心和臨床觀察研究也支持DF對危重HSOS的治療效果[173，175]。另外，近期一項大樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)：DF能明顯提高兒童以及早期治療患者的生存率[176]。雖然DF的治療效果已經(jīng)非常明確，但其治療的機制依然不清楚，需進一步研究。
3.2 未來可期待的療法
由于有效治療HSOS藥物的匱乏，探尋治療HSOS的藥物成為熱點，但大部分只在動物模型上驗證有效，仍缺乏臨床數(shù)據(jù)。
3.2.1 兒茶素
兒茶素是一種廣泛分布于多種可食用植物（如茶葉、咖啡豆、水果）中具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和逆轉內皮細胞功能不全等功能的多酚類物質，屬于黃酮類化合物[141]。兒茶素具有多種異構體，其中(-)-表兒茶素（EPI）和(+)-兒茶素較為常見，二者均具有抗炎抗氧化應激等多種功能；目前的研究發(fā)現(xiàn)EPI和(+)-兒茶素水合物（catechin hydrate， CAT）在動物模型上對HSOS具有保護作用[131，141]。在體研究發(fā)現(xiàn)：CAT (40 mg/kg) 能減輕MCT誘導的HSOS大鼠的LSEC損傷、肝組織損傷以及降低MMP-9的表達，恢復因凝血-纖溶平衡失調所致的凝血功能紊亂；可誘導肝臟中Nrf2抗氧化應激通路上調，減輕氧化應激損傷；MCT誘導的大鼠肝組織GCLC、GCLM、NQO1下調和HO-1上調均可被CAT逆轉且相關氧化應激指標明顯改善。體外實驗發(fā)現(xiàn)：CAT處理能增強原代人類LSEC（human hepatic sinusoidal endothelial cell， HHSEC）在MCT處理下的存活率和抗氧化應激能力，其機制可能是通過與Keap1蛋白上的Nrf2結合位點相互作用，從而促使Nrf2的解離和轉錄激活[131]。
HSOS大鼠模型中，EPI (40mg/kg) 具有類似的作用，包括：改善MCT導致的肝功能損傷、降低內皮損傷和MMP9的表達、恢復升高的氧化應激標志物以及下調的Nrf2下游通路基因表達。分子對接分析發(fā)現(xiàn)相互作用位點同樣是Keap1蛋白與Nrf2的結合位點，但所參與的氨基酸略有不同。EPI對HSOS的治療作用在早期（24 h）是由Nrf2通路介導的。在Nrf2敲除小鼠中，EPI對HSOS早期（24 h）無效，但在晚期（48 h）則能觀察到這種保護作用；HSOS晚期階段，EPI的作用是通過阻斷IκB/NF-κB系統(tǒng)的激活、減少炎癥細胞浸潤及炎癥介質的釋放從而緩解損傷的。而且NF-κB通路是由HSP60蛋白的釋放激活的，而EPI也能抑制其從線粒體釋放至循環(huán)中。因此目前認為EPI可以通過抑制氧化應激和炎癥通路的激活從而起到保護作用[141]。目前對EPI的作用機制探究的更清楚，因此EPI可能比CAT更有臨床應用前景。另外兒茶素其余異構體是否同樣對HSOS具有類似的保護作用也是值得研究的方向。
3.2.2 索拉菲尼和瑞格拉菲尼
索拉菲尼（Sorafenib）和瑞格拉菲尼（Regorafenib）為臨床僅有的由美國FDA批準的肝細胞肝癌靶向藥物[177]。二者均為口服多重激酶抑制劑，且都能作用于血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）和 血 小板源性生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor， PDGFR），具有良好的抗血管生成和抗腫瘤作用[177，178]。目前在動物模型中發(fā)現(xiàn)這兩者均能抑制HSOS的發(fā)展[179，180]。
在MCT誘導的HSOS動物模型中，預防性索拉菲尼給藥能減輕肝組織病變和肝功能損害[179]。雖然索拉菲尼不能改善LSEC早期細胞骨架解聚引起的形態(tài)改變，但能維持LSEC和Disse間隙的附著并延緩LSEC的脫落，從而緩解晚期竇道的阻塞。通過免疫組織化學也能確定索拉菲尼能減輕MCT對LSEC的損傷，而且肝臟MMP-9的活性受到抑制；索拉菲尼可能是通過抑制VEGF/JNK/MMP-9通路減輕HSOS；另外索拉菲尼可以提高肝切除生存率，因此索拉菲尼可能更適合那些需要圍手術期化療和準備肝癌肝切除的病人，例如：結直腸癌肝轉移（colorectal liver metastasis， CRLM）并需要奧沙利鉑化療具有罹患HSOS高風險的患者[179]，但由于二期臨床研究發(fā)現(xiàn)：索拉菲尼與奧沙利鉑聯(lián)用并不能明顯提升轉移性結直腸癌患者的無進展生存時間和生存率，因此索拉菲尼應用受限[181]。在動物模型中，瑞格拉菲尼具有減輕肝臟病理損傷、減輕LSEC損傷、減輕肝切除后HSOS加劇的病理損傷和提升肝切除存活率等作用，但作用機制可能是抑制胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）/MMP-9相關信號通路的激活[180]。瑞格拉菲尼作為新藥，比索拉菲尼具有更強的抑制血管生成、細胞增殖、促進凋亡和抗腫瘤的作用[177]。臨床研究表明，與標準療法瑞格拉菲尼相比，能顯著改善轉移性結直腸癌患者的生存率和疾病無惡化期[182]。因此瑞格拉菲尼可能對CRLM相關化療患者更有應用前景。
3.2.3 磷酸二酯酶III抑制劑
奧普力農（Olprinone， OLP）和西洛他唑（Cilostazol， CZ）是兩種特異性的磷酸二酯酶抑制劑，據(jù)報道有抑制HSOS的作用[140，183]。動物模型中，OLP預防給藥可以通過誘導HO-1表達、激活Akt通路，從而促進LSEC的保護作用而抑制HSOS的發(fā)展，實驗中表現(xiàn)為RECA-1蛋白表達維持在一定水平以及抑制HSOS特征性病理改變和血清肝酶的上升。而且OLP可提升肝切除后個體的存活率，可能也是治療CRLM的潛在藥物[183]。Takashi等人認為血小板在血管腔外的Disse間隙中聚集是介導HSOS損傷的重要因素，因此研究了具有內皮保護作用和抗血小板聚集功能的磷酸二酯酶抑制劑CZ對HSOS的效果。實驗結果表明：CZ預給藥有效減輕組織病理改變，減少EPA形成，同時可能抑制內皮細胞的損傷和血小板激活而導致其標志物PAI-1的表達下調，起到有效預防HSOS的作用[140]。但目前為止這兩種藥物均無相關HSOS臨床實驗數(shù)據(jù)，且與多種誘導該病的化療藥物之間的相互作用仍不清楚，尚待進一步研究。
3.2.4 重組人血栓調節(jié)蛋白 (rTM)
重組人血栓調節(jié)蛋白(recombinant human throm- bomodulin， rTM) 是一種臨床全新的治療彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）的藥物，可通過結合凝血酶阻止凝血。由于DIC病理機制與HSOS較為類似，因此有了將rTM用于治療HSOS的嘗試[184]。大鼠模型中，rTM預防給藥可能通過減少循環(huán)中的高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein 1， HMGB1）從而抑制相關通路的激活，減輕HSOS癥狀和組織損傷，保護LSEC，抑制中性粒細胞的累積和氧化應激。而且rTM也能減輕肝切除手術誘導的HSOS惡化，提高術后生存率，也有CRLM應用前景[185]。而在小鼠模型中，利用流式細胞術發(fā)現(xiàn)rTM能下調MCT處理后的LSEC細胞損傷相關基因以及維持編碼eNOS的基因表達從而保護LSEC[186]。而且同一課題組的另一篇文章發(fā)現(xiàn)rTM能上調肝組織eNOS的表達，下調PAI-1水平。rTM預給藥通過抑制EPA和抑制LSEC的脫落和破壞從而對抗HSOS的發(fā)展[187]。在體外實驗中rTM也被證明具有對內皮細胞的保護作用，這種作用可能是通過血栓調節(jié)蛋白第五表皮生長因子樣結構域的C環(huán)（C Loop of fifth epidermal growth factor-like domain of thrombomodulin， TME5C）作用于細胞表面G蛋白偶聯(lián)受體15 (G protein-coupled receptor 15， GPR15)介導的[186，188]。此外，一項 41例使用rTM治療HSOS的臨床樣本與DF治療效果比較的臨床實驗證明rTM的治療效果與DF相近[184]。這讓rTM成為繼DF后最有希望成為治療HSOS的常規(guī)臨床藥物。
3.2.5 甘草素和甘草苷
甘草素和甘草苷是傳統(tǒng)中草藥甘草的兩種主要活性成分，研究表明甘草素能通過恢復肝臟GSH含量抵御藥物誘導的肝損傷，并且甘草素和甘草苷可以減輕環(huán)磷酰胺誘導的小鼠LSECs損傷和炎癥損傷[189，190]。目前的動物研究表明：甘草素和甘草苷可以通過減少HSP60下調其下游的TLR4 / NFκB炎癥通路，以及通過作用于Nrf2和keap1蛋白結合位點促進其解離誘導Nrf2核轉位激活上調Nrf2下游抗氧化應激通路。在這兩條通路的共同作用下減輕肝臟炎癥損傷和氧化應激損傷從而削弱HSOS病情[143，147]。由于甘草素和甘草苷具有較高的安全性，因此非常有潛力用于臨床HSOS治療，但仍缺乏臨床研究數(shù)據(jù)。
3.2.6 其他藥物
其他對HSOS有保護作用的藥物作用機制研究大多與抗氧化應激、抗炎癥損傷、保護LSEC、下調MMP-9等作用有關[126，142，145，191-196]。當然也有一些其他通路的參與，如凝血-纖溶相關通路、PI3K和MAPKs 等[142，145]（具體藥物及其作用機制見表2）。也有關于血液成分療效的研究，如人臍帶源性內皮集落形成細胞（human umbilical cord-derived endothelial colony forming cells， hUC-ECFCs）可以在趨化因子的驅動下遷移至損傷部位增殖分化為功能內皮細胞修復組織損傷從而減輕HSOS[197]。還有實驗證明血小板對HSOS有防治作用，給予TPO或TPO激動劑能增加肝內血小板數(shù)量，能保護LSEC、下調MMP-9表達從而減輕肝臟損傷，這可能是因為充足數(shù)量的血小板會封住HSOS產生的內皮縫隙，阻止血液成分進一步進入Disse間隙介導的損傷[198]。與此前EPA參與介導了HSOS損傷的理論一致[133，139]。GSH和MMP抑制劑對HSOS的保護作用雖然很早就被發(fā)現(xiàn)，但始終沒有在臨床得到很好的驗證[126，195]。
表2 預防和治療HSOS臨床前研究的藥物Tab.2 Drugs of preclinical research for prevention and treatment of HSOS
4 總結與展望
本文綜述了LSEC的功能及在HSOS發(fā)病機制中的作用，總結了近年來發(fā)現(xiàn)的有希望防治HSOS的相關方法。由于FDA唯一批準的臨床藥物DF價格昂貴和不易獲得，難以大范圍應用于臨床，因此迫切需要尋找治療HSOS的臨床新藥。闡明HSOS的發(fā)病機制有利于制定治療策略和開展新藥研究。迄今發(fā)現(xiàn)的藥物雖然大部分尚未開展臨床應用研究，但在HSOS動物模型中取得了良好的治療效果。這些藥物對HSOS的保護作用多與抗氧化應激、抗炎、內皮保護以及抑制MMP等機制有關，以LSEC為靶點、有針對性地研發(fā)HSOS防治新藥仍是今后的方向。
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